陳韶奇 張志梅 卿莉萍 劉歡漾 龍昱

摘? ? 要：為探討菊米提取物對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠CTGF表達(dá)的影響。將雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為3個試驗(yàn)組和對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用鏈脲佐菌素注射建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型，再隨機(jī)分為A組糖尿病無治療組、B組菊米提取物給藥組、C組羥苯磺酸鈣給藥組。正常對照組為D組，注射同等劑量枸櫞酸鹽溶液。造模后1周，B、C組大鼠每天分別給予菊米提取物、羥苯磺酸鈣經(jīng)口灌胃治療，A、D組大鼠每天給予等量生理鹽水灌胃;第4，8，12周時分別監(jiān)測大鼠體重和血糖;12周后，處死大鼠，摘取眼球，剝離其視網(wǎng)膜組織做石蠟切片并HE染色;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測視網(wǎng)膜CTGF的表達(dá)。結(jié)果表明菊米提取物一定程度上可以降低DR大鼠模型的血糖水平和控制其體重，減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的溶解和細(xì)胞水腫，緩解視網(wǎng)膜內(nèi)顆粒層厚度減少的情況，降低DR大鼠CTGF濃度水平。菊米提取物可以調(diào)節(jié)DR大鼠模型血糖水平和控制其體重，改善大鼠視網(wǎng)膜變薄狀態(tài)，一定程度上減少DR大鼠視網(wǎng)膜組織損傷程度，抑制DR大鼠CTGF表達(dá)，對延緩糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管纖維化的進(jìn)程有一定抑制作用。

關(guān)鍵詞：菊米提取物;糖尿病視網(wǎng)膜病變;CTGF

中圖分類號：R285; R-332? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.09.005

Abstract： To investigate the effect of Jumi extraction on the expression of CTGF in diabetic retinopathy rats，forty males SD rats were randomly divided into three experimental group and a control group，ten rats in each group. The experimental group application chain urea with cephalosporins injection to establish the rat model with diabetic retinopathy， and then randomly divided into a diabetes group（group A）， a chrysanthemum extract group （group B）， and a calcium dobesilate group （group C）.The control group was named group D， injected with the same dose of citrate solution. After modeling for 1 wk， the rats in group B and C were given Jumi extraction and Doxium tablets by oral gavage very day， and the rats in group A and D were given the same dose of normal saline every day. At the 4th， 8th， and 12th weeks， the weight and blood glucose of the rats were monitored respectively; after 12 weeks， the rats were killed， the eyeballs were removed， and the retinal tissues were peeled off for paraffin sections and HE stained; the expression of CTGF in the retina was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （Elisa）.The results showed that Jumi extract coula reduce the blood sugar level of diabetic retinopathy rats and control its weight to a certain extent， reduce the dissolution and cell edema of retinal ganglion cells，alleviate the decrease in the thickness of the granular layer in the retina， and reduce the diabetic retinopathy rats Concentration level of CTGF / Total protein. Jumi extract could regulate the blood sugar level and control the weight of rats with diabetic retinopathy， improve the thinning of the retina of rats， reduce the degree of damage to the retinal tissue of rats with diabetic retinopathy， and inhibit the expression of CTGF. It has a certain inhibitory effect in delaying the process of retinal microvascular fibrosis in diabetic rats.

Key words： Jumi extraction; diabetic retinopathy; CTGF

作為一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性全身性代謝性疾病，糖尿病 （Diabetes Mellitus，DM）常并發(fā)心血管動脈粥樣硬化疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病足和微血管病變等，糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy， DR）是DM微血管病變中最為常見和嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥之一[1]。近年來，由于DM趨于年輕化，其防治、研究尤顯重要。

