呂昕， 唐文學(xué)， 郭亮

連續(xù)性腎臟替代治療對急性腎損傷患者自噬相關(guān)蛋白表達及預(yù)后的影響

呂昕， 唐文學(xué)△， 郭亮

（杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310000）

探討連續(xù)性腎臟替代治療（CRRT）對急性腎損傷（AKI）患者自噬相關(guān)蛋白表達及預(yù)后的影響。選取2015年2月~2018年3月于杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院被診斷為AKI并接受CRRT的患者共計174例。比較CRRT治療前后患者血漿白細(xì)胞介素1β （IL-1β）和白細(xì)胞介素6 （IL-6）蛋白水平及血單核細(xì)胞中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II （LC3-II）、自噬相關(guān)蛋白5 （Atg5）和beclin-1的mRNA表達水平，并進一步分析上述分子的表達水平與患者血清肌酐（SCr）的相關(guān)性。根據(jù)治療4周后的生存情況，將入選患者分為死亡組（=43）和生存組（=131），對兩組患者上述指標(biāo)的水平進行比較。CRRT后，患者外周血的IL-1β、IL-6和SCr水平均較治療前顯著下降（<0.05）， LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平顯著降低（<0.05）。死亡組患者LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平顯著高于生存組（<0.05）。IL-1β、IL-6、LC3-II和beclin-1的表達水平與SCr呈正相關(guān)（<0.05），然而Atg5的表達水平與SCr無顯著相關(guān)性（>0.05）。CRRT能夠降低AKI患者外周血自噬相關(guān)分子的mRNA表達水平，進而降低自噬水平，對AKI患者發(fā)揮保護性作用。自噬相關(guān)分子的mRNA可作為預(yù)測CRRT預(yù)后的重要指標(biāo)。

急性腎損傷；連續(xù)性腎臟替代治療；自噬；炎癥因子；預(yù)后

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是重癥監(jiān)護病房常見的疾病，連續(xù)性腎臟替代治療（continuous renal replacement therapy， CRRT）是目前臨床上治療AKI最常用且最為有效的治療手段之一［1］。細(xì)胞自噬能夠清除受損的細(xì)胞，但也能調(diào)控炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)，在AKI中發(fā)揮著重要的作用［2-3］。 CRRT能夠有效清除患者血液中的炎癥因子，但其對自噬活性的影響尚未被揭示，缺乏相關(guān)的實驗研究。本次研究旨在探討CRRT對AKI患者外周血自噬相關(guān)蛋白表達及預(yù)后的影響，進一步研究CRRT對AKI的保護機制。

材料和方法

1　一般資料

選取2015年2月~2018年3月在杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院被診斷為AKI并接受CRRT的患者共174例，引起AKI的原發(fā)病包括重癥急性胰腺炎（49例）、膿毒血癥（29例）、嚴(yán)重創(chuàng)傷及創(chuàng)傷術(shù)后（28例）、惡性腫瘤切除術(shù)后（20例）、骨科手術(shù)術(shù)后（9例）、心胸外科手術(shù)術(shù)后（24例）和腦出血術(shù)后（15例）。其中男性99例，女性75例，年齡26~75歲，平均（54.39±10.37）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）符合國際改善全球腎臟病預(yù)后組織（Kidney Disease Improving Global Outcomes， KDIGO）公布的AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；（3）無腎臟毒性藥物服用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）在本次診斷前已接受CRRT；（2）患者或其代理人不同意參與本實驗研究；（3）臨床資料不完整；（4）合并肝硬化、自身免疫性疾病、抑郁癥等疾病。所有患者均接受CRRT治療，具體采用連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過（continuous veno-venous hemofiltration， CVVH）模式。預(yù)沖液為0.9％氯化鈉3 000 mL加入普通肝素100 mg，預(yù)沖時間30 min。血流速度控制在100～200 mL/min，治療劑量不低于35 mL·kg-1·h-1。治療4周內(nèi)死亡（均因多臟器功能衰竭死亡）的患者共計43例，納入死亡組，其余131例患者納入生存組。死亡組中，男性27例，女性16例，平均年齡（55.04±9.48）歲，平均身高為（168.5±11.4） cm，平均體重為（63.4±6.4） kg，體重指數(shù)（body mass index， BMI）為（25.6±3.4） kg/m2， APACHE II評分為12.6±3.8， SOFA評分為6.8±2.1；生存組中，男性72例，女性59例，平均年齡（54.03±9.74）歲，平均身高為（169.4±9.7） cm，平均體重為（61.2±5.3） kg， BMI為（23.4±2.7） kg/m2， APACHE Ⅱ評分為12.1±1.8， SOFA評分為6.2±1.6。兩組患者的性別、年齡、身高、體重、BMI、APACHE Ⅱ評分和SOFA評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。本次研究經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

