伍軍， 李相友， 封寶紅， 李菊霜， 朱戈麗， 張艷霞， 畢智敏， 鞏雪敏

微小RNA-22-3p負(fù)性調(diào)控人腹膜間皮細(xì)胞NLRP3的表達(dá)及功能*

伍軍， 李相友△， 封寶紅， 李菊霜， 朱戈麗， 張艷霞， 畢智敏， 鞏雪敏

（武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院，武漢市第三醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430074）

探討微小RNA-22-3p （miR-22-3p）對人腹膜間皮細(xì)胞核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）表達(dá)及功能的影響。將基因的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）序列及其突變體克隆到雙螢光素酶報(bào)告基因載體psiCHECK2中，構(gòu)建野生型及突變型重組雙螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒，與miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染LPS預(yù)處理的人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5，檢測螢光素酶活性；HMrSV5細(xì)胞隨機(jī)分為以下6組： miR-22-3p NC+LPS組、miR-22-3p NC+LPS+ATP組、miR-22-3p mimic+LPS組、miR-22-3p mimic+LPS+ATP組、miR-22-3p inhibitor+LPS組和miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP組。RT-qPCR和Western blot檢測NLRP3 mRNA和蛋白的表達(dá)，ELISA檢測白細(xì)胞介素1β （IL-1β）的表達(dá)和caspase-1的活性，Western blot檢測caspase-1 p20蛋白的表達(dá)。NLRP3-3'-UTR野生型與miR-22-3p mimic共轉(zhuǎn)染HMrSV5細(xì)胞后，螢光素酶活性較對照組降低（<0.05）；NLRP3-3'-UTR野生型與miR-22-3p inhibitor共轉(zhuǎn)染HMrSV5細(xì)胞后，螢光素酶活性較對照組升高（<0.05）。與miR-22-3p NC+LPS組比較，miR-22-3p mimic+LPS組NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)、IL-1β和caspase-1 p20的水平均下降且caspase-1活性減弱（<0.05），而miR-22-3p inhibitor+LPS組NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)、IL-1β和caspase-1 p20的水平均上升且caspase-1的活性增強(qiáng)（<0.05）。與miR-22-3p NC+LPS+ATP組比較， miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP組NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)、IL-1β和caspase-1 p20的水平均上升且caspase-1的活性增強(qiáng)（<0.05）。miR-22-3p可負(fù)性調(diào)控人腹膜間皮細(xì)胞NLRP3的表達(dá)及功能。

微小RNA-22-3p；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；人腹膜間皮細(xì)胞；腹膜透析；終末期腎臟病

腹膜透析是終末期腎臟病（end-stage renal disease， ESRD）患者的重要腎臟替代治療方法，具備保護(hù)殘余腎功能、早期生存率優(yōu)勢等優(yōu)點(diǎn)［1-3］。腹膜間皮細(xì)胞是構(gòu)成腹膜的主要細(xì)胞群體之一，其位于腹膜巨噬細(xì)胞和間皮下微血管之間緊密連接的關(guān)鍵部位。然而，在長期高糖腹膜透析液作用下，腹膜間皮細(xì)胞可產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）、分泌炎癥因子，使細(xì)胞長期處于慢性炎癥狀態(tài)，從而啟動(dòng)新生血管形成及腹膜組織纖維化過程［4-5］，最終導(dǎo)致腹膜功能障礙，患者不得不退出腹膜透析。因此，及時(shí)減輕或緩解間皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)有助于延緩新生血管形成以及腹膜纖維化的到來。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 （nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）炎癥小體在機(jī)體炎癥和免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其可被多種類型的病原微生物或危險(xiǎn)信號(hào)所識(shí)別并激活，促進(jìn)胱天蛋白酶1 （caspase-1）活化，活化的caspase-1切割位于炎癥反應(yīng)上游的白細(xì)胞介素1β （interleukin-1β， IL-1β）和IL-18前體，產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子，從而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)［6］。我們既往的研究證實(shí)，高糖腹膜透析液作用于腹膜間皮細(xì)胞可提升細(xì)胞線粒體的ROS水平，而升高的ROS激活NLRP3-IL-1β，啟動(dòng)線粒體自噬清除受損線粒體，降低細(xì)胞ROS水平；應(yīng)用ROS抑制劑則可削弱NLRP3-IL-1β活化，從而減輕腹腔慢性炎癥反應(yīng)，提示負(fù)性調(diào)控NLRP3可作為干預(yù)腹膜透析腹腔慢性炎癥的靶點(diǎn)之一［7-8］。前期我們還應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測了微小RNA-22-3p （microRNA-22-3p， miR-22-3p）與NLRP3可能的靶向結(jié)合位點(diǎn)，并構(gòu)建NLRP3-3'-UTR野生型（wild-type， WT）及突變型（mutant， mut）雙螢光素酶報(bào)告基因載體， NLRP3-3'-UTR野生型與miR-22-3p mimic共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，螢光素酶活性降低，于是初步認(rèn)為miR-22-3p可負(fù)性調(diào)控基因及功能［9］。本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）致敏腹膜間皮細(xì)胞，探討miR-22-3p對三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化的影響及機(jī)制。

