張小梅 邢獻杰 姜巧 于鑫婭 彭明國 張文藝

摘? ? 要：通過對大慶油田某采油場地的含油污泥進行富集、篩選，分離出1株高效石油降解菌，命名為SY-3，并對其進行16S rDNA分子鑒定。以中石化金陵公司浮選含油污泥為處理對象，探究pH值、NaCl含量、接菌量等對浮選油泥中的石油烴降解效果的影響，構(gòu)建了SY-3菌生長動力學(xué)與浮選油泥中的石油烴降解動力學(xué)本構(gòu)模型。結(jié)果表明：菌株屬于副球菌屬（Paracoccus SP.），在25～30 ℃接菌量為3%的基礎(chǔ)上，相較于NaCl含量，pH值對SY-3降解石油烴影響更大，當調(diào)節(jié)pH值為7、NaCl含量為1%時，SY-3在以石油烴提取液為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中的生長模式符合Logistic生長模型，其中菌株生長環(huán)境承載量K為1.206，菌株生長平均速率r為0.12，無量綱參數(shù)a為4.78。SY-3可在30 d內(nèi)將石油烴含量為5 g·kg-1降解至0.9 g·kg-1，降解了4.1 g·kg-1，降解率達82%。SY-3對短鏈烷烴（C10～C28）的降解率為88%、半衰期為9.9 d，對長鏈烷烴（C30～C40）的降解率為72%、半衰期為17.3 d，且對短鏈烷烴（C10～C28）降解速率是長鏈烷烴（C30～C40）的1.75倍。相較于長鏈烷烴，短鏈烷烴更易被SY-3菌生物降解。當石油烴初始含量小于34.47 g·kg-1時，其降解動力學(xué)符合生物處理經(jīng)典方程Monod方程的線性簡化形式，半飽和常數(shù)Ks=1.24 g·kg-1，最大反應(yīng)速率Vmax=3.24 g·（kg·d）-1。

關(guān)鍵詞：浮選油泥;石油降解菌SY-3;16S rDNA;石油烴;動力學(xué)

中圖分類號：X74? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.09.003

Abstract： Based on the enrichment and screening of oily sludge from an oil production site in Daqing oilfield， a highly efficient petroleum degrading bacterium named SY-3 was isolated and identified by 16S rDNA molecular analysis. The flotation of oily sludge from Sinopec Jinling Company was taken as the treatment object. The effects of pH， NaCl content and inoculum amount on the degradation efficiency of petroleum hydrocarbons in flotation sludge were investigated. Constitutive models of SY-3 bacteria growth kinetics and petroleum hydrocarbon degradation kinetics in flotation sludge were established. The results showed that the strain belongs to Paracoccus marcusii. On the basis of 3% inoculation amount at 25～30 ℃， pH had greater influence on degradation of petroleum hydrocarbons by SY-3 than content of NaCl. When pH was adjusted to 7 and content of NaCl was 1%， the growth mode of SY-3 conformed to Logistic growth model in inorganic salt medium with petroleum hydrocarbon extract as the sole carbon source. The K was 1.206， the r was 0.12， and the dimensionless parameter a was 4.78. The petroleum hydrocarbons were degraded by SY-3 from 5 g·kg-1 to 0.9 g·kg-1 within 30 days， 4.1 g·kg-1 of petroleum hydrocarbons being decomposed， and the degradation rate reached 82%. The degradation rate and half-life of short-chain alkanes（C10～C28） by SY-3 was 88% and 9.9 days respectively， while it was 72% and 17.3 d days for long-chain alkanes（C30～C40）. In addition， the degradation rate of short-chain alkanes（C10～C28） was 1.75 times that of long-chain alkanes（C30～C40） by SY-3. Compared with long-chain alkanes， short-chain alkanes were more easily biodegraded by SY-3 bacteria. When the initial content of petroleum hydrocarbon was less than 34.47 g·kg-1， its degradation kinetics conformed to the linear simplified form of Monod equation， a classical biological treatment equation. The semi-saturation constant Ks was 1.24 g·kg-1 and the maximum reaction rate vmax was 3.24 g·（kg·d）-1.