菊米為菊科草本植物，性寒味甘，經(jīng)由野菊篩選、人工栽培種植，采摘菊花蕾加工而成。臨床研究發(fā)現(xiàn)以菊花為有效成分的益氣清肝活血湯對高血壓性視網(wǎng)膜病變患者進(jìn)行治療，能緩解眼底視網(wǎng)膜的出血及水腫，改善視力。作為其加工產(chǎn)物的菊米含有豐富的揮發(fā)油、菊米內(nèi)酯、多糖、黃酮等生物活性物質(zhì)，能清火明目、潤肺敗毒、平肝降壓、控血壓及降血脂等[2-3]，對皮膚、癌癥、心血管、視網(wǎng)膜等臨床疾病也有著良好的治療作用，但其作用機(jī)制尚不明確。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor， CTGF）為新發(fā)現(xiàn)的一種富含半胱氨酸的具有致纖維化作用的多肽蛋白，被認(rèn)為是最具特異性的促纖維化因子之一，其在一定條件下能誘發(fā)肝、肺、腎纖維化及血管纖維化[4-7]，參與調(diào)控視網(wǎng)膜纖維化過程[8]，在DR患者的視網(wǎng)膜增殖過程中起著主導(dǎo)地位，并有望成為DR防治的潛在靶點(diǎn)[9]。雖然CTGF與DR的關(guān)系已逐漸受到關(guān)注，但關(guān)于兩者的研究較少。本研究通過建立經(jīng)典DM大鼠模型，觀察菊米提取物對DR大鼠血糖、體質(zhì)量及視網(wǎng)膜病變的影響，分析DR大鼠視網(wǎng)膜中CTGF表達(dá)水平的變化，探討菊米提取物對DR的可能作用機(jī)制，為臨床上改善和治療DR提供研究資料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物及分組

選擇二級健康SD大鼠40只，2月齡，均為雄性，體質(zhì)量250±10 g，由長沙醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心購入，編號：SYXK湘2017-0003，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為（22±2） ℃、相對濕度45%～65%經(jīng)裂隙燈及直接檢眼鏡檢查屈光間質(zhì)清，眼底無異常者納入實(shí)驗(yàn)。定量給食，晝夜自然變化。將所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食水12 h后，隨機(jī)分為4組：A組（糖尿病組）、B組（菊米提取物組），C組（羥苯磺酸鈣組），D組（空白對照組）。

1.2 試驗(yàn)試劑和器材

菊米（購自浙江省嘉興市，生產(chǎn)許可證批號：SC11433048301049，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：GB/T18862），檸檬酸，檸檬酸三鈉，2%鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（ 購于上海偉進(jìn)生物科技有限公司，批號：S0130-500MG），羥苯磺酸鈣（購于貴州天安藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20010795），CTGF酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（ m1002995-2，購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司），4%水合氯醛，高糖高脂飼料。熒光分光光度計，光學(xué)顯微鏡，低溫高速離心機(jī)，血糖儀，全自動生化分析儀等。

菊米提取物制備：將菊米干燥粉碎，過60目篩，600 g菊米用10倍量純水提取2次，提取液濃縮至120 mL，配成含生藥量5 g·mL-1溶液備用[3]。

2%鏈脲佐菌素制備：稱取-20 ℃保存的100 mg STZ，迅速加入配好的5 mL、0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液（稱取檸檬酸1.082 g、檸檬酸三鈉1.426 g，倒入100 mL燒杯，加入90 mL H2O，攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值=4.5，定容至100 mL，貯于4 ℃冰箱中備用），注意避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。

0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液：稱取檸檬酸1.082 g、檸檬酸三鈉1.426 g，倒入燒杯，加入90 mL H2O，攪拌溶解，調(diào)節(jié)pH值=4.5，定容至100 mL，貯于4 ℃冰箱中備用。

1.3 DR動物模型造建及給藥

1.3.1 造模 A、B、C組均接受2%鏈脲佐菌素（60 mg·kg-1） 腹腔注射，同時結(jié)合高糖高脂飼養(yǎng)建立糖尿病模型，D組大鼠注射同樣體積的枸櫞酸鹽溶液，正常喂養(yǎng)，自由飲水。72 h后在大鼠尾靜脈采血，用血糖儀檢測血糖濃度，凡空腹血糖濃度≥16.7 mmol·L-1，尿糖>+++，尿量及飲水量均明顯增多者視為造模成功[10]。每隔2周測1次血糖及體質(zhì)量（在試驗(yàn)進(jìn)程中，當(dāng)大鼠的血糖>28 mmol·L-1時，用精蛋白重組人胰島素注射液3-4U皮下注射，以降低死亡率）。

