董劼 劉秀菊 李菲菲 李浩然 張志清

米卡芬凈是侵襲性真菌病治療最常見的抗真菌藥物[1]，血漿蛋白結(jié)合率達到99.8%，且與其他蛋白結(jié)合率高的藥物相互作用研究不足，以致臨床用藥存在較大風險。米卡芬凈本身存在“矛盾現(xiàn)象”[2]，即指米卡芬凈低濃度時真菌表達敏感，但隨著藥物濃度的增加，真菌對其敏感性卻降低，甚至產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象[3]。侵襲性真菌感染好發(fā)于免疫受損者，如血液惡性腫瘤接受化療者等[4]且大多伴有基礎(chǔ)疾病，患者用藥品種多、作用復雜[5]。有數(shù)據(jù)顯示，94.7%的住院患者在三甲醫(yī)院中應(yīng)用抗真菌藥物之前都應(yīng)用抗菌藥物，以使用2～3種抗菌藥物的情況最多，所用藥物幾乎涵蓋所有類別的抗菌藥物，包括使用例數(shù)較多的碳青霉烯類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類[6]。而厄他培南作為碳青霉烯類廣譜抗生素，克服之前此類藥物對脫氫肽水解酶(DHP-1)不穩(wěn)定的缺陷，且由于廣泛的蛋白結(jié)合(85%～95%)作用而具有更長的半衰期，可以單次給藥[7,8]。當米卡芬凈與厄他培南聯(lián)合用于侵襲性真菌感染患者時，由于二者蛋白結(jié)合率都很高，就有可能會造成其中一種蛋白結(jié)合能力弱的藥物的游離濃度升高，從而增大不良反應(yīng)發(fā)生的風險，甚至降低療效。截至目前，已經(jīng)有一些米卡芬凈鈉與其他藥物之間相互作用的臨床研究，包括霉酚酸酯、環(huán)孢素A[9]、他克莫司、潑尼松龍、西羅莫司、硝苯地平、氟康唑[10]、利托那韋和利福平[11]。其中應(yīng)留意聯(lián)合用藥的不良反應(yīng)，在必要時可減少西羅莫司或硝苯地平的給藥劑量[12]。作為臨床廣泛應(yīng)用于侵襲性真菌病治療的藥物，米卡芬凈與厄他培南聯(lián)用情況空缺。藥物相互作用信息不完整，在一定程度上限制了此兩種藥物的聯(lián)合應(yīng)用。本研究擬建立簡便、快捷的高效液相色譜(HPLC)方法，用于測定大鼠血漿中米卡芬凈的濃度，考察厄他培南對米卡芬凈在大鼠體內(nèi)藥代動力學的影響，為臨床聯(lián)合用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只健康雄性SD大鼠，清潔級，體重(220±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證：SCXK(京)2012-0001，動物合格證編號：11400700144070，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周，期間讓其自由飲水飲食。

1.2 儀器與試劑 Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)，包括2489紫外檢測器，Empower工作軟件；Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；超聲波清洗器(KQ-300B，昆山超聲儀器有限公司)；數(shù)控恒溫水浴氮吹儀(KL512J，北京康林科技有限公司)；高速冷凍醫(yī)用離心機(R18型，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；高速離心機(ABBOTT，德國)；渦旋混合器(XW-80A，上海醫(yī)科大學儀器廠)；低溫冰箱(MDF-U2086S，日本SANYO)；旋片式真空泵(FY-2C，浙江飛越機電有限公司)；電子分析天平(CPA225D，德國Sartorius)；臺式酸度計(HANNA-pH 213，羅馬尼亞)。米卡芬凈原料藥(河北三韻生物科技有限公司，含量99.5%，批號SL20160123)；艾瑞昔布對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度99.9%，批號161104)；注射用米卡芬凈鈉(安斯泰來制藥有限公司，規(guī)格50 mg，批號023590)；厄他培南原料藥(石藥集團中諾藥業(yè)有限公司，含量97.0%，批號181512009)；乙腈(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，批號130701)；醋酸銨(分析純，北京市紅星化工廠，批號970225-1)；冰乙酸(分析純，天津市永大化學試劑有限公司，批號GB/T 676-2007)；高純氮氣(含量99.9%，石家莊京聯(lián)實用氣體有限公司，批號20160307)；蒸餾水(深圳屈臣氏有限公司)。