Key words： flotation sludge; petroleum degrading bacteria SY-3; 16S rDNA; petroleum hydrocarbon; kinetics

石油開采、煉制、運輸、使用和儲存的過程中會產(chǎn)生大量的含油污泥[1]，尤其是石油煉制領(lǐng)域過程中所產(chǎn)生的浮選含油污泥，對環(huán)境造成了嚴重的污染。因此，如何安全處置浮選含油污泥（簡稱浮選油泥）一直是石油煉制領(lǐng)域的一大難題。近年來，微生物降解因其安全高效符合生態(tài)處置理念，成為降解浮選油泥中石油烴的主要途徑之一[2，5-7]。張恒等[8]報道了從某油井的土壤樣品中篩選出3株高效石油降解菌，在最適生長條件下對石油烴的降解率最高可達52.20%;馮晉陽等[9]分離得到的假單胞菌對石油具有良好的降解能力，且降解反應(yīng)為一級動力學(xué)。辛蘊甜和趙曉祥[10]分離篩選出石油降解菌H-1，其降解動力學(xué)符合Monod的線性簡化模式。Pi等[11]證明了微生物表面活性劑生產(chǎn)菌M-25可有效降解4種原油，而Kimura等[12]則側(cè)重于微生物對原油各組分尤其是對芳烴物質(zhì)的降解機制研究。

綜上石油烴生物降解研究的國內(nèi)外報道雖然較多，但大多以石油烴污染較輕的常規(guī)含油污泥降解為主，針對石油烴污染較嚴重的浮選油泥微生物降解鮮有報道。且已有報道烷烴的降解菌主要有紅球菌、假單胞菌等[13]，關(guān)于馬氏副球菌（Paracoccus marcusii）降解烷烴的研究鮮有報道?；诖?，本研究從大慶油田某采油場含油污泥中富集、篩選、分離石油降解菌，應(yīng)用于中石化南京金陵公司浮選油泥，考察了pH值、NaCl含量、接菌量等對浮選油泥中石油烴降解效果的影響，為石油降解菌（SY-3）安全處置浮選油泥提供基礎(chǔ)認識和理論支持。

1 材料和方法

1.1 樣品和培養(yǎng)基

菌種來源泥樣來自大慶油田某采油井的含油污泥。

試驗用浮選油泥取自中石化南京金陵公司煉油車間，浮選油泥的石油烴初始含量為5 g·kg-1，含水率為23.92%，灰分含量為40.19%，揮發(fā)性固體含量為35.89%，pH值為7.76。

標液：16種偶數(shù)碳正構(gòu)烷烴混標（C10-C40）Alkane Mix 16 1 000 mg·L-1 1 mL，購買自東莞市迪卡實驗科技有限公司。

微量元素：維生素C，5 g;MnSO4，10 mg;K2HPO4，2 g;NH4Cl， 5 g;FeSO4，4 g;無菌水，1 000 mL。其中維C高溫滅菌會氧化失活，故配制母液過濾滅菌，其他利用高壓蒸汽滅菌鍋，121 ℃滅菌20 min。

無機鹽&石油烴培養(yǎng)基：MgSO4，0.5 g;KH2PO4，0.5 g;NaCl，3 g;CaCl2，0.1 g;微量元素，1 mL;FeSO4·7H2O，0.2 g;60%的乳酸鈉溶液，6 mL;添加本課題組從試驗用浮選油泥提取的石油烴提取液作為碳源、能源;無菌水，1 000 mL;調(diào)節(jié)pH值至7.5～8.0。

LB培養(yǎng)基：參照文獻[14]。

1.2 試驗設(shè)備與分析儀器

立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠）、數(shù)顯光照培養(yǎng)箱GZP-250（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、凈化工作臺SW-CJ-1F（上海賀德實驗設(shè)備廠）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱HZQ-X100A（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、倒置顯微鏡TL4（日本奧林巴斯）、紫外分光光度計UV-1800（日本島津）、紅外測油儀IR-200A（山東高環(huán)優(yōu)科精密儀器有限公司）、氣相色譜儀7820A（上海安捷倫科技有限公司）等。