材料和方法

1　材料

人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection， ATCC）。

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Master Mix）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司； qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司； DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）購自天根生化科技（北京）有限公司；雙螢光素酶報(bào)告基因載體psiCHECK2（包含海腎螢光素酶基因和螢火蟲螢光素酶基因）、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega； miR-22-3p mimic、miR-22-3p inhibitor及陰性對照購自吉瑪基因；抗NLRP3抗體購自ABGENT；抗caspase-1 p20抗體購自Adipogen； IL-1β ELISA試劑盒購自聯(lián)科生物科技有限公司； caspase-1活性檢測試劑盒購自BioVision。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)取人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5第5~10代用于實(shí)驗(yàn)研究，參考我們前期的報(bào)道［7］，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以每孔5×105的細(xì)胞密度分別接種于6孔板， 37℃培養(yǎng)過夜；當(dāng)細(xì)胞匯合70%左右時(shí)開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前2 h換成無血清DMEM培養(yǎng)基，參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為miR-22-3p NC+psiCHECK2組、miR-22-3p NC+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組、miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組、miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組、miR-22-3p inhibitor+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組和miR-22-3p inhibitor+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組。每組設(shè)3個(gè)平行孔，重復(fù)3次。

2.2雙螢光素酶活性的檢測轉(zhuǎn)染后48 h吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液加入細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，（10 000~15 000）×離心3~5 min，取上清用于測定。按雙螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒提供實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算相對螢光素酶活性。

2.3RT-qPCR和Western blot檢測HMrSV5細(xì)胞NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)HMrSV5細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-22-3p NC、miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor，轉(zhuǎn)染后48 h吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液加入細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為miR-22-3p NC+LPS組、miR-22-3p NC+LPS+ATP組、miR-22-3p mimic+LPS組、miR-22-3p mimic+LPS+ATP組、miR-22-3p inhibitor+LPS組和miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP組，各組中LPS的濃度為1 mg/L，與細(xì)胞作用時(shí)間為4 h，而ATP濃度為5 mmol/L，于LPS加入前作用細(xì)胞30 min。收集細(xì)胞，應(yīng)用RT-qPCR和Western blot檢測NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)。RT-qPCR所用引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

2.4HMrSV5細(xì)胞IL-1β含量和caspase-1活性的檢測實(shí)驗(yàn)分組同2.3，收集細(xì)胞上清，分別按IL-1β ELISA試劑盒說明書和caspase-1活性檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.5Western blot檢測HMrSV5細(xì)胞caspase-1 p20蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組同2.3，收集細(xì)胞上清，用Western blot檢測細(xì)胞上清caspase-1 p20蛋白的表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)方法與本課題組之前的報(bào)道相同［5］。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用SNK-檢驗(yàn)，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　雙螢光素酶活性檢測

