呂弈賓 陳 乾 熊旭東 謝 芳 李淑芳

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

膿毒癥是由于過度的促炎介質(zhì)引發(fā)，從而導(dǎo)致促炎/抑炎失衡的器官功能障礙性綜合征[1]，該病是重癥監(jiān)護(hù)病房發(fā)病率最高和死亡率最高的疾病之一[2-3]。由于膿毒癥發(fā)病機制極為復(fù)雜，具體機制仍未明確，但大量研究表明高遷移率族蛋白1（HMGB1）與炎癥因子水平、疾病嚴(yán)重程度及膿毒癥預(yù)后呈正相關(guān)[4]。膿毒癥發(fā)生后24 h內(nèi)，存在于免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞細(xì)胞核中的主要警報蛋白——HMGB1，被組織激活并釋放，與多種靶細(xì)胞受體相互作用[5-6]，從而促進(jìn)促炎細(xì)胞趨化因子的釋放，導(dǎo)致線粒體功能激活[5]，過度促進(jìn)氧化因子發(fā)生氧化反應(yīng)，進(jìn)而損傷機體組織損傷。隨著HMGB1促炎信號逐漸增強，線粒體功能損傷更為嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致線粒體發(fā)生障礙，加重膿毒癥炎癥反應(yīng)。此外，因線粒體功能極為強大，已被證實與嚴(yán)重膿毒癥誘導(dǎo)的死亡密切相關(guān)[7-9]。熊旭東教授課題組經(jīng)過多年臨床和基礎(chǔ)實驗，制定出炎調(diào)方用于治療膿毒癥急性肺損傷?；A(chǔ)研究表明炎調(diào)方能夠減輕膿毒癥致急性肺損傷（ALI）大鼠炎癥介質(zhì)釋放，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有保護(hù)肺組織的作用[10-11]。臨床研究顯示，炎調(diào)方能夠減輕膿毒癥ALI患者的炎癥反應(yīng)，提高患者氧合水平[12]。本實驗擬通過觀察炎調(diào)方對HMGB1表達(dá)的影響，探討其對線粒體的作用，為進(jìn)一步探索炎調(diào)方治療膿毒癥致ALI的作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40只清潔級SD成年雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。飼養(yǎng)條件：室溫22～24℃，相對濕度40%～60%。每籠5只，自由飲水，進(jìn)食普通標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天7∶00～19∶00予以光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗。

1.2 試劑與藥物

炎調(diào)方免煎劑，組成：生大黃6 g，芒硝10 g，桃仁12 g，赤芍15 g，玄參12 g，當(dāng)歸12 g，銀花15 g，連翹15 g，麥冬12 g。產(chǎn)品批號：1809310，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院提供。參考文獻(xiàn)[13]體表面積折算，動物灌胃體積為1 mL/100 g。烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H19990134）、線粒體Na+-K+-ATP酶活性試劑盒（南京建成科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號2018005）、線粒體Ca2+-ATP酶活性試劑盒（南京建成科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號2018005）、戊巴比妥鈉（上海伊卡生物科技有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號 2017012）、戊二醛（sigma-alorich生產(chǎn)，產(chǎn)品批號2017005）、磷酸緩沖液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號2017005）。

1.3 實驗儀器

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇榮華儀器制造有限公司）、721型分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、高速離心機（Eppendorf centrifuge 5415D）、101數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海葉拓儀器儀表有限公司）。

1.4 造模與給藥

將SD雄性大鼠40只隨機分為假手術(shù)組、模型組、炎調(diào)方組和烏司他丁組，每組10只。模型組于造模前予生理鹽水10 mL/kg灌胃，每天1次，第3次灌胃2 h后行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）術(shù)造模[10]：大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，在腹正中作一1.5 cm長的切口，找到盲腸，在其根部結(jié)扎，用18號針穿通3次，輕擠出少量腸內(nèi)容物，留置2 mm皮瓣防止針孔閉合，還納盲腸于腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢皮下注射生理鹽水30 mL/kg抗休克。假手術(shù)組麻醉后僅開腹翻動腸道，關(guān)腹，其余操作同模型組。模型組與假手術(shù)組術(shù)后腹腔注入生理鹽水10 mL/kg。炎調(diào)方組于造模前給予炎調(diào)方免煎顆粒灌胃，每天1次，第3次灌胃2 h后行CLP術(shù)造模，術(shù)畢腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。烏司他丁組于造模前生理鹽水10 mL/kg灌胃，每天1次，第3次灌胃2 h后行CLP術(shù)造模，術(shù)畢腹腔注射烏司他丁10萬U/kg。各組灌胃時間均為早上7點開始，按假手術(shù)組、模型組、炎調(diào)方組和烏司他丁組依次灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

