邵義男，路 強，楊曉靜

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)已成為當(dāng)今世界范圍內(nèi)糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥。該疾病由多重病因所致，但其具體發(fā)生機制仍未完全清楚[1]。高糖環(huán)境會在體內(nèi)引發(fā)炎癥和刺激新生血管生成，繼而導(dǎo)致DR。內(nèi)臟脂肪素(Visfatin)是一種新型脂肪因子，具有類胰島素、煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性及引起炎癥反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)[2-4]。臨床研究表明2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中Visfatin的表達明顯增加[5-6]。而且研究顯示早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜全層高表達Visfatin，認為部分原因可能由Müller細胞分泌產(chǎn)生該因子，進而促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達上調(diào)[7]，從而促進DR發(fā)生。重樓皂苷I(Polyphyllin I)是重樓提取物的一種，百合科植物根莖，是常用的一種治療玻璃體視網(wǎng)膜疾病的中藥成分。國內(nèi)外的藥理學(xué)及醫(yī)學(xué)研究表明，Polyphyllin I具有抗腫瘤的功效，且其對非腫瘤細胞無藥物毒性作用。Polyphyllin I可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白的途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡且能顯著抑制BGC823、SMMC-7721、SGC-7901等腫瘤細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[8]。同時，視網(wǎng)膜色素上皮細胞作為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變重要的參與細胞，可能與Visfatin有一定聯(lián)系。因此，我們通過建立高糖環(huán)境的視網(wǎng)膜色素上皮細胞模型，觀察Visfatin在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的表達情況，以及Polyphyllin I對Visfatin過表達的影響，了解Visfatin是否通過色素上皮細胞參與DR的發(fā)生，為疾病治療提供有益靶點，并探索治療新方向。

1材料和方法

1.1材料人視網(wǎng)膜色素上皮細胞ARPE-19(上海中喬新舟生物公司)；一抗：兔抗Visfatin多克隆一抗抗體(Abcam，USA)，兔抗VEGF多克隆一抗抗體及GAPDH(武漢博士德生物公司)；二抗：羊抗兔二抗IgG(H+L)，熒光標(biāo)記羊抗兔熒光二抗CY3及FITC；DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；特級南美ABW胎牛血清(武漢博士德生物公司)；Western blot裂解液試劑盒(深圳碧云天生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(Fermentas，USA)；重樓皂苷I(上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的培養(yǎng)傳代培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系，培養(yǎng)液配制：1%雙抗、10%胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基。依照培養(yǎng)情況分組：正常對照組、高糖組、高糖加Polyphyllin I藥物干預(yù)組。具體方案參照文獻[4,7]，正常對照組：在含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖組：細胞培養(yǎng)溶液中添加25mmol/L高濃度葡萄糖；藥物干預(yù)組：將25mmol/L高濃度葡萄糖和3μg/L的Polyphyllin I藥物加入到細胞培養(yǎng)基中。置入溫度為37℃的濕熱細胞培養(yǎng)箱中，將條件設(shè)置為5% CO2，95%空氣各組細胞均同條件下處理12h。

1.2.2免疫熒光染色法正常對照組、高糖組和藥物干預(yù)組均用96孔板接種4×104cell/L，每孔100μL，2個復(fù)孔/組，培養(yǎng)箱環(huán)境為濕度100%，溫度37℃，5% CO2，待細胞生長至70%時，用PBS洗滌3min/次，共3次；室溫下4%多聚甲醛固定15min，每次用PBS洗3min；每孔中加入0.5% Triton X-100通透20min，PBS清洗3次，每次3min；在37℃下15%胎牛血清液50μL封閉1h；棄去封閉血清，按照分組每孔分別滴加對應(yīng)一抗(1∶100)，避光孵育4℃過夜，PBS液3min/次清洗(3次)，等體積PBS液做陰性對照；各組每孔滴加熒光標(biāo)記二抗CY3或FITC(1∶100)，避光置于37℃恒溫箱反應(yīng)1h；再次使用PBS清洗3次，每次3min；熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡暗室觀察Visfatin和VEGF在細胞中的表達和分布。