1.3.2 給藥 造模1周后，A組和D組給予1 mL 0.9%生理鹽水灌胃、B組和C組分別以同等劑量的菊米提取物、羥苯磺酸鈣灌胃;均為1天1次，灌胃12周。給藥4周、8周和12周后分別測定各組大鼠體重，尾靜脈采血，測定血糖濃度。

1.4 組織學(xué)觀察

給藥12周后的大鼠腹腔注射4%水合氯醛0.5 mL·（100 g）-1，麻醉后，快速摘除大鼠雙側(cè)眼球，于顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，左眼球視網(wǎng)膜制成勻漿待用;右眼球視網(wǎng)膜固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木素伊紅（HE）染色、脫水、透明。

每只右眼選擇4張切片，每張切片隨機(jī)選取視網(wǎng)膜3個視野，4張切片測量平均值作為1個樣本。采用計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)觀察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化，注意觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變化，并通過Image J軟件測量視網(wǎng)膜內(nèi)顆粒層厚度，以此判斷DM大鼠視網(wǎng)膜損傷情況。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測視網(wǎng)膜CTGF的表達(dá)

取視網(wǎng)膜組織勻漿，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，按照ELISA試劑盒操作步驟，測定不同濃度CTGF標(biāo)準(zhǔn)品溶液的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程回歸y=0.000 6x + 0.0736，R2=0.998 5，再測定樣本的OD值，依據(jù)回歸方程計算樣本濃度，計算各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)CTGF的濃度，并測出各組CTGF/Total protein比值變化。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SD大鼠臨床表征觀察

試驗(yàn)結(jié)束時，D組（空白對照組）大鼠全部存活， 一般情況良好，攝食飲水正常，精神狀況好，體質(zhì)量平穩(wěn)增長，二便正常，無死亡;A組有1只大鼠自尾靜脈采血后，斷尾處傷口紅腫潰爛，于造模后第38天死亡;有一只大鼠造模9周后眼底開始變渾濁，到取材之日眼球可見白色渾濁物;剩余大鼠較其他組明顯消瘦，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛色枯槁，尾部紫紅，有數(shù)個大鼠頭頸部皮肉分離;B、C組的大鼠與D組比較，攝食飲水量多，體質(zhì)量稍有減輕，精神狀況較A組表現(xiàn)好。

2.2 血糖和體質(zhì)量變化

給藥4周、8周和12周后分別測定4組大鼠血糖、體質(zhì)量，具體結(jié)果見表1、表2。 4、8、12周時，A、B、C三組大鼠血糖水平均明顯高于D組，比較差異極顯著（P< 0.05）;同時A、B、C三組大鼠的體質(zhì)量均較D組有所降低（P<0.05）。且B組大鼠體質(zhì)量均較A，C組有所降低（P<0.05）。

2.3 組織學(xué)觀察

HE染色后，光鏡下對照組D組大鼠視網(wǎng)膜表面光滑，組織形態(tài)未見明顯異常，各層細(xì)胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核染色清晰（見圖1-D）;A組大鼠視網(wǎng)膜組織各層排列相對有序，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層發(fā)現(xiàn)少許細(xì)胞溶解，視網(wǎng)膜內(nèi)界膜略腫脹，表面不平、增厚，可見細(xì)胞水腫（見圖1-A）;B、C組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)較A組基本完整，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層未見明顯細(xì)胞溶解，少許細(xì)胞水腫（見圖1-B、圖1-C），有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而B、C兩組對比無顯著差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

Image J軟件厚度測定顯示，A、B、C、D四組視網(wǎng)膜內(nèi)顆粒層厚度分別為26.221±2.813 μm、30.082±1.007 μm、29.842±1.114 μm、31.893±1.239 μm。四者相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。A、B、C組視網(wǎng)膜內(nèi)顆粒層厚度較D組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。B、C組視網(wǎng)膜內(nèi)顆粒層厚度較A組略增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而B、C兩組間對比，結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 各組DR大鼠視網(wǎng)膜CTGF的表達(dá)比較