40只大鼠于造模后24 h取材（取材當(dāng)天不灌胃），麻醉后沿縫合切口打開腹腔，暴露后腹膜，用10 mL注射器抽取腹主動脈血，存于采血管中，室溫靜置2 h后離心（3 000 r/min，10 min）取上清。打開胸腔，取左肺組織保存于空EP管中，右肺組織保存于含4%多聚甲醛EP管中。

1.5.1 透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu) 從4%多聚甲醛中取出右肺組織，用戊二醛、磷酸緩沖液固定，脫水、包埋、固化、并切片，并用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，使用JEOL JEM-1230（80KV）觀察，拍片。

1.5.2 HE染色觀察右肺組織 從4%多聚甲醛中取右肺組織，用不同濃度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、脫蠟后用蘇木素及伊紅染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.5.3 線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶測定

取左上肺組織剪碎、勻漿、離心（5 000 r/min，10 min）后取上清，通過酶聯(lián)免疫測定的方法檢測ATP酶分解產(chǎn)生的無機磷的光密度來測定肺組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。

1.5.4 肺組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量的測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.5.5 RT-PCR檢測肺組織HMGB1 mRNA表達(dá)水平采用TRIzol法，氯仿異丙醇抽提約100 mg左肺組織RNA，并檢測RNA濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA轉(zhuǎn)錄制備cDNA。將制備好cDNA進(jìn)行real-time PCR 擴增，HMGB1上游引物5′-TAGCTAGCCCTGTCCTGGTG-3′，下游引物5′-TGTGCACCAACAAG AACCTG-3′，擴增產(chǎn)物的長度108 bp。GAPDH內(nèi)參對照，上游引物5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′，下游引物 5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3′，擴增長度135 bp。實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s、60℃退火，延伸45 s，40個循環(huán)；95℃，15 s 60℃，15 s熔解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后記錄所得擴增曲線的Ct值，2-ΔΔCt法計算所得結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS24.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入并進(jìn)行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)均以（）表示，采用One-way ANOVA進(jìn)行分析，多組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01表示有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況觀察

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠術(shù)后精神差，靈敏度及活動度下降，毛發(fā)豎立，呼吸頻率增快，腹部膨隆，無大便。經(jīng)治療后，炎調(diào)方組及烏司他丁組大鼠精神狀態(tài)、靈敏度、活動度較模型組改善，但二者之間無明顯差異。開胸后模型組大鼠肺組織可見水腫、瘀斑、瘀點，部分肺組織顏色黯紅，炎調(diào)方組和烏司他丁組大鼠肺組織損傷程度較模型組好轉(zhuǎn)，二者之間無明顯差異。

2.2 各組大鼠肺組織損傷情況

見圖1。假手術(shù)組肺組織結(jié)構(gòu)相對完整，肺組織形態(tài)相對正常，肺泡腔清晰可見，肺間質(zhì)出現(xiàn)輕度水腫及炎癥等病理變化；而模型組可見肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞滿布，肺組織中肺泡數(shù)量減少；與模型組比較，炎調(diào)方組和烏司他丁組肺組織結(jié)構(gòu)損傷破壞程度低，炎癥細(xì)胞、肺組織水腫程度要輕，但二者之間比較沒有明顯差異。

2.3 各組大鼠肺組織線粒體超微結(jié)構(gòu)

見圖2。假手術(shù)組可見線粒體大小無改變，數(shù)量較多，內(nèi)外膜完整無損傷，嵴排列較為整齊；與假手術(shù)組相比，模型組可見線粒體數(shù)量明顯減少，體積變大，嵴斷裂脫落甚至出現(xiàn)空泡化，內(nèi)外膜出現(xiàn)破損；與模型組比較，炎調(diào)方組和烏司他丁組線粒體損傷程度要輕，但二者無明顯差別。