1.3 米卡芬凈測定方法學的建立

1.3.1 檢測條件:色譜條件色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.01 mol/L醋酸銨緩沖鹽(冰醋酸調(diào)節(jié)pH值4.5)(42.5:57.5，V/V)；流速：1.0 ml/min；檢測波長：269 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μl；內(nèi)標：艾瑞昔布。

1.3.2 溶液配制:①米卡芬凈對照品溶液：精密稱量米卡芬凈對照品適量，用蒸餾水溶解，得濃度為4 mg/ml 的米卡芬凈儲備液，4℃保存待用。取米卡芬凈儲備液適量，精密量取，置量瓶中，蒸餾水定容，得濃度依次為10、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 mg/L的系列對照品溶液。②內(nèi)標溶液：精密稱量艾瑞昔布對照品適量，蒸餾水溶解，得濃度為400 mg/L的內(nèi)標儲備液；精密量取艾瑞昔布貯備液適量，用蒸餾水稀釋成200 mg/L的內(nèi)標溶液，4℃保存待用。

1.3.3 血漿樣品處理:取血漿樣品100 μl，置1.5 ml離心管中，加內(nèi)標溶液10 μl，加乙腈400 μl沉淀蛋白，渦旋混合1 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液10 μl進樣測定。

1.3.4 專屬性:取米卡芬凈對照品溶液、內(nèi)標溶液分別進樣，記錄色譜圖；分別取空白血漿、血漿樣品各100 μl，按“1.2.3”項下處理方法處理(其中空白血漿不加內(nèi)標)進樣并測定。

1.3.5 最低檢測限和最低定量限:配制一定濃度的模擬血漿樣品100 μl，按“1.2.3”項下方法處理并測定。以倍比稀釋法配制并依次進樣測定。

1.3.6 標準曲線的繪制:吸取米卡芬凈系列標準溶液10 μl于1.5 ml離心管中，氮氣吹干，分別加入空白血漿100 μl，配制成濃度為1、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/L的模擬血漿樣品。按“1.2.3”項下方法處理，進樣測定，記錄米卡芬凈和艾瑞昔布峰面積。以峰面積比為縱坐標，米卡芬凈血漿濃度為橫坐標，繪制標準曲線，回歸標準曲線方程。

1.3.7 準確度試驗

1.3.7.1 絕對回收率：取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成米卡芬凈濃度為低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)三種濃度的模擬血漿樣品，按“1.2.3”項下方法處理并分析，記錄米卡芬凈和艾瑞昔布峰面積；另取等量的米卡芬凈對照品溶液和艾瑞昔布對照品溶液分別進樣測定，記錄峰面積；模擬血漿樣品中米卡芬凈峰面積與進樣等量對照品溶液所得峰面積的比值，即為米卡芬凈的絕對回收率；模擬血漿樣品中艾瑞昔布峰面積與等量對照品溶液進樣所得峰面積的比值，即為內(nèi)標絕對回收率。

1.3.7.2 相對回收率：取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成米卡芬凈濃度為低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)三種濃度的模擬血漿樣品，按“1.2.3”項下方法處理并分析，根據(jù)標準曲線方程計算米卡芬凈濃度，該濃度與理論濃度的比值即為相對回收率。

1.3.8 精密度試驗:取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備成米卡芬凈濃度為低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)的模擬血漿樣品，于1 d內(nèi)處理并測定，計算RSD，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d制備、處理并測定，計算RSD，考察日間精密度。

1.3.9 穩(wěn)定性試驗

1.3.9.1 反復凍融穩(wěn)定性：取空白血漿6份，制備成米卡芬凈濃度為25 mg/L的模擬血漿樣品，分為2組，每組3份。一組即刻處理后測定，一組反復凍融3次后處理后測定，考察米卡芬凈血漿樣品反復凍融穩(wěn)定性。

1.3.9.2 低溫保存穩(wěn)定性：取空白血漿6份，制備成米卡芬凈濃度為25 mg/L的模擬血漿樣品，分為2組，每組3份。一組即刻處理后測定，一組于-40℃保存14 d后處理并測定，考察米卡芬凈血漿樣品低溫保存穩(wěn)定性。