與miR-22-3p NC+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組相比， miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組螢光素酶活性顯著降低（<0.05），miR-22-3p mimic+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組螢光素酶活性無顯著變化， miR-22-3p inhibitor+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT組螢光素酶活性顯著升高（<0.05）， miR-22-3p inhibitor +psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-mut組螢光素酶活性無顯著性改變（>0.05），見圖1。上述結(jié)果提示， miR-22-3p可靶向調(diào)控HMrSV5細(xì)胞基因。

Figure 1.　The dual luciferase activity in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+psiCHECK2-NLRP3-3'-UTR-WT group.

2　HMrSV5細(xì)胞miR-22-3p表達(dá)的變化

HMrSV5細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-22-3p NC、miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor后，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示miR-22-3p mimic轉(zhuǎn)染組miR-22-3p的表達(dá)較對照組明顯升高（<0.05），miR-22-3p inhibitor轉(zhuǎn)染組miR-22-3p的表達(dá)較對照組明顯降低（<0.05），見圖2。

Figure 2.　The expression of miR-22-3p in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR+22-3p NC group.

3　miR-22-3p對HMrSV5細(xì)胞NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)LPS預(yù)處理的HMrSV5細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-22-3p NC、miR-22-3p mimic和miR-22-3p inhibitor后，檢測NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與miR-22-3p NC+LPS組比較， miR-22-3p mimic+LPS組NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)下降（<0.05），轉(zhuǎn)染miR-22-3p inhibitor組NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)升高（<0.05）； NLRP3激動(dòng)劑ATP可有效上調(diào)NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)，然而，相較于miR-22-3p NC+LPS+ATP組， miR-22-3p mimic+LPS+ATP組NLRP3 mRNA及蛋白水平仍顯著降低（<0.05），表明miR-22-3p可負(fù)性調(diào)控NLRP3的表達(dá)，見圖3。

Figure 3.　The effect of miR-22-3p transfection on expression of NLRP3 at mRNA (A) and protein (B) levels in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS group; #P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS+ATP group.

4　轉(zhuǎn)染miR-22-3p對HMrSV5細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響

HMrSV5細(xì)胞分組處理后ELISA檢測細(xì)胞上清IL-1β的含量。結(jié)果可見，與miR-22-3p NC+LPS組比較， miR-22-3p mimic+LPS組的IL-1β含量顯著降低（<0.05）， miR-22-3p inhibitor+LPS組的IL-1β含量顯著升高（<0.05）；此外， miR-22-3p mimic+LPS+ATP組IL-1β的含量較miR-22-3p NC+LPS+ATP組顯著減少（<0.05），見圖4。

Figure 4.　The effect of miR-22-3p transfection on expression of IL-1β in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS group; #P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS+ATP group.

5　轉(zhuǎn)染miR-22-3p 對細(xì)胞caspase-1活性的影響

HMrSV5細(xì)胞分組處理后，檢測細(xì)胞caspase-1活性。結(jié)果可見，與miR-22-3p NC+LPS組比較，miR-22-3p mimic+LPS組的caspase-1活性下降（<0.05），miR-22-3p inhibitor+LPS組的caspase-1活性升高（<0.05），此外，miR-22-3p mimic+LPS+ATP組caspas-1的活性較miR-22-3p NC+LPS+ATP組明顯降低（<0.05），見圖5。

Figure 5.　The effect of miR-22-3p transfection on the activity of caspase-1 in the HMrSV5 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS group; #P<0.05 vs miR-22-3p NC+LPS+ATP group.

