蔣鵬娜 王麗潔 李 星 李竹英

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

支氣管哮喘是由包括氣道炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）在內(nèi)的多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。哮喘的病理生理狀態(tài)研究較多的主要有：氣道重塑、氣道炎癥、黏液蛋白過度分泌和氧化應(yīng)激過度[2]。近些年來自噬在呼吸系統(tǒng)疾病中作用機(jī)制的不斷被挖掘，許多學(xué)者證實(shí)了自噬主要通過調(diào)節(jié)基因[3]、氧化應(yīng)激、T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)[4]、病毒侵襲[5]等多方面影響哮喘的發(fā)生、發(fā)展。筆者通過觀察平喘顆粒含藥血清對(duì)氣道上皮細(xì)胞自噬及凋亡的影響，以探討該藥的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)Wistar大鼠，48只雌雄各半，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，許可證號(hào)：SYXK（黑）2015-003，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲食，在室溫（22±2）℃、濕度（50±10）%條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)，觀察大鼠在進(jìn)食、飲水、二便、活動(dòng)方面均無異常，1周后正式進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

平喘顆粒由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母共9味藥物組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，規(guī)格10 g/袋，批號(hào)20150102；人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE），購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫（CBP60550）；胎牛血清（FBS）來自Sigma公司，雷帕霉素來自上海源葉生物公司，氯喹來自Sigma公司。

1.3 含藥血清的制備

取健康清潔級(jí)Wistar大鼠，平喘顆粒連續(xù)給藥3 d（將平喘顆粒稀釋至0.54 g/mL，每次按1 mL/100 g灌胃），末次給藥前禁食12 h，給藥2 h后麻醉，腹主動(dòng)脈取血，采血后靜置30 min，常規(guī)分離血清，56℃水浴滅活補(bǔ)體30 min，過濾器過濾，密封，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)含藥（平喘顆粒）血清濃度為20%時(shí)[9]，對(duì)雷帕霉素誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞有較明顯的抑制作用，故實(shí)驗(yàn)中選用該濃度。

1.4 細(xì)胞分組、加藥及收集

取對(duì)數(shù)生長期的16HBE貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，將細(xì)胞按照常規(guī)方法接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下細(xì)胞密集度達(dá)到70%時(shí)，將細(xì)胞分為正常培養(yǎng)基細(xì)胞組（正常對(duì)照組）、雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組。將雷帕霉素組、雷帕霉素加氯喹組、雷帕霉素加中藥組分別加入雷帕霉素800 μL，對(duì)照組加入等量的DMEM不完全培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)12 h后棄去各組培養(yǎng)基，重新將正常對(duì)照組、雷帕霉素組分別加入800 μL DMEM不完全培養(yǎng)液，雷帕霉素加氯喹組加入800 μL氯喹溶液，雷帕霉素加中藥組加入800 μL含中藥血清，再次放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h。棄去各組培養(yǎng)液，常規(guī)消化細(xì)胞，分別刮取收集各組細(xì)胞，保存至1.5 mL離心管內(nèi)。

1.5 電鏡下觀察細(xì)胞自噬

棄去培養(yǎng)液，常規(guī)消化細(xì)胞，刮取細(xì)胞，分別收集各組細(xì)胞，用戊二醛固定后，按照電鏡操作流程處理細(xì)胞后觀察各組細(xì)胞自噬情況。

1.6 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況

收集培養(yǎng)的細(xì)胞，調(diào)成密度為5×105個(gè)/mL，按照操作流程進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，Anneexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶（PI）為紅色熒光，在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，正常的活細(xì)胞不被Anneexin V-FITC和PI染色；凋亡早期的細(xì)胞僅被Anneexin V-FITC染色，PI染色呈陰性；壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞可以同時(shí)被Anneexin V-FITC和PI染色。散點(diǎn)圖的左上象限是可允許范圍內(nèi)的檢測誤差。