1.2.3實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中Visfatin和VEGF mRNA的表達：提取各組色素上皮細胞總RNA(Trizol法)；冰浴解凍模板RNA及配置溶液，將5×gDNA Buffer(2μL)、總RNA、RNase-Free ddH2O(補足至10μL)配制混合液，短離心后置于42℃孵育，用10×King RT Buffer(2μL)、FastKing RT Enzyme Mix(1μL)、FQ-RT Primer Mix(2μL)及RNase-Free ddH2O(補足至10μL)配制反轉(zhuǎn)錄混合液，gDNA反應(yīng)液中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的Mix，混勻后42℃孵育15min；92℃孵育3min后得到cDNA后進行PCR反應(yīng)，使用Primer Express5.0軟件編輯引物序列如下，產(chǎn)品為PAGE純化。Visfatin引物(109bp)：上游5’-CCAGCGGCAGAGCACAC-TACC-3’，下游：5’-CGCTGACCACAGACACAG-GCA-3’，VEGF引物(195bp)：上游5’-TCCCAGCCTGGCCAAC-CCTT-3’，下游5’-ATGGGTCACCCCAGGGCTCC-3’,反應(yīng)參數(shù)為Visfatin：94℃ 5min預(yù)變性，93℃ 30s擴增，55℃ 45s，72℃ 45s，30個循環(huán)，最終延伸72℃ 7min; VEGF：94℃ 5min預(yù)變性，94℃ 30s擴增，55℃ 45s，72℃ 60s，30個循環(huán)，最終延伸72℃ 7min。每組15個復(fù)孔并以GAPDH引物為內(nèi)參。擴增完成后，用PCR自動分析軟件和比較RT法檢測各組mRNA的表達情況。

1.2.4 Western-blot法5×104/L于6孔板培養(yǎng)正常對照組、高糖組和藥物干預(yù)組，貼壁生長至70%時，在冰上進行操作，用預(yù)冷的PBS液漂洗2～3次后，增強型細胞裂解液200μL/孔(1mL裂解液與10μL蛋白酶抑制劑混合)，在冰浴中裂解30min使細胞完全裂解，離心10min(10000r/min，4℃)，收集上清加入5×SDS-PAGE上樣液，將混合液EP管置于95℃水浴，蛋白變性10min；取20μL混合液上樣于聚丙烯酰胺凝膠孔中，70V電壓電泳至溴酚藍染料達濃縮膠處，調(diào)節(jié)電壓至110V，溴酚藍到凝膠底端時停止電泳；恒流150mA電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜50min至0.2μm PVDF膜上。用TBST制備5%脫脂奶粉室溫封閉孵育2h，根據(jù)目的蛋白分子量切膜，切好的條帶放置于對應(yīng)一抗內(nèi)，4℃孵育過夜；TBST洗膜5min(3次)；二抗中4℃搖動孵育2h；ECL發(fā)光顯色試劑顯影，將GAPDH用作內(nèi)部對照，以比較各組中蛋白的相對表達。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS23.0軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組免疫熒光檢測結(jié)果實驗結(jié)果顯示：Visfatin蛋白在正常人視網(wǎng)膜色素上皮細胞的胞質(zhì)中弱陽性表達，呈弱紅色熒光(圖1A)。VEGF蛋白在正常人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中呈弱綠色熒光(圖1D)。高糖組模型中，Visfatin和VEGF在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中均可見到強陽性表達，Visfatin呈紅色強熒光，VEGF呈綠色強熒光，二者在細胞質(zhì)與細胞核中均呈強熒光染色(圖1B、E)。給予Polyphyllin I干預(yù)高糖狀態(tài)后，Visfatin和VEGF均表達較高糖組減弱，且細胞形態(tài)不規(guī)則或發(fā)生皺縮(圖1C、F)。

圖1 人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中Visfatin和VEGF的熒光表達(×400) A：正常對照組細胞中Visfatin蛋白表達呈弱陽性(Cy3)；B：高糖組細胞中Visfatin蛋白表達呈強陽性(Cy3)；C：高糖加Polyphyllin I組細胞中Visfatin蛋白表達較高糖組減弱(Cy3)；D：正常對照組中可見VEGF的弱表達(FITC)；E：高糖組細胞中VEGF表達呈強綠色熒光(FITC)；F：高糖加Polyphyllin I組細胞中VEGF表達較高糖組減弱(FITC)。標(biāo)尺：100μm。