圖2 各組大鼠肺組織電鏡下線粒體（10 000倍）

2.4 各組大鼠線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶比較

見表1。與假手術(shù)組相比，模型組、炎調(diào)方組和烏司他丁組的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯下降（P＜0.01）；炎調(diào)方組Na+-K+-ATP酶活性有所回升（P＜0.01），但Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），烏司他丁組的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性較模型組有所回升（P＜0.01），但與炎調(diào)方組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠ATP酶活性比較[μmol/（h·mg），±s]

表1 各組大鼠ATP酶活性比較[μmol/（h·mg），±s]

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。下同

Ca2+-Mg2+-ATP酶5.32±0.55 2.31±0.24△△2.91±0.73△△3.17±0.54△△**組別假手術(shù)組模型組炎調(diào)方組烏司他丁組n 10 10 10 10 Na+-K+-ATP酶5.47±0.69 2.35±0.60△△3.51±0.42△△**3.62±0.57△△**

2.5 各組大鼠肺組織中SOD活性及MDA含量比較

見表2。與假手術(shù)組相比較，模型組的SOD活性下降（P＜0.01），MDA含量上升（P＜0.01）；炎調(diào)方組和烏司他丁組的SOD活性較模型組明顯上升（P＜0.01），MDA含量明顯下降（P＜0.01），其中烏司他丁組的SOD含量較炎調(diào)方組上升（P＜0.05），而MDA含量比炎調(diào)方組要低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠肺組織中SOD活性及MDA含量比較（U/mg，±s）

表2 各組大鼠肺組織中SOD活性及MDA含量比較（U/mg，±s）

與炎調(diào)方組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同

組別假手術(shù)組模型組炎調(diào)方組烏司他丁組MDA 0.63±0.09 2.28±0.28△△**1.59±0.20△△**1.24±0.17△△**▲▲n 10 10 10 10 SOD 110.69±10.71 48.18±7.87△△64.39±6.34△△**73.79±5.40△△**▲

2.6 各組大鼠HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較

見表3。與假手術(shù)組比較，模型組的HMGB1 mRNA表達(dá)水平明顯上升（P＜0.01）；炎調(diào)方組和烏司他丁組HMGB1 mRNA的表達(dá)水平較模型組降低（P＜0.05），且烏司他丁組較炎調(diào)方組下降（P＜0.05）。

表3 各組大鼠HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較（%，±s）

表3 各組大鼠HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較（%，±s）

組別假手術(shù)組模型組炎調(diào)方組烏司他丁組n 10 10 10 10 HMGB1 mRNA 1.66±0.39 6.99±1.32△△5.47±1.06△△*4.05±0.96△△**▲

3 討 論

膿毒癥是由于機體對感染所引發(fā)免疫炎癥失衡的器官功能障礙綜合征[1]，肺損傷是其最常見并發(fā)癥[2]。基于病原微生物理論[14]，最初認(rèn)為宿主對病原體的應(yīng)答主要是通過病原相關(guān)分子模式和模式識別受體的相互作用來實現(xiàn)。隨著研究進(jìn)展，研究者還發(fā)現(xiàn)模式識別受體不僅能夠被病原微生物激活，也能夠被損傷相關(guān)分子模式激活（DAMPs）[15]。DAMPs是宿主細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的非微生物分子，例如HMGB1和組蛋白[16-17]，當(dāng)組織損傷時釋放入細(xì)胞外，啟動和維持非感染性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致全身炎癥、器官損傷和死亡。HMGB1是所有哺乳動物細(xì)胞中高度保守的蛋白，可以通過細(xì)胞質(zhì)囊泡主動釋放，也可以被動地從壞死細(xì)胞釋放。一旦釋放到細(xì)胞外，HMGB1能夠通過RAGE[5]和TLR4[6]等結(jié)合，激活先天免疫細(xì)胞，促進(jìn)活性氧過量產(chǎn)生，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞募集到組織損傷部位，增強炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而調(diào)節(jié)微循環(huán)血流動力學(xué)變化，從而促進(jìn)感染性休克發(fā)生[18]。線粒體損傷在膿毒癥患者中較為常見，線粒體損傷的嚴(yán)重程度與炎癥因子水平、疾病嚴(yán)重程度、預(yù)后呈正相關(guān)[9]。線粒體功能障礙通過以下機制參與了膿毒癥誘導(dǎo)的多臟器功能衰竭：1）引起細(xì)胞內(nèi)凋亡，導(dǎo)致免疫抑制[8]；2）導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂[7]；3）參與全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生[19]。線粒體功能障礙與HMGB1可相互作用?，F(xiàn)有研究表明，隨著膿毒癥的加重，NADPH氧化酶和線粒體功能障礙等來源產(chǎn)生的ROS增加，能夠促進(jìn)HMGB1的氧化，進(jìn)而導(dǎo)致HMGB1的促炎信號增強[4]。另外，線粒體功能障礙后除了釋放ROS，還可以釋放內(nèi)生警報信號mtDNA引起先天免疫系統(tǒng)通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化，調(diào)控IL-1和IL-8產(chǎn)生及釋放[20]。