6　轉(zhuǎn)染miR-22-3p 對HMrSV5細(xì)胞caspase-1 p20蛋白表達(dá)的影響

HMrSV5細(xì)胞分組處理后，檢測細(xì)胞caspase-1 p20的表達(dá)水平。結(jié)果可見，與miR-22-3p NC+LPS組比較，miR-22-3p mimic組的caspase-1 p20表達(dá)下降（<0.05），miR-22-3p inhibitor+LPS組的caspase-1 p20表達(dá)升高（<0.05）；此外，miR-22-3p mimic+LPS+ATP組caspas-1 p20的表達(dá)較miR-22-3p NC+LPS+ATP組明顯減少（<0.05），見圖6。

討論

臨床上長期應(yīng)用高糖腹膜透析液所致的腹腔慢性炎癥、腹膜纖維化是腹膜透析技術(shù)的瓶頸，是學(xué)者們一致重點(diǎn)關(guān)注的研究領(lǐng)域。NLRP3炎癥小體是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain， NOD）樣受體（NOD-like receptor， NLR）家族成員之一，其可廣泛識(shí)別細(xì)胞內(nèi)外的應(yīng)激和危險(xiǎn)信號(hào)， NLRP3持續(xù)激活可導(dǎo)致廣泛的組織損傷并參與許多急慢性炎癥性疾病的發(fā)生［10］。前期體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)：高糖腹膜透析液可通過ROS誘導(dǎo)NLRP3-IL-1β活化，啟動(dòng)線粒體自噬或者應(yīng)用ROS抑制劑均可削弱NLRP3-IL-1β的活化，從而減輕腹腔慢性炎癥，提示負(fù)性調(diào)控NLRP3可作為干預(yù)腹膜透析腹腔慢性炎癥的靶點(diǎn)之一［7-8］。

研究證實(shí)，miR-22通過有效結(jié)合靶基因、阻斷靶基因的表達(dá)在抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、抗腫瘤治療方面發(fā)揮重要作用［11-13］。那么， miR-22是否可以阻斷基因的表達(dá)及功能，發(fā)揮對抗炎癥的作用呢？

前期我們成功構(gòu)建NLRP3-3'-UTR野生型及突變型雙螢光素酶報(bào)告基因載體，在293T細(xì)胞中初步證實(shí)miR-22-3p可負(fù)性調(diào)控基因及功能［9］，在此基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)在腹膜間皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-22-3p模擬物可抑制NLRP3-3'-UTR野生型螢光素酶活性、miR-22-3p抑制物可提升NLRP3-3'-UTR野生型螢光素酶活性；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS預(yù)刺激的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22-3p模擬物可下調(diào)NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)、miR-22-3p抑制物可上調(diào)NLRP3的mRNA和蛋白表達(dá)，上述實(shí)驗(yàn)提示miR-22-3p可負(fù)性調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞基因的表達(dá)。那么，miR-22-3p是如何調(diào)控NLRP3功能的？為此我們進(jìn)一步驗(yàn)證了NLRP3下游IL-1β和caspase-1 p20蛋白的表達(dá)以及caspase-1的活性，腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-22-3p模擬物可下調(diào)IL-1β和caspase-1 p20蛋白表達(dá)并減弱caspase-1活性、miR-22-3p抑制物可上調(diào)IL-1β、caspase1 p20蛋白的表達(dá)并提升caspase-1活性，加用NLRP3的激動(dòng)劑ATP處理細(xì)胞并不影響miR-22-3p模擬物的作用，NLRP3的表達(dá)仍較miR-22-3p NC+LPS+ATP組降低。由此我們認(rèn)為，miR-22-3p可負(fù)性調(diào)控人腹膜間皮細(xì)胞NLRP3的表達(dá)及功能。新近的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中NLRP3表達(dá)異常升高，不僅啟動(dòng)胃粘膜上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)還促使上皮細(xì)胞異常增生和胃癌的發(fā)生；miR-22可直接結(jié)合NLRP3-3'-UTR，抑制后者的高表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)［14］。在口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌組織及細(xì)胞系中觀察到miR-22表達(dá)明顯低下，NLRP3的表達(dá)卻明顯升高；過表達(dá)miR-22可逆轉(zhuǎn)NLRP3激活所致的促腫瘤效應(yīng)［15］。除腫瘤領(lǐng)域外，研究者還發(fā)現(xiàn)，miR-22通過靶向抑制基因，減少冠心病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及下調(diào)促炎癥因子的表達(dá)，對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用［16］。本研究與上述研究的結(jié)果類似，但本研究未能在動(dòng)物模型中加之證實(shí)，這也是本研究的不足之處。下一步我們擬建立腹膜透析模型鼠，觀察miR-22-3p腹腔內(nèi)注射后對高糖腹膜透析液作用下NLRP3表達(dá)及功能的影響。