2.2各組細胞中Visfatin和VEGF mRNA的相對表達量RT-PCR檢測，3組視網(wǎng)膜色素上皮細胞中Visfatin mRNA和VEGF mRNA相對表達量比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.78、8.44，均P<0.01)。高糖組Visfatin mRNA水平較正常對照組明顯增高(t=4.24,P<0.01)；高糖加Polyphyllin I藥物干預(yù)組Visfatin mRNA水平較高糖組表達降低(t=3.89,P=0.02)；而藥物干預(yù)組與正常對照組間無顯著差異(t=0.37,P=0.23)。高糖組中VEGF mRNA表達水平較正常對照組明顯升高(t=3.53,P<0.01)，且其mRNA水平高于干預(yù)組(t=2.57,P=0.01)，而干預(yù)組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.58,P=0.12)，見表1，圖2。

表1 各組細胞中Visfatin mRNA和VEGF mRNA相對表達量的比較

圖2 三組視網(wǎng)膜色素上皮細胞中VEGF mRNA和Visfatin mRNA相對表達量比較 A：VEGF mRNA；B：Visfatin mRNA。aP<0.05 vs 高糖組。

2.3各組細胞中Visfatin和VEGF蛋白表達量Western-blot結(jié)果顯示,各組人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中Visfatin蛋白和VEGF蛋白相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.14、8.59，均P<0.01)。Visfatin蛋白水平，高葡萄糖組表達量顯著高于正常對照組(t=3.62，P=0.01)，干預(yù)組表達低于高糖組(t=3.79,P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，VEGF蛋白水平，高葡萄糖組表達量顯著高于正常對照組(t=3.09，P<0.01)，干預(yù)組表達低于高糖組(t=2.87,P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖3，表2。

表2 各組細胞中Visfatin和VEGF蛋白相對表達量的比較

圖3 Western-blot法檢測各組細胞中Visfatin與VEGF蛋白表達情況 1：正常對照組 2：高糖組3：干預(yù)組。正常對照組中Visfatin和VEGF蛋白表達量較低，高糖組Visfatin和VEGF蛋白表達量明顯增強，高糖加重樓皂苷I組 Visfatin和VEGF蛋白表達量高于正常對照組，但較高糖組減弱。

3討論

近年來，Visfatin與糖尿病相關(guān)的研究引起了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病及其血管病變的機體中，Visfatin表達量顯著升高，可引發(fā)一系列病理生理改變[9-10]。DR作為糖尿病微血管并發(fā)癥的一種，Visfatin可能同樣參與其中[11]。研究表明DR中纖維血管增殖膜形成與Visfatin的表達增多有一定關(guān)系[12]。另有報道指出：DR中視網(wǎng)膜新生血管，可能通過Visfatin的促炎癥反應(yīng)特性誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，或類胰島素效應(yīng)增強蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)活性形成[13]。然而DR的發(fā)生發(fā)展還由其他多種因素共同參與，本研究觀察了Visfatin在模擬高糖環(huán)境下，人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的表達情況及其與VEGF的關(guān)系，并應(yīng)用Polyphyllin I作為干預(yù)抑制劑進行DR治療的初步探討，以期發(fā)現(xiàn)與病因相關(guān)的關(guān)鍵作用靶點，為DR防治提供新策略。在DR的視網(wǎng)膜細胞研究中，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的相關(guān)研究較多，色素上皮細胞的研究甚少。視網(wǎng)膜色素上皮細胞有調(diào)節(jié)眼內(nèi)電解質(zhì)平衡、構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障及分泌多種生長因子等保護及再生作用[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的Visfatin表達升高，推測高糖環(huán)境下色素上皮細胞可以分泌Visfatin，并可能與DR的發(fā)生機制相關(guān)。研究表明，高糖、低氧、機械損傷、糖基化等影響下，Visfatin可激活膠質(zhì)細胞，誘導(dǎo)Müller細胞分泌VEGF使得表達上調(diào)[7]，推測色素上皮細胞中可能存在相似的作用方式。而Visfatin和VEGF的表達升高可能促進色素上皮層新生血管形成[15]。色素上皮細胞的細胞骨架中相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可直接調(diào)控VEGF的表達[16]。且細胞中不僅可以分泌促進新生血管形成的VEGF,還可以分泌出抑制血管生成的因子[如重組人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)等]，二者間的動態(tài)平衡及其形成的物理屏障，可以有效地抑制脈絡(luò)膜新生血管的形成[17]。我們認為糖尿病患者眼底視網(wǎng)膜細胞長期處于缺氧狀態(tài)，致色素上皮層基底部VEGF異常分泌，一系列靶基因表達上調(diào)，Bruch膜受損使視網(wǎng)膜對疾病的抵御能力下降，影響各分子通路的激活，如PI3K/Akt和ERK(1/2)通路作用，使得細胞增殖新生血管形成，影響脈絡(luò)膜的供養(yǎng)能力，造成眼底光感受器細胞因缺營養(yǎng)而死亡[18-19]，破壞了色素上皮層的屏障功能。因此，Visfatin在色素上皮細胞中的表達升高提示其可能主要作用于DR視網(wǎng)膜的缺血階段，可能是局部缺血引起色素上皮細胞中Visfatin的表達增加，進而激活VEGF的表達，最終引起視網(wǎng)膜新生血管形成。我們將視網(wǎng)膜色素上皮細胞視為重點研究對象，希望能夠以此為突破口，進一步研究DR的發(fā)生機制、早期診斷與治療。