2　方法

2.1外周血白細(xì)胞介素1β （interleukin-1β， IL-1β）和白細(xì)胞介素6 （interleukin-6，IL-6）水平的檢測在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血3 mL，置于抗凝管內(nèi)，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）檢測血漿中IL-1β和IL-6的水平，其中IL-1β由Abcam提供的人IL-1β ELISA試劑盒（貨號ab46052）進行檢測， IL-6由Thermo Fisher Scientific提供的人IL-6 ELISA試劑盒（貨號：EH2IL6）進行檢測。

2.2血清肌酐（serum creatinine， SCr）水平的檢測在第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血3 mL， 3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，采用由貝克曼庫爾特公司提供的AU680全自動生化分析儀，檢測患者SCr的含量。

2.3自噬相關(guān)蛋白mRNA表達水平的檢測第1次CRRT前和多次CRRT后立即抽取患者空腹靜脈血5 mL，置入肝素抗凝管內(nèi)，加入等量的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（北京同立海源生物科技有限公司），于室溫500×離心20 min，吸取最上層血漿，收集血漿層與淋巴細(xì)胞分離液交界面的單核細(xì)胞。加入1倍體積的含有5×103U/L肝素、2%滅活小牛血清的Hanks液， 200×離心10 min，吸取上清液，重復(fù)洗滌2次，用1%臺盼藍檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞活力應(yīng)>95%，進行細(xì)胞計數(shù)后，將單核細(xì)胞儲存于-80℃。在冷凍的單核細(xì)胞中加入Trizol溶液（Thermo Fisher Scientific），嚴(yán)格按照Trizol溶液的說明書提取單核細(xì)胞中的RNA，采用NanoDrop 2000分光光度計檢測所提取RNA的質(zhì)量。吸取1 μg合格的RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix （TaKaRa）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix （Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System （Thermo Fisher Scientific）上進行RT-qPCR，檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-II （microtubule-associated protein 1 light chain 3-II， LC3-II）、自噬相關(guān)蛋白5 （autophagy-related protein 5， Atg5）和beclin-1的mRNA表達量。PCR條件為： 94℃ 1 min； 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 40個循環(huán)。所有實驗孔重復(fù)4次，以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2.4觀察指標(biāo)比較第1次CRRT前和多次CRRT后AKI患者血漿IL-1β和IL-6蛋白水平，以及血單核細(xì)胞中LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平，并進一步分析上述分子水平與SCr含量的關(guān)系。同時對CRRT治療28 d后的生存組和死亡組患者上述基因的表達水平進行比較

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 for Mac軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。計量資料經(jīng)正態(tài)分布檢驗后采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示，組間采用獨立樣本檢驗進行比較，CRRT前后比較采用配對樣本檢驗；計數(shù)資料采用頻數(shù)（率）的形式表示，組間采用卡方檢驗進行比較；指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson’s相關(guān)性分析進行研究。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平的比較

CRRT后，所有患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平均比治療前顯著下降（<0.05），見表2。

2　CRRT前后AKI患者單核細(xì)胞中自噬相關(guān)分子mRNA水平的比較

CRRT后AKI患者單核細(xì)胞中IL3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平均比治療前顯著降低（<0.01），見表2。