1.3 石油降解菌的篩選分離

稱取10 g大慶某采場含油污泥樣品（菌種來源泥樣），加至已滅菌250 mL的LB培養(yǎng)基中，石油烴初始含量約為5 g·kg-1（采用紅外光度法測定）。再將LB培養(yǎng)基置于溫度為25～30 ℃，轉(zhuǎn)速為134 r·min-1下進行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為4～7 d。培養(yǎng)一個周期后，從富集培養(yǎng)液中吸取5%的菌液，轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，相同培養(yǎng)條件下在恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周，連續(xù)馴化5次。吸取0.5 mL的培養(yǎng)液涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基上，并在30 ℃的光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，選擇代表性較好、形態(tài)特征一致的單菌落進行5次以上的分離純化培養(yǎng)，得到6株單菌落，分別命名為SY-1～SY-6。

將分離純化得到的6株單菌落分別接入以石油烴為唯一碳源的無機鹽&石油烴培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)，通過紅外測油法[15-16]每隔2 d觀察并監(jiān)測石油烴降解情況，以方便篩選到降解效果最佳的菌株。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（2001年）及《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》（第二版，2001年）觀察該菌株的培養(yǎng)性狀和菌體形態(tài)，并進行生理生化試驗。

1.4 基于16S rDNA序列的分子鑒定

采用上海生工Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒來提取菌株SY-3的DNA基因組。采用27F和1492R細菌通用引物進行16S rDNA PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成后續(xù)的純化及測序。

將實驗測得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)序列進行Blast比對，選取與菌株SY-3序列相似性高的序列，利用MEGA 5.1軟件中Glustalw程序，進行多重序列匹配的排列（Multiple alignments）分析，將形成的多重序列匹配排列陣采用鄰近法（neighbor-joining）來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，最后采用自舉檢驗法（Bootstrap method）評估系統(tǒng)發(fā)育樹置信度，重復(fù)1 000次以鑒定SY-3菌株的分類歸屬。

1.5 氣相色譜條件

氣相色譜條件為：石英毛細管色譜柱（HP-5，30 m×0.25 mm×1.4 μm）;進樣方式：不分流進樣;進樣口溫度：300 ℃;柱溫：50～320 ℃;氣體流量：高純氮氣（1.5 mL·min-1），氫氣（30 mL·min-1），空氣（300 mL·min-1）;檢測器溫度：325 ℃;進樣量：1 μL。

1.6 石油降解菌SY-3對石油烴的降解效果

由前期研究結(jié)果知，菌株SY-3降解試驗的最適接菌量為3%，最適pH值為7，最適NaCl含量為1%。在上述條件下，制備石油烴初始含量為5 g·kg-1的無機鹽&石油烴培養(yǎng)基，再將石油降解菌SY-3在無菌環(huán)境下接入培養(yǎng)基中，使用25～30 ℃、100 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 d，相同降解條件下設(shè)2組平行實驗和1組不接菌的空白實驗。每隔2 h取樣測定菌株細胞濃度，以600 nm波長下的吸光度值OD600表示。每隔2 d取樣經(jīng)無水硫酸鈉、正己烷、丙酮等提取、凈化、濃縮、定容后，并參考《油田含油污泥綜合利用污染控制標準DB23/T.1413-2010》中附錄A《油田含油污泥石油類的測定紅外光度法》計算石油烴含量，參考《HJ 1021-2019 土壤和沉積物石油烴（C10～C40）的測定氣相色譜法》，在2.3.3的氣相色譜條件下用帶氫火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜儀檢測石油烴（C10～C40）含量，根據(jù)保留時間窗定性，外標法定量，計算其降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

6株菌的形態(tài)特征及對其石油烴降解效果如表1所示。由表1可知，篩選出的6株菌的大小相近，顏色各不相同，形狀均為圓形，表面大多較光滑，對石油烴的降解率也各不相同、相差較大。SY-1、SY-2、SY-3、SY-4、SY-5、SY-6對石油烴的降解率分別為32.60%，18.64%，65.89%，23.65%，38.69%，43.13%，其中SY-3菌株對石油烴降解效果最好。因此，本研究選取降解效果最佳的SY-3作為試驗研究對象。此外，通過表征SY-3的生理生化性質(zhì)，來進一步探究SY-3的特性。SY-3菌株常規(guī)的生理生化特性結(jié)果如表2所示，由表2可知SY-3菌株的生理生化特性各不相同，但多表現(xiàn)為陰性。從油鏡下革蘭氏染色后的SY-3顯微圖像可以看出（圖1），SY-3革蘭氏呈紅色，屬于陰性菌，稍透明，菌落呈1～2 mm圓形，表面及邊緣光滑凸起。