1.7 Westen blotting方法檢測細(xì)胞中自噬效應(yīng)蛋白-1（Beclin-1）、Caspase-3蛋白表達(dá)

將準(zhǔn)備就緒的各組細(xì)胞按照BCA蛋白濃度檢測說明書進(jìn)行測定，利用酶標(biāo)儀讀取OD值，在蛋白定量后用還原樣品加熱，使蛋白變性，電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膠片曝光、定影等過程同膠片掃描后分析結(jié)果。檢測各組細(xì)胞中自噬相關(guān)基因蛋白Beclin-1、Caspase-3的表達(dá)水平，并對(duì)其條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡檢測結(jié)果

2.1.1 雷帕霉素誘導(dǎo)12 h 16HBE觀察 見圖1。正常對(duì)照組中細(xì)胞核染色質(zhì)豐富且均勻，可清晰見到線粒體及完整峭結(jié)構(gòu)，細(xì)胞整體形態(tài)良好；經(jīng)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素作用后，其余3組中部分細(xì)胞內(nèi)可見單層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，內(nèi)含細(xì)胞器腫脹變形，部分線粒體空泡化，峭開始溶解。

圖1 各組12 h 16HBE電鏡結(jié)構(gòu)圖（25 000倍）

2.1.2 雷帕霉素誘導(dǎo)后加藥物干預(yù)電鏡觀察 見圖2。正常對(duì)照組中細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)及形態(tài)完好，細(xì)胞核染色質(zhì)豐富、分布均勻，胞內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體，峭較完整；加氯喹干預(yù)后24 h，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，可見自噬泡，少量線粒體出現(xiàn)峭溶解斷裂；加中藥血清干預(yù)后24 h，細(xì)胞基本形態(tài)較好，可見到自噬泡和線粒體，其中線粒體峭較完整。由圖可見，經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)改變了正?；窘Y(jié)構(gòu)，出現(xiàn)了線粒體腫脹，甚至溶解、空泡化。而分別在氯喹和含藥血清干預(yù)已自噬的細(xì)胞后，其內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)均明顯改善，細(xì)胞活力增加，說明由雷帕霉素引起的自噬在氯喹或者中藥平喘顆粒的干預(yù)下可以得到抑制或者改善，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

圖2 各組細(xì)胞電鏡結(jié)構(gòu)圖（25 000倍）

2.2 各組細(xì)胞凋亡情況比較

見表1，圖3。經(jīng)雷帕霉素誘導(dǎo)后，16HBE細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均增加（P＜0.05）。而經(jīng)氯喹阻斷后，細(xì)胞晚期凋亡率明顯下降（P＜0.05），而早期凋亡率下降不明顯（P＞0.05），總凋亡率也呈下降趨勢（P＜0.05）。經(jīng)平喘顆粒干預(yù)后，細(xì)胞早期凋亡率變化也不明顯（P＞0.05），晚期凋亡率明顯下降（P＜0.05），總凋亡率也呈下降趨勢（P＜0.05）。

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

與正常對(duì)照組比較，?P＜ 0.05，??P＜ 0.01；與雷帕霉素組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組別正常對(duì)照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6早期凋亡率6.135±0.422 10.125±0.635**14.581±1.232**10.056±1.114**晚期凋亡率9.123±0.307 26.843±2.136**12.426±1.667**△△17.011±1.606**△△總凋亡率16.012±0.823 35.266±2.736**26.758±2.697**△△26.903±2.792**△△

圖3 各組細(xì)胞凋亡流式檢測結(jié)果

2.3 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

見表2，圖4。結(jié)果顯示，雷帕霉素組和雷帕加氯喹組Beclin-1、Caspase-3的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高（P＜0.05或P＜0.01），其中雷帕霉素組上述指標(biāo)的表達(dá)較雷帕加中藥組增高（P＜0.05）。在雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡中，自噬和凋亡二者相互促進(jìn)，Caspase-3蛋白表達(dá)增加，而氯喹和中藥平喘顆粒組Caspase-3蛋白表達(dá)受抑制。