表2　CRRT前后AKI患者外周血IL-1β、IL-6和SCr水平及單核細(xì)胞中自噬相關(guān)分子mRNA水平的比較

**<0.01before CRRT.

3　CRRT后生存組和死亡組患者自噬相關(guān)分子mRNA水平的比較

死亡組患者治療后LC3-II、Atg5和beclin-1的mRNA表達水平均顯著高于生存組（<0.05），見表3。

表3　生存組和死亡組患者CRRT后自噬相關(guān)分子mRNA表達水平的比較

**<0.01survival group.

4　IL-1β、IL-6和自噬相關(guān)分子表達水平與SCr含量的相關(guān)性分析

AKI患者IL-1β （=0.79，=0.032）、IL-6 （=0.66，=0.003）、LC3-II （=0.54，=0.019）和beclin-1 （=0.63，=0.042）水平與SCr含量均呈正相關(guān)，而Atg5表達水平與SCr含量無顯著相關(guān)性（=0.64，=0.328）。

討論

AKI是指突發(fā)且持續(xù)的腎功能下降，臨床表現(xiàn)為氮質(zhì)血癥、水電解質(zhì)紊亂、少尿等。AKI的病因可分為腎前性、腎性和腎后性，其中腎前性AKI是臨床最為常見的類型，主要是由于全身循環(huán)血量減少導(dǎo)致的腎灌注不足，造成腎功能的損害。臨床上對于AKI的治療包括去除病因、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、營養(yǎng)支持、處理并發(fā)癥及給予腎臟替代治療（renal replacement therapy， RRT）。CRRT是危重患者最常用的血液凈化技術(shù)，其主要原理是通過模仿腎小球的濾過，運用對流、彌散和對流的原理，清除溶質(zhì)。與間斷血液透析相比， CRRT具有能夠穩(wěn)定血液動力學(xué)、較高的溶質(zhì)清除率、清楚炎性介質(zhì)等優(yōu)點［5-6］。既往的研究顯示，接受CRRT的危重患者的死亡率約為50%左右，而AKI患者接受CRRT的預(yù)后受到啟動時間、治療前血中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin， NGAL）水平、APACHE II評分、炎癥因子水平等的影響［7-9］。

自噬是細(xì)胞代謝和更新的必要過程，也是幫助細(xì)胞在嚴(yán)酷環(huán)境下存活的重要生理過程，同時自噬也是細(xì)胞凋亡的重要途徑。既往的研究發(fā)現(xiàn)，自噬體在維持腎臟功能、保護腎小管上皮細(xì)胞不受損傷等環(huán)節(jié)起到重要的作用［10-11］，但對于接受CRRT的AKI患者體內(nèi)自噬相關(guān)分子表達及意義的研究極為欠缺。自噬是一種參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器和大分子物質(zhì)降解的生理行為，且可通過雙層膜結(jié)構(gòu)包裹待被降解的物質(zhì)形成自噬體，且將其轉(zhuǎn)運至自噬溶酶體發(fā)生降解作用。LC3-II是一種非常重要的自噬相關(guān)蛋白，往往代表自噬體的出現(xiàn)。LC3-II的累積能夠激活巨噬細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)，釋放大量IL-1β、IL-6等炎癥因子，從而導(dǎo)致機體炎癥反應(yīng)加劇，組織損傷加重［12-13］。我們的研究結(jié)果顯示，CRRT能夠有效減少患者體內(nèi)IL-1β、IL-6等炎癥因子的聚集，同時亦能減少患者體內(nèi)LC3-II的表達，提示CRRT能夠有效抑制AKI患者的炎癥反應(yīng)和自噬，從而減少對腎臟的傷害。此外， beclin-1是另一種常見的具有自噬活性的分子，它作為PI3K復(fù)合體中的一部分，參與自噬體的形成，還能調(diào)節(jié)Atg蛋白的形成，從而促進細(xì)胞自噬［14-15］。相關(guān)文獻報道，大鼠發(fā)生AKI后，自噬相關(guān)蛋白beclin-1表達明顯上調(diào)，且隨著缺血時間的延長， beclin-1的表達水平逐漸升高［16］。我們的研究結(jié)果顯示， CRRT亦能夠有效降低beclin-1和Atg5的水平，提示CRRT能夠抑制自噬。通過比較不同預(yù)后的患者治療后自噬相關(guān)蛋白的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)存活組患者體內(nèi)LC3-II、beclin-1和Atg5表達水平都顯著低于死亡組，即CRRT后死亡患者體內(nèi)的自噬情況無明顯改變，說明在AKI患者中，自噬相關(guān)蛋白表達水平與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，較低的自噬水平可以預(yù)測患者治療后較好的預(yù)后。LC3-II和beclin-1作為自噬體膜的標(biāo)志蛋白，與細(xì)胞間的自噬和凋亡均有一定相關(guān)性，細(xì)胞的自噬和凋亡均可被應(yīng)激反應(yīng)所激活，兩者甚至可相互轉(zhuǎn)換。相關(guān)文獻報道，膿毒血癥大鼠的自噬體膜蛋白LC3-II和beclin-1表達水平明顯升高，并誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且自噬蛋白的表達水平與體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)成正比［17］。本研究中，死亡AKI患者LC3-II和beclin-1的表達水平明顯高于存活患者，分析其原因可能是患者中高表達的LC3-II和beclin-1可提高細(xì)胞凋亡水平，不利于腎臟修復(fù)，最終導(dǎo)致患者死亡。本課題組后續(xù)應(yīng)進一步驗證此機制。