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MicroRNA-22-3p negatively regulates NLRP3 expression and function in human peritoneal mesothelial cells

WU Jun， LI Xiang-you， FENG Bao-hong， LI Ju-shuang， ZHU Ge-li， ZHANG Yan-xia， BI Zhi-min， GONG Xue-min

（，，，430074，）

To investigate the role of microRNA-22-3p （miR-22-3p）in regulating nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 （NLRP3）expression and function in human peritoneal mesothelial cells.The 3'-UTR sequence ofgene and its mutants were cloned into the dual luciferase reporter plasmid psiCHECK2 respectively to construct a wild-type and mutant recombinant dual luciferase reporter plasmid. An SV40-immortalized human peritoneal mesothelial cell line HMrSV5 pretreated with lipopolysaccharide （LPS） was generated and transfected with recombinant dual luciferase reporter plasmid and miR-22-3p mimic or miR-22-3p inhibitor respectively， then the luciferase activity was detected. In addition， the HMrSV5 cells were randomly divided into 6 groups： miR-22-3p NC+LPS， miR-22-3p NC+LPS+ATP， miR-22-3p mimic+LPS， miR-22-3p mimic+LPS+ATP， miR-22-3p inhibitor+LPS and miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP. RT-qPCR and Western blot were used to evaluate the expression of NLRP3. ELISA was used to measure the content of interleukin-1β （IL-1β） and the activity of caspase-1. The expression of caspase-1 p20 was determined by Western blot.Wild-type NLRP3 recombinant plasmid and miR-22-3p mimic co-transfection significantly decreased the luciferase activity compared with control group （<0.05）， while wild-type NLRP3 recombinant plasmid and miR-22-3p inhibitor co-transfection significantly increased the luciferase activity compared with control group （<0.05）. Compare with miR-22-3p NC+LPS group， the expression of NLRP3 at mRNA and protein levels， the content of IL-1β， the expression of caspase-1 p20 and the activity of caspase-1 were decreased in miR-22-3p mimic+LPS group （<0.05）， while the expression of NLRP3 at mRNA and protein levels， the content of IL-1β， the expression of caspase-1 p20 and the activity of caspase-1 were increased in miR-22-3p inhibitor+LPS group （<0.05）. Compare with miR-22-3p NC+LPS group， the expression of NLRP3 at mRNA and protein levels， the content of IL-1β， the expression of cspase-1 p20 and the activity of caspase-1 were increased in miR-22-3p inhibitor+LPS+ATP group （<0.05）.miR-22-3p negatively regulates NLRP3 expression and function in human peritoneal mesothelial cells.

MicroRNA-22-3p； Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3； Human peritoneal mesothelial cells； Peritoneal dialysis； End-stage renal disease

R692.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2020.11.021

1000-4718（2020）11-2068-06

2019-11-19

2020-04-09

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2016CFB590）；湖北省衛(wèi)健委科研項(xiàng)目（No.WJ2019Q001）；武漢市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)前沿項(xiàng)目（No.2019020701011434）；武漢市衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(No.WX16B09)

Tel： 027-68894905； E-mail： lixiangyou3@163.com

（責(zé)任編輯：林白霜，余小慧）