Visfatin可能通過多種途徑作用于DR的發(fā)生發(fā)展中，使內(nèi)皮細胞增殖和遷移、色素上皮細胞活化等反應(yīng)，促進血管平滑肌成熟和參與新生血管形成[20]。Adya等、Kim等、Bea等提出Visfatin通過PI3K及NF-кB信號通路、介導(dǎo)mTOR通路或激活ERK(1/2)通路形成新生血管[21-22]。因此我們認為，Visfatin可能通過上述某些通路誘導(dǎo)形成病理性新生血管[23]。本研究中高糖缺氧的狀態(tài)下視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的Visfatin過表達，說明Visfatin對于DR的發(fā)生發(fā)展起著不可忽略的作用。此外，本次實驗還觀察到高糖環(huán)境中Visfatin與VEGF同時呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，藥物干預(yù)后二者表達均有所減弱，推測視網(wǎng)膜新生血管的生成方面，Visfatin和VEGF存在類似作用效果，或Visfatin可以調(diào)控VEGF的表達。研究發(fā)現(xiàn)Visfatin能夠發(fā)揮抗凋亡效果，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，經(jīng)PI3K/Akt和ERK(1/2)通路促VEGF表達及新生血管形成[24-25]。Visfatin可以誘導(dǎo)Akt磷酸化，或激活某些炎性因子，使VEGF表達增多[26-27]。我們由此推測Visfatin可能對VEGF起正性調(diào)控作用。因此視網(wǎng)膜色素上皮細胞中Visfatin，在DR的視網(wǎng)膜增殖階段發(fā)揮重要效果，促使血管生成因子活躍，新生血管形成。

Polyphyllin I是重樓提取物中的一種，是治療玻璃體視網(wǎng)膜病變的一種藥物[8]。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細胞在高糖環(huán)境中增殖，且Visfatin及VEGF表達量增加，在給予Polyphyllin I藥物干預(yù)后，色素上皮細胞的增生受到了一定程度的抑制，Visfatin和VEGF mRNA和蛋白水平明顯下降，證明Polyphyllin I可能作為視網(wǎng)膜新生血管生成的抑制劑存在，對相關(guān)眼病起治療作用。這與蘇菲菲等研究有相似之處，即Polyphyllin I抑制色素上皮細胞增殖、快速誘導(dǎo)細胞凋亡，也可下調(diào)VEGF的表達，抑制新生血管形成，與Bcl-2、Cyclin D1、Bax、ERK(1/2)、p-ERK(1/2)和cleaved caspase-3等因子相關(guān)[4,28-29]。也有研究報道，重樓可抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡的作用，作用機制可能與Bcl-2表達下調(diào)相關(guān)[30]。Polyphyllin I同樣具有抗腫瘤作用，是廣泛應(yīng)用于各類腫瘤疾病的中藥，其腫瘤抑制作用可能多數(shù)通過PI3K/Akt/mTOR介導(dǎo)[29-31]，與介導(dǎo)DR的通路相同。我們認為該藥物可能對DR起到治療的效果，同時Polyphyllin I兼具對非腫瘤細胞無細胞毒性的特性，較同類臨床藥物風(fēng)險更低，治療收益更高。由此推測，Polyphyllin I有望成為治療DR乃至DM的潛力藥物。

采用體外細胞高糖模型模擬DR環(huán)境，可能與人類DR的生理環(huán)境不完全相同。但在本研究中，高糖刺激后機體視網(wǎng)膜色素上皮細胞內(nèi)出現(xiàn)Visfatin和VEGF表達增加，而Polyphyllin I的干預(yù)可抑制因子表達。因此，Visfatin做為新靶點可為DR的防治提供新的方向，但相關(guān)通路信息還有待更加深入的探索。Polyphyllin I可能成為治療DR的潛力藥物，但仍需進一步研究拓展。