林 雯，徐國興

0引言

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類存在于骨髓間質(zhì)組織中的成體干細胞，來源廣泛、易培養(yǎng),可高效擴增,進行自體移植無倫理爭議及免疫排斥，是移植治療病變視網(wǎng)膜的種子細胞。近年來，干細胞治療視網(wǎng)膜病變的研究和試驗已獲得一定的進展，其中間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)最引人注目。MSCs是來源于中胚層的成體干細胞，其視網(wǎng)膜保護機制主要有：(1)細胞替代治療：MSCs在特定微環(huán)境中可被誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細胞，在一定程度上起到替代作用[1]，從而達到治療目的；(2)旁分泌作用：MSCs可以分泌睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，調(diào)節(jié)周圍受損組織的微環(huán)境，激活靶器官的修復(fù)機制，抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡[2]；(3)調(diào)控血管生成的微環(huán)境，抑制新生血管的大量產(chǎn)生[3]；(4)促進視網(wǎng)膜形成新的突觸連接和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高視功能[4]；(5)MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)能力，抑制炎癥因子的釋放[5-6]，自體或異體移植后無免疫排斥反應(yīng)，并且在體內(nèi)移植后歸巢至受損靶組織[7]。Tracy 等[8]利用基因修飾的MSCs過表達可溶性溶酶體酶來治療因PPT-1基因突變引起的溶酶體酶缺陷性視網(wǎng)膜變性，并未觀察到MSCs在玻璃體發(fā)生增殖或侵襲，說明基因修飾的MSCs在眼內(nèi)長期分泌所需蛋白治療視網(wǎng)膜變性是一種安全可靠的方法。還有其他研究表明MSCs是良好的基因載體[9-11]。由此可見，基因修飾的MSCs在視網(wǎng)膜病變研究中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本研究擬通過腺病毒載體修飾BMSCs，使其過表達CNTF，為視網(wǎng)膜病變的體外研究提供新途徑。

1材料和方法

1.1材料大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(廣州賽業(yè))，大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)液(廣州賽業(yè))，0.25%胰酶(美國Gibco)，293A細胞(上海漢恒生物)，載體pHBAd-MCMV-GFP(上海漢恒生物)，大腸桿菌菌株DH5α(北京Tiangen)，限制性內(nèi)切酶(美國Fermentas)，T4連接酶(美國Fermentas)，質(zhì)粒DNA小、大量抽提試劑盒(北京康為世紀(jì))，凝膠回收試劑盒(美國Axygen)，瓊脂糖、瓊脂粉(法國Biowest)，DNA ladder(美國Fermentas)，一次性培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿(美國Corning)，ELISA試劑盒(英國Abcam)。PCR儀(美國Applied Biosystems)，紫外分光光度計(美國Beckman)，DNA電泳儀(美國Applied Biosystems)，凝膠分析儀(美國Bio Rad)，熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)，酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)。