1.3.9.3 處理血漿樣品放置穩(wěn)定性：取空白血漿3份，制備成米卡芬凈濃度為25 mg/L的模擬血漿樣品，按“1.2.3”項下方法處理后4℃放置0、4、24 h后進樣測定，考察米卡芬凈血漿樣品處理后放置穩(wěn)定性。

1.4 藥動學研究

1.4.1 給藥方案與血漿樣品處理:米卡芬凈注射液的配制：取注射用米卡芬凈鈉1支(標示量50 mg)，用0.9%氯化鈉溶液10 ml溶解，配成5 g/L的米卡芬凈溶液，每次新鮮配制。

1.4.2 厄他培南注射液的配制：取厄他培南原料藥粉末約360 mg，溶于12 ml 0.9%氯化鈉溶液中，得到濃度約為30 g/L的厄他培南溶液，每次新鮮配制。

1.4.3 給藥方案:取SD雄性大鼠40只，隨機分為對照組和試驗組，每組20只。試驗組依次尾靜脈注射厄他培南溶液(相當于100 mg/kg厄他培南)和米卡芬凈注射液(相當于15 mg/kg米卡芬凈)；對照組依次尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液和米卡芬凈溶液(相當于15 mg/kg米卡芬凈)。分別于給藥后2、10、20、30 min和1、2、4、6、12、24 h于眼內(nèi)眥取血0.5 ml，置于肝素鈉抗凝離心管中，10 000 r/min離心5 min，取上層血漿，-40℃冰箱保存待測。

1.4.4 血漿米卡芬凈濃度測定:待測血漿室溫解凍，按照“1.2.3”項下血漿樣品處理方法處理并測定，根據(jù)標準曲線方程計算血漿米卡芬凈濃度。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用DAS2.1.1軟件對每只大鼠血漿中米卡芬凈濃度-時間數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計矩擬合，權(quán)重為1/cc，并計算米卡芬凈主要藥動學參數(shù)。應(yīng)用SPSS 13.1統(tǒng)計學軟件依次將試驗組與對照組大鼠間主要藥動學參數(shù)進行統(tǒng)計學分析，若進行比較的2組均服從正態(tài)分布，則采用兩個獨立樣本的t檢驗；若其中有一組不服從正態(tài)分布，則選用非參數(shù)檢驗進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學驗證

2.1.1 專屬性、最低檢測限和最低定量限:內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾米卡芬凈和內(nèi)標的測定。以S/N≥10時的血漿藥物濃度作為最低定量限，以S/N≥3時的血漿藥物濃度作為最低檢測限。見圖1。

圖1 HPLC圖

2.1.2 標準曲線和線性范圍:計算得到標準曲線方程為Y=0.0443 X-0.0025，r2=0.9994(n=9)，表明米卡芬凈在1.0～200 mg/L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。見圖2。

2.1.3 準確度：①絕對回收率：低、中、高三種濃度米卡芬凈模擬血漿樣品的絕對回收率依次為99.10%，90.10%和95.00%，RSD值依次為4.0%，4.9%和3.7%；內(nèi)標絕對回收率為97.70%，RSD值為4.3%。②相對回收率：低、中、高三種濃度米卡芬凈模擬血漿樣品的相對回收率依次為101.7%，108.4%和103.8%，RSD值依次為6.0%，6.7%和7.7%。見表1、2。

2.1.4 精密度:低、中、高三種濃度米卡芬凈模擬血漿樣品的日內(nèi)精密度的RSD值依次為6.3%，7.9%和7.7%；日間精密度RSD值依次為8.4%，8.9%和8.6%。見表3、4。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗:米卡芬凈模擬血漿樣品即刻處理后測定和反復凍融3次后處理并測定，其RSD分別為3.1%和1.6%。且反復凍融3次后處理測得濃度為即刻處理后測得濃度的95.41%。米卡芬凈模擬血漿樣品即刻處理和-40℃保存14 d后處理，其RSD分別