膿毒癥ALI在中醫(yī)里并無相應(yīng)病名，根據(jù)其癥狀、疾病演變，可歸于“熱病”“溫病”中“喘證”“暴喘”范疇。根據(jù)膿毒癥臨床主要以氣喘、煩渴、身熱、腹脹便秘為主癥，熊旭東教授課題組自擬炎調(diào)方以通腑活血、瀉熱存陰為大法，旨在清除膿毒癥致ALI中炎癥介質(zhì)?；A(chǔ)研究[10-11]發(fā)現(xiàn)炎調(diào)方能夠降低膿毒癥ALI大鼠的NF-κB水平，上調(diào)HSP70表達(dá)，有效減輕膿毒癥ALI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)作用，防止膿毒癥ALI大鼠肺組織損傷；臨床研究[12]同樣發(fā)現(xiàn)炎調(diào)方能夠減輕膿毒癥ALI患者血清IL-2、IL-6和IL-8水平，有效改善患者氧合水平，縮短膿毒癥ALI患者機械通氣時間。膿毒癥ALI患者由于外感六淫，營熱毒邪熾盛，常常易于傷陰，而且臨床可見此類患者陰虧明顯，我們遂在炎調(diào)方中加入金銀花、連翹、麥冬，助臣藥赤芍、玄參達(dá)清營熱滋陰之效。同樣，經(jīng)改良后炎調(diào)方[21]也能夠降低膿毒癥ALI大鼠肺組織Fas蛋白表達(dá)，抑制TNF-α水平，有效防止膿毒癥肺組織損傷。

本實驗擬從線粒體結(jié)構(gòu)及功能入手，進(jìn)一步探索炎調(diào)方保護(hù)膿毒癥ALI機制。研究發(fā)現(xiàn)，在一般情況下肺組織HE染色、線粒體超微結(jié)構(gòu)顯示，炎調(diào)方組要優(yōu)于模型組。由于線粒體的兩大功能作用——供能及氧化應(yīng)激，筆者觀察各組的線粒體ATP酶及氧化應(yīng)激反應(yīng)水平，發(fā)現(xiàn)膿毒癥時線粒體ATP酶下降，用藥處理后，炎調(diào)方能提升Na+-K+-ATP酶活性。表明炎調(diào)方有保護(hù)線粒體維持正常功能的作用；在氧化應(yīng)激反應(yīng)方面，造模后模型組的SOD下降明顯、MDA上升明顯，而與模型組相比，炎調(diào)方具有上調(diào)SOD活性和下調(diào)MDA含量的作用，表明炎調(diào)方具有減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。為進(jìn)一步探索作用機制，我們觀察各組HMGB1 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)炎調(diào)方有下調(diào)HMGB1 mRNA作用。因此，基于以上結(jié)果，本研究顯示炎調(diào)方能通過下調(diào)HMGB1表達(dá)水平，防止線粒體進(jìn)一步損傷，從而達(dá)到有效減輕膿毒癥ALI大鼠肺組織損傷的作用。