1.2方法

1.2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及傳代BMSCs以5×105個/皿密度接種于10cm培養(yǎng)皿，每盤加入完全培養(yǎng)液10mL，置于37℃、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d進行換液，當(dāng)細胞密度超過80%時進行傳代。吸除培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍，加入0.25%胰酶1mL，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1min后，把培養(yǎng)皿放置在倒置顯微鏡下進行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮變圓時，應(yīng)立即用等量完全培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打，形成細胞懸液，以1∶2傳代接種在新培養(yǎng)皿內(nèi)，傳代后間隔2d換液，直至細胞生長至80%匯合后，繼續(xù)傳代，如此反復(fù)，取第3代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2腺病毒包裝和擴增及純化(1)目的基因片段的獲?。焊鶕?jù)Genebank上大鼠CNTF基因(NM_013166.1)編碼區(qū)(CDS)，委托基因公司化學(xué)合成目的基因，pHBAd-MCMV-GFP載體用BamH I和EcoR I雙酶切(酶切體系含載體、BamH I、EcoR I、10×buffer和水)，載體酶切完成后膠回收。(2)合成的序列載體用BamH I和EcoR I雙酶切獲得CNTF片段，目的片段與載體連接，酶切完成后膠回收。(3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞：事先準(zhǔn)備好用于包裝病毒的293A細胞和病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染每個直徑為6cm的培養(yǎng)皿，complex成分：穿梭質(zhì)粒2μg，p-BHG(delta)E1,3 cre 4μg。Opti MEM在37℃水浴中預(yù)熱，Lipofiter TM轉(zhuǎn)染試劑恢復(fù)至室溫后使用，使用前搖勻，抗性:Amp，37℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染后6h換新鮮培養(yǎng)液。(4)病毒的收集：病毒收集前觀察病毒空斑是否形成，為限制病毒的擴散及空斑更好的形成，在培養(yǎng)液中加入瓊脂糖，空斑形成后連著瓊脂糖一起將空斑挑起，放入新鮮培養(yǎng)基中過夜。轉(zhuǎn)化后的CNTF平板挑菌，37℃，250r/min搖菌14h，菌液進行PCR鑒定，并將陽性克隆菌液送基因公司測序。(5)病毒的擴增：將培養(yǎng)基中病毒加入新鮮293A細胞培養(yǎng)液中進行病毒少量擴增。至細胞再次出現(xiàn)空斑，收集細胞及上清，反復(fù)凍融三次收集病毒，以此病毒為P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A細胞，連續(xù)進行三代感染，至P4代進行腺病毒的大量擴增，待空斑形成后收集病毒并對病毒進行體外純化和濃縮。(6)病毒的純化：采用CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒，CsCl梯度的制備方法如下：加入2.0mL密度為1.40g/mL的CsCl溶液，然后緩慢加入3.0mL密度為1.30g/mL的CsCl溶液，再加入5mL的病毒懸浮液，透析袋使用前用10mmol/L的EDTA-Na2煮沸10min，20000r/min室溫離心2h，收集密度在1.3～1.4g/mL的病毒條帶至透析袋中，配制透析緩沖液：50g蔗糖，10mL 1mmol/L Tris-HCl，pH8.0，2mL 1mmol/L MgCl2定容至1L，在透析緩沖液4℃攪拌透析過夜，中間換一次透析液。收集病毒，測定病毒滴度。(7)病毒重懸和保存：500μL的PBS重懸病毒沉淀，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3腺病毒感染BMSCs取第3代生長良好的BMSCs，以2×104個/mL的密度接種于24孔板中，每孔加入0.5mL，培養(yǎng)18h后細胞融合率約50%～60%，每孔更換為新鮮完全培養(yǎng)液1mL，調(diào)整腺病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為10，加入稀釋好的腺病毒液，輕晃混勻，繼續(xù)感染7h后，PBS洗3遍，更換為新鮮完全培養(yǎng)液。

1.2.4 ELISA檢測細胞上清液中CNTF分泌水平調(diào)整BMSCs密度，按2×104個/孔的密度接種于6孔板，24h后細胞約為5×104個/孔，更換不含青霉素-鏈霉素和胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，1mL/孔；設(shè)置三組：空白對照組(未轉(zhuǎn)染腺病毒組)、GFP-BMSCs組(空載腺病毒感染，病毒滴度2×1010TU/mL，MOI=200)、CNTF-BMSCs組(CNTF腺病毒感染，病毒滴度1010TU/mL，MOI=200)，感染7h后PBS洗3次，1mL/孔全量更換培養(yǎng)液，更換為含F(xiàn)BS和青霉素-鏈霉素的大鼠BMSCs完全培養(yǎng)液，1、2、3d后收集各組細胞上清液，2000r/min離心20min，取上清液，按照ELISA試劑盒操作說明書測定各組上清液中CNTF的蛋白濃度。比較三組上清液中CNTF的蛋白濃度。