圖2 大鼠血漿中米卡芬凈標準曲線

表1 大鼠血漿中米卡芬凈的絕對回收率 n=5

表2 相對回收率實驗 n=5

表3 日內(nèi)精密度實驗 n=5

表4 日間精密度實驗 n=5

為4.0%和3.9%。保存14天后處理測得濃度為即刻處理測得濃度的95.62%。米卡芬凈模擬血漿樣品處理后即刻進樣測定與4℃放置0、4、24 h測定的RSD為7.5%。結(jié)果表明血漿樣品處理后4℃放置穩(wěn)定性良好，滿足實驗要求。見表5、6。

表5 反復凍融穩(wěn)定性 n=3

表6 -40℃保存14 d穩(wěn)定性實驗 n=3

2.2 藥動學結(jié)果 藥動學參數(shù)與對照組相比，除了Cmax(P<0.05)，試驗組AUC0-24h、AUC0-∞、t1/2、CL和V差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果表明，合用厄他培南前后大鼠體內(nèi)米卡芬凈的藥代動力學受到較小影響。見表7，圖3。

表7 日間精密度實驗

圖3 2組大鼠體內(nèi)米卡芬凈的平均藥時曲線

3 討論

本實驗采用艾瑞昔布作為內(nèi)標進行HPLC法測定大鼠血漿中米卡芬凈的濃度。在流動相選擇方面，從乙腈-水體系、甲醇-水體系、乙腈-醋酸鹽體系、甲醇-醋酸鹽體系中選擇，比較后發(fā)現(xiàn)乙腈-醋酸銨作為流動相時的被測物和內(nèi)標物分離度以及峰形良好，滿足實驗要求。

血漿樣品處理方法選取蛋白沉淀法。本實驗考察了甲醇和乙腈2種有機溶劑,結(jié)果乙腈的蛋白沉淀效果與甲醇相近,但使用甲醇時會產(chǎn)生溶劑化效應(yīng),導致色譜峰加寬。鑒于本研究流動相為乙腈-醋酸銨，因此采用乙腈為蛋白沉淀劑。綜上，此HPLC法專屬性強、精密度好、準確度高，可用于測定大鼠體內(nèi)米卡芬凈血藥濃度。

由于藥物在血液中存在多重平衡，例如，游離藥物與血漿蛋白結(jié)合藥物的平衡、游離藥物與組織藥物的平衡以及游離藥物和血細胞內(nèi)藥物的平衡等；厄他培南與米卡芬凈合用后，米卡芬凈血漿Cmax降低，但是其余參數(shù)幾乎不變，根據(jù)得到的藥動學參數(shù)和藥時曲線，由此可以認為厄他培南對米卡芬凈的藥動學基本無影響。

另據(jù)文獻報道，血液中可結(jié)合的白蛋白數(shù)量減少會導致血細胞內(nèi)米卡芬凈藥物濃度的增大[13]，即加速了米卡芬凈從血漿轉(zhuǎn)移至血細胞內(nèi)的過程?？赏茰y，由于厄他培南的血漿蛋白結(jié)合率很高，先于米卡芬凈占據(jù)了大部分白蛋白，因此造成了米卡芬凈進入血液后只有很少的白蛋白可以結(jié)合的情況，從而造成更多的游離米卡芬凈向血細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，而游離血藥濃度的升高也會加速藥物進入其他組織部位。Petraitis等[14]，也得到類似的實驗結(jié)果，米卡芬凈與拉夫康唑合用使得拉夫康唑Cmax上升而其余藥動學參數(shù)未改變，遺憾的是他們并未對此作出解釋或推測?？紤]到以上問題，有必要深入研究厄他培南對米卡芬凈相互之間蛋白結(jié)合力的強弱以及在人血漿中的情況，為米卡芬凈人體內(nèi)藥動學研究提供更多的理論依據(jù)進而為臨床用藥提供參考。

綜上所述，本次實驗所建立的HPLC法可準確快速測定大鼠血漿中的米卡芬凈藥物濃度。厄他培南與米卡芬凈合用后，由于米卡芬凈在血液中存在游離型與結(jié)合型的相互轉(zhuǎn)化以及血細胞內(nèi)外的藥物濃度變化使得厄他培南對米卡芬凈的藥動學影響很小。