表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較（±s）

表2 各組Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較（±s）

組別正常對(duì)照組雷帕霉素組雷帕加氯喹組雷帕加中藥組n 6 6 6 6 Beclin-1 GAPDH 0.61±0.33 0.82±0.37**0.71±0.29*△△0.43±0.30**△△Caspase-3 GAPDH 0.46±0.27 0.97±0.30**0.55±0.22*△△0.54±0.25*△△

圖4 各組細(xì)胞自噬相關(guān)基因蛋白的表達(dá)

3 討論

劉建秋教授根據(jù)多年治療哮喘慢性持續(xù)期或者緩解期的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出了“見痰不治痰，重用溫藥，既化飲又給邪以出路，補(bǔ)中有消，溫中有行，開中有闔”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。平喘顆粒為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑，由淫羊藿、炙麻黃、黃芪、太子參、五味子等9味藥物組成。前期臨床研究表明平喘顆粒用于慢性持續(xù)期的陽虛痰盛證哮喘患者治療效果尤佳，亦可用于具有相同癥狀的其他咳喘病[6-7]。在前期平喘顆粒藥效學(xué)研究中該藥物可促進(jìn)小鼠氣管酚紅的排泄量和促進(jìn)呼吸道上皮纖毛運(yùn)動(dòng)，促使痰液稀釋并發(fā)揮排痰的作用[8]。也有研究表明哮喘發(fā)病時(shí)引起氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而結(jié)局則是以細(xì)胞重回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞自噬或細(xì)胞凋亡等形式結(jié)束[9]。氣管上皮細(xì)胞的新陳代謝中自噬與凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式，自噬可以促進(jìn)凋亡發(fā)生，又可以通過提供營養(yǎng)和能力發(fā)揮防御作用，抑制凋亡或者延遲凋亡，而在調(diào)控方面，二者又可獨(dú)立發(fā)揮作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。Beclin-1作為自噬的直接執(zhí)行者，不僅可促進(jìn)自噬吞噬體形成[11]，增加自噬發(fā)生[12]，同時(shí)參與上皮細(xì)胞凋亡[13]。劉娟等提出在哮喘患者中Beclin-1可能同時(shí)參與上皮細(xì)胞凋亡和自噬的過程，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，緩解哮喘的急性發(fā)作與慢性病程[14]。Caspases又稱凋亡蛋白酶，Caspase-3處于兩條凋亡信號(hào)通路的中心位置，通過介導(dǎo)特異性肽鍵，引起凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15-16]，執(zhí)行細(xì)胞最終凋亡過程[17]。國內(nèi)研究表明在嬰幼兒喘息性疾病的研究中[18]，嗜酸性粒細(xì)胞中的凋亡因子Caspase-3活性降低，抗凋亡Bcl-2基因表達(dá)增多，在兩者共同作用下導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞凋亡減緩，使得患兒外周血中嗜酸性粒細(xì)胞相對(duì)增多。

本實(shí)驗(yàn)用雷帕霉素[19]誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞自噬，通過電鏡發(fā)現(xiàn)自噬的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)-自噬泡的存在，還觀察到凋亡細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的情況，其結(jié)果均明顯出現(xiàn)自噬和凋亡指征，凋亡率明顯增加，自噬泡及溶酶體增多，凋亡標(biāo)志蛋白酶Caspase-3/Beclin-1表達(dá)均顯著增加，而應(yīng)用自噬抑制劑氯喹和中藥平喘顆粒后，凋亡率、自噬數(shù)量、Caspase-3、抑凋亡蛋白Beclin-1表達(dá)均明顯下降。實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素激活氣道上皮細(xì)胞自噬途徑后，平喘顆粒有類氯喹作用，在哮喘發(fā)病的自噬過程中對(duì)病變細(xì)胞的凋亡與自噬起抑制作用，且此過程中凋亡與自噬二者呈正相關(guān)。