2結(jié)果

2.1合成的目的基因序列合成的目的基因為含有CNTF序列的pHBAd-MCMV-GFP載體，ggatcc及gaattc分別為BamH I和EcoR I酶切位點，目的基因序列如下：

ggatccATGGCTTTCGCAGAGCAAACACCTCTGACCCTT

CACCGCCGGGACCTCTGTAGCCGTTCTATCTGGCTAGCAA

GGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTATGGAATCTTA

TGTAAAACATCAGGGCCTGAATAAAAATATCAACCTTGAC

TCAGTGGATGGTGTACCAGTGGCAAGCACTGATCGTTGGA

GTGAGATGACTGAGGCAGAGCGACTCCAAGAGAACCTCC

AGGCTTACCGTACCTTCCAAGGGATGTTAACCAAGCTCTT

AGAAGACCAGAGAGTACATTTCACCCCAACTGAAGGTGA

CTTCCATCAGGCAATACATACTCTTATGCTCCAAGTTTCT

GCCTTTGCCTACCAGCTAGAGGAGTTAATGGTGCTTCTGG

AACAGAAGATCCCTGAAAATGAGGCTGATGGGATGCCTG

CCACAGTTGGAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTAT

GGGGCTTGAAGGTCCTTCAAGAGCTCTCACAGTGGACTG

TGAGGTCTATCCATGACCTTCGTGTCATTTCTTCTCATCA

GATGGGAATCTCAGCACTTGAGAGCCATTATGGGGCCAA

AGATAAGCAGATGTAGgaattc。

2.2含有CNTF的pHBAd-MCMV-GFP載體酶切回收結(jié)果含有CNTF的pHBAd-MCMV-GFP載體酶切后得到約5500bp大小的產(chǎn)物，如圖1 Lane2～5所示，與pHBAd-MCMV-GFP載體大小一致。

圖1 pHBAd-MCMV-GFP載體膠回收結(jié)果 Lane1：DNA Marker，Lane2～5：pHBAd-MCMV-GFP載體。

2.3合成的序列載體用BamH I和EcoR I雙酶切獲得CNTF片段并且酶切完成后膠回收合成的序列用BamH I和EcoR I進行雙酶切，獲得約5500bp及600bp大小的產(chǎn)物(圖2，Lane1)，分別與載體和CNTF大小一致，說明目的基因構(gòu)建成功。

圖2 合成載體雙酶切膠回收結(jié)果 Lane1：CNTF合成載體雙酶切產(chǎn)物,上方為GV287載體，下方為CNTF基因；Lane2：DNA Marker。

2.4 CNTF單克隆PCR鑒定結(jié)果用通用引物對CNTF單克隆進行PCR檢測，得到的目的基因比CNTF大200bp左右(圖3，Lane2～7)，與引物大小一致，說明CNTF單克隆構(gòu)建成功。

圖3 CNTF單克隆PCR鑒定結(jié)果 Lane1：DNA Marker；Lane2～7：重組載體。

2.5 pHBAd-MCMV-GFP- CNTF重組載體測序結(jié)果CNTF過表達載體測序結(jié)果：

GCGGAAGGCTCGGTCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCA

CCGTAGAACGCAGATCGAATTAAGCTTGGGCTGCAGGTCG

ACTCTAGAGGATCCATGGCTTTCGCAGAGCAAACACCTCT

GACCCTTCACCGCCGGGACCTCTGTAGCCGTTCTATCTGGC

TAGCAAGGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTATGGAA

TCTTATGTAAAACATCAGGGCCTGAATAAAAATATCAACCT

TGACTCAGTGGATGGTGTACCAGTGGCAAGCACTGATCGTT

GGAGTGAGATGACTGAGGCAGAGCGACTCCAAGAGAACCT

CCAGGCTTACCGTACCTTCCAAGGGATGTTAACCAAGCTCT

TAGAAGACCAGAGAGTACATTTCACCCCAACTGAAGGTGA

CTTCCATCAGGCAATACATACTCTTATGCTCCAAGTTTCTG

CCTTTGCCTACCAGCTAGAGGAGTTAATGGTGCTTCTGGAA

CAGAAGATCCCTGAAAATGAGGCTGATGGGATGCCTGCCA

CAGTTGGAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTATGGGG

CTTGAAGGTCCTTCAAGAGCTCTCACAGTGGACTGTGAGG

TCTATCCATGACCTTCGTGTCATTTCTTCTCATCAGATGGG

AATCTCAGCACTTGAGAGCCATTATGGGGCCAAAGATAAG

CAGATGTAGGAATTCAGATCTGGTACCGTCGACGCGGCCG

CTCGAGCCGATATCATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGT

TATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCC

ATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC

CGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTC

AATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTT

TCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCC

CACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATG。測序結(jié)果比對顯示：陽性克隆中的序列與CNTF上(NM_013166.1)的CDS區(qū)完全一致(圖4，綠色標(biāo)記部分)，表明克隆成功。