綜上所述，CRRT能夠降低AKI患者外周血自噬相關(guān)蛋白的mRNA表達水平，降低自噬水平，對AKI患者發(fā)揮保護性作用。自噬相關(guān)蛋白的mRNA表達水平可作為預(yù)測CRRT預(yù)后的重要指標(biāo)，這為臨床治療AKI提供了新理論和新思路。

［1］ Schetz M， Legrand M. CRRT and ECMO： dialysis catheter or connection to the ECMO circuit？［J］. Anaesth Crit Car Pain Med， 2018， 37（6）：519-520.

［2］ Jeon J， Kim DH， Baeg SI， et al. Association between diuretics and successful discontinuation of continuous renal replacement therapy in critically ill patients with acute kidney injury［J］. Crit Care， 2018， 22（1）：255.

［3］ Kaushal GP， Shah SV. Autophagy in acute kidney injury［J］. Kidney Int， 2016， 89（4）：779-791.

［4］ Kellum JA， Lameire N， KDIGO AKI Guideline Work Group. Diagnosis， evaluation， and management of acute kidney injury： a KDIGO summary （Part 1）［J］. Crit Care， 2013， 17（1）：204.

［5］ Kee YK， Kim D， Kim SJ， et al. Factors associated with early mortality in critically ill patients following the initiation of continuous renal replacement therapy［J］. J Clin Med， 2018， 7（10）：334.

［6］ Wang AY， Bellomo R. Renal replacement therapy in the ICU： intermittent hemodialysis sustained low-efficiency dialysis or continuous renal replacement therapy？［J］. Curr Opin Crit Care， 2018， 24（6）：437-442.

［7］ Brain M， Winson E， Roodenburg O， et al. Non anti-coagulant factors associated with filter life in continuous renal replacement therapy （CRRT）： a systematic review and meta-analysis［J］. BMC Nephrol， 2017， 18（1）：69.

［8］ Katayama S， Uchino S， Uji M， et al. Factors predicting successful discontinuation of continuous renal replacement therapy［J］. Anaesth Intensive Care， 2016， 44（4）：453-457.

［9］ Wu HB， Ma WG， Zhao HL， et al. Risk factors of continuous renal replacement therapy after surgical repair of type A aortic dissection［J］. J Thorac Dis， 2017， 9（4）：1126-1132.

［10］ Wu Y， Wang L， Meng L， et al. Biological effects of autophagy in mice with sepsis-induced acute kidney injury［J］. Exp Ther Med， 2019， 17（1）：316-322

［11］ Shen Q， Zhang X， Li Q， et al. TLR2 protects cisplatin-induced acute kidney injury associated with autophagy via PI3K/Akt signaling pathway［J］. J Cell Biochem， 2019， 120（3）：4366-4374.