造模12周后，A、B、C三組大鼠視網(wǎng)膜組織中CTGF的表達(dá)水平均高于D組。與D組大鼠比較，A組大鼠視網(wǎng)膜CTGF水平明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）;與A組大鼠比較，B組大鼠視網(wǎng)膜CTGF顯著降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），C組CTGF水平低于A組，有統(tǒng)計學(xué)意義;C組CTGF水平較B組稍高，但兩組對比無顯著差異（P>0.001），提示DR模型大鼠視網(wǎng)膜組織中CTGF表達(dá)與病情成正相關(guān)，菊米提取物可顯著減少視網(wǎng)膜組織中CTGF的表達(dá)（P<0.001），結(jié)果見表3、圖2。

3 結(jié)論與討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DR屬消渴目病范疇，病機(jī)為“燥熱灼傷目中血絡(luò)”導(dǎo)致視網(wǎng)膜出血、滲出等一系列炎癥病變，因此治法以活血化瘀為主， 兼疏肝理氣、益氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎等原則[11-12]。而西醫(yī)則以控制血糖或玻璃體腔注射藥物治療為主，有的可進(jìn)行激光手術(shù)，但屬于有創(chuàng)性介入，易帶來視力下降、視網(wǎng)膜水腫以及視野損害等問題，影響DR患者生活質(zhì)量和預(yù)后。

菊米提取物具有清火明目、平肝降壓、降低血脂等作用，但其作用機(jī)制尚未有明確報道，可能與含有菊米內(nèi)酯、黃酮甙等活性成分有一定的關(guān)系[2-3，13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)菊米提取物組大鼠的體質(zhì)量、血糖等身體機(jī)能好于糖尿病組，與羥苯磺酸鈣組大鼠有一定相似性，提示菊米提取物在DR大鼠的血糖調(diào)節(jié)及體重控制上有一定的作用。CTGF作為一種致纖維化因子，在DR患者的視網(wǎng)膜增殖過程中起著主導(dǎo)地位，其通過誘導(dǎo)毛細(xì)血管基底層增厚、周細(xì)胞丟失，導(dǎo)致后期新生血管，大量炎性介質(zhì)釋放，從而使血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞，纖維組織增生，形成纖維血管膜，最后發(fā)展到增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變階段[14]，導(dǎo)致視力下降甚至失盲。已有研究發(fā)現(xiàn)DM大鼠視網(wǎng)膜CTGF的表達(dá)在8周時就顯著高于正常大鼠視網(wǎng)膜[15];CTGF基因敲除的小鼠，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞丟失、基底層增厚得到有效控制[16];而DR患者CTGF的表達(dá)也顯著高于非糖尿病患者[17]，這些都表明CTGF的升高與DR血管增生程度呈現(xiàn)正比關(guān)系。本研究的結(jié)果顯示，菊米提取物組大鼠12周時視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞層的組織完整性好于糖尿病組，且視網(wǎng)膜CTGF表達(dá)水平比糖尿病組大鼠水平低，說明菊米提取物組大鼠血管增生程度有所下降，菊米提取物對早期DM大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用。因此，如果在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期開始進(jìn)行菊米提取物干預(yù)，一定程度上可延緩大鼠糖尿病進(jìn)程及微血管病變，減輕DR大鼠的視網(wǎng)膜纖維化狀態(tài)，保護(hù)視網(wǎng)膜組織的損傷。此外，本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)菊米提取物組與羥苯磺酸鈣組的大鼠在視網(wǎng)膜細(xì)胞完整性及視網(wǎng)膜CTGF濃度水平方面相差不大，說明菊米提取物與羥苯磺酸鈣在保護(hù)視網(wǎng)膜組織的作用上存在藥物平行性，這可為菊米在臨床上治療糖尿病視網(wǎng)膜病變患者時進(jìn)行聯(lián)合用藥提供一定的參考。

由于菊米含有多種生物活性成分，加之樣本數(shù)量有限、試驗(yàn)動物的生物性多樣等因素，后續(xù)需要在菊米相關(guān)有效成分的作用機(jī)制上進(jìn)行深入探討，并可通過直接眼底鏡檢查及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況等方面觀察在藥物干預(yù)下DR的病情進(jìn)展。

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