圖4 陽性克隆的測序結(jié)果分析。

2.6各組在不同時間點上清液的CNTF蛋白濃度腺病毒轉(zhuǎn)染后1、2、3d，檢測三個組的CNTF蛋白濃度(表3)。結(jié)果表明，各組在不同時間點CNTF蛋白濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F時間=2266.250，P時間<0.001；F組間=14969.493，P組間<0.001；F組間×?xí)r間=3336.505，P組間×?xí)r間<0.001)。1、2、3d各時間點，與空白對照組相比，實驗組的CNTF蛋白濃度上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與陰性對照組相比，實驗組的CNTF蛋白濃度上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在實驗組內(nèi)，CNTF蛋白濃度隨時間延長而提高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組在不同時間點上清液中的CNTF蛋白濃度

3討論

CNTF對視網(wǎng)膜的保護機制主要有：(1)直接作用于感光細胞[12-13]，阻止光感受器的變性和凋亡；(2)激活Müller細胞[14]，使之分泌保護光感受器的神經(jīng)營養(yǎng)因子；

(3)促進谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的合成或分布，提高谷氨酸鹽的處理效率，減少對視網(wǎng)膜神經(jīng)元的興奮毒性損傷[15]；(4)增強視網(wǎng)膜細胞對新陳代謝損害的抵抗力，提高視網(wǎng)膜的應(yīng)激能力[15]。CNTF可以促進動物視細胞的存活[16]，在變性視網(wǎng)膜中，CNTF可以加快視錐細胞外段的更新[17]，還能抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，其視網(wǎng)膜神經(jīng)保護功能已被廣泛研究。在嚙齒類動物中，經(jīng)玻璃體腔注射CNTF蛋白可引起Müller細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)磷酸化顯著增加，而感光細胞的STAT3無明顯改變[15, 18]。因此，CNTF也有可能是間接通過其他細胞，如Müller細胞分泌細胞因子從而保護光感受器。RPE細胞頂端存在CNTF受體復(fù)合物，提示RPE細胞可對CNTF產(chǎn)生應(yīng)答[19]。CNTF可促進RPE細胞存活，加速光感受器的更新，促進Müller細胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等，從而保護視網(wǎng)膜。綜上，CNTF對視網(wǎng)膜的保護研究具有重要意義。

使BMSCs過表達CNTF，可通過非病毒載體和病毒載體。非病毒載體表達時間短，對細胞轉(zhuǎn)染率低并且不易保存。腺病毒載體構(gòu)建周期短，轉(zhuǎn)染時間短且轉(zhuǎn)染率高，使用方便，但不能整合到靶細胞基因組中[20]，因此適合用作短期的體外實驗。慢病毒可攜帶較大的基因片段，并整合到靶細胞基因組中，可以在宿主內(nèi)長期、高效穩(wěn)定地表達[21-22]，然而合成周期較長，擴增步驟繁瑣，適用于較長時間的體內(nèi)實驗，國內(nèi)已有武晶晶等[23]利用慢病毒對BMSCs進行基因修飾，使其過表達CNTF。單純注射或單劑量使用CNTF蛋白，藥物半衰期短[24]、濃度波動較大，為使CNTF在體外高效穩(wěn)定地表達，進一步研究過表達CNTF蛋白的BMSCs在體外研究中對視網(wǎng)膜的保護作用，我們成功構(gòu)建了過表達CNTF的腺病毒，并利用病毒系統(tǒng)感染BMSCs，使其持續(xù)高效表達CNTF成為可能，以期為視網(wǎng)膜疾病的體外研究提供新思路。