［12］ Chen YM， Chang CY， Chen HH， et al. Association between autophagy and inflammation in patients with rheumatoid arthritis receiving biologic therapy［J］. Arthritis Res Ther， 2018， 20（1）：268.

［13］ Song P， Wang Z， Zhang X， et al. The role of autophagy in asparaginase-induced immune suppression of macrophages［J］. Cell Death Dis， 2017， 8（3）：e2721.

［14］ 董杰，劉振華，韓麗萍. 精胺上調(diào)大鼠心肌缺血再灌注時beclin-1的表達［J］. 中國病理生理雜志， 2018， 34（3）：399-402.

Dong J， Liu ZH， Han LP. Spermidine upregates beclin-1 expression during myocardial ischemia/reperfusion in rats ［J］. Chin J Pathophysiol， 2018， 34（3）：399-402.

［15］ Wang S， Li J， Du Y， et al. The class I PI3K inhibitor S14161 induces autophagy in malignant blood cells by modulating the Beclin 1/Vps34 complex［J］. J Pharmacol Sci， 2017， 134（4）：197-202.

［16］ 郭秀全，張惠芳，呂海迪，等. 大鼠急性腎損傷后自噬相關(guān)蛋白Beclin-1的表達［J］. 醫(yī)學(xué)研究雜志， 2014， 43（2）：93-96.

Guo XQ， Zhang HF， LV HD， et al. Expression of autophagy-related protein Beclin-1 after acute kidney injury in rats ［J］. J Med Res， 2014， 43（2）：93-96.

［17］ 許武軍，謝娟娟，陳仙. H2S通過抑制TLR4/MyD88/PI3K信號通路減輕尿源性膿毒血癥誘導(dǎo)的急性腎損傷［J］. 中國病理生理雜志， 2019， 35（2）：243-247.

Xu WJ， Xie J， Chen X. H2S alleviates acute kidney injury induced by urogenic sepsis by inhibiting the TLR4/MyD88/PI3K signaling pathway［J］. Chin J Pathophysiol， 2019， 35（2）：243-247.

Effect of continuous renal replacement therapy on mRNA expression of autophagy-related molecules and prognosis in patients with acute kidney injury

Lü Xin， TANG Wen-xue， GUO Liang

（，，310000，）

To explore the effect of continuous renal replacement therapy （CRRT） on mRNA expression of autophagy-related molecules and the prognosis in the patients with acute kidney injury （AKI）.A total of 174 patients from our hospital who were diagnosed to have AKI and underwent CRRT between February 2015 and March 2018 were involved in this study. The plasma levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6 （IL-6）， the serum creatinine （SCr） level， and the mRNA expression levels of autophagy-related molecules， including microtubule-associated protein 1 light chain 3-II （LC3-II）， autophagy-related protein 5 （Atg5） and beclin-1， in the monocytes from peripheral blood were compared before and after CRRT. According to the survival of AKI patients after 4 weeks of CRRT， the enrolled patients were divided into death group （=43） and survival group （=131）， and the mRNA expression levels of the above molecules were compared between the 2 groups.After CRRT treatment， the plasma levels of IL-1β and IL-6， the level of SCr， and the mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in the monocytes were significantly lower than those before CRRT treatment （<0.05）. The mRNA expression levels of LC3-II， Atg5 and beclin-1 in death group were significantly higher than those in survival group （<0.05）. The positive correlation between SCr and IL-1β， IL-6， LC3-II or beclin-1 was observed （<0.05）， and no correlation between SCr and Atg5 was found （>0.05）.CRRT decreases the mRNA expression levels of autophagy-related molecules in the patients with AKI and reduces the autophagy activity， which is protective for the patients. These autophagy-related molecules may be applied as a potential markers to predict the prognosis of CRRT.

Acute kidney injury； Continuous renal replacement therapy； Autophagy； Inflammatory factors； Prognosis

R692； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.023

1000-4718（2020）11-2081-05

2020-07-06

2020-10-23

Tel: 18922750968； E-mail： xufengqing09@163.com

（責(zé)任編輯：余小慧，羅森）