2.2 SY-3菌16S rDNA序列分析

通過16S rDNA序列分析鑒定石油烴降解菌SY-3的菌屬，將所測得的SY-3菌株DNA與GenBank數(shù)據(jù)庫已有序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建如圖2所示，結(jié)果表明SY-3菌株與Paracoccus marcusii、Paracoccus sp.等多種菌相似度可達98%以上。此外，SY-3與Paracoccus sp.（副球菌屬）經(jīng)MEGA7匹配相似性達到99.55%，處于同一展枝，自展值達到了96%。因此，初步鑒定篩選出的SY-3菌株是副球菌（Paracoccus sp.）。

2.3 石油降解菌SY-3對浮選油泥中石油烴的降解特性

石油烴降解菌SY-3對煉化油泥中石油烴的降解曲線如圖3所示，其中t為反應(yīng)時間，Ct是t時刻的石油烴含量，C0為油泥初始石油烴含量。由圖3可知，未添加菌劑的無機鹽&石油烴培養(yǎng)基中30 d內(nèi)僅12%的石油烴被分解，而當添加3%的SY-3菌液時，石油烴的降解速率加快，30 d內(nèi)SY-3對石油烴的降解率可達69%，這表明SY-3對石油烴有一定的降解能力（該條件下的pH值為6，NaCl含量為0.5%）。為了進一步提高SY-3對石油烴的降解效率，在接菌量為3%的基礎(chǔ)上，通過改變pH值和NaCl含量探究其對SY-3降解石油烴的影響。當調(diào)節(jié)pH值為7時，SY-3對石油烴的降解率由69%增加至77%（該條件下，NaCl的含量是0.5%），而此基礎(chǔ)上控制NaCl含量為1%時，SY-3對石油烴降解率僅增加了5%，此時降解率為82%，培養(yǎng)基石油烴殘留量為0.9 g·kg-1，此石油烴殘留量低于建設(shè)用地土壤污染風險管控標準中第二類用地總石油烴篩選值4.5 g·kg-1。這表明SY-3對石油烴具有良好的降解效果，且相較于NaCl含量，pH值對SY-3降解石油烴影響更大，這與已有的研究[10]結(jié)論相符合。

2.4 SY-3對石油烴中不同組分的降解效果解析及其一級動力學(xué)研究

為了進一步明確SY-3對于石油烴的降解特性，通過氣相色譜儀，并輔以1 000 mg·L-1 的16種偶數(shù)碳正構(gòu)烷烴混標（C10-C40），在菌株最適降解條件下（接菌量為3%、pH值為7、NaCl含量為1%）對降解后的煉化油泥中不同碳鏈長度的烷烴進行定性、定量。SY-3對不同碳鏈長度烷烴的降解效果（A）和降解速率（B）如圖4所示。由圖4A可知，30 d內(nèi)未接種菌劑的無機鹽&石油烴培養(yǎng)基中僅17%烷烴能被有效分解，當添加SY-3菌液時，不同碳鏈長度的烷烴C10～C28、C30～C40的降解過程急劇加速，30 d內(nèi)，SY-3對烷烴（C10～C40）的降解率達82%，其中對C10～C28的降解率為88%，對C30～C40的降解率為72%。由圖4B圖可知，SY-3菌對不同碳鏈長度的烷烴C10～C28、C30～C40的降解動力學(xué)與一級動力學(xué)方程相關(guān)性良好，并由T1/2=0.693/k計算可知其半衰期分別為9.9 d，17.3 d，其中k為一級降解動力學(xué)常數(shù)。對比C10～C28、C30～C40、C10～C40的k值可知，且SY-3對C10～C28的降解速率是C30～C40降解速率的1.75倍，是C10～C40的1.4倍。這表明與C30～C40的長鏈烷烴相比，SY-3對于短鏈烷烴C10～C28分解較快，短鏈烷烴較長鏈烷烴更易被降解，分析可能是長鏈烷烴的毒性較高限制了其生物利用度，致使其難被生物降解[17-18]。

2.5 石油降解菌SY-3的生長動力學(xué)研究

經(jīng)轉(zhuǎn)速100 r·min-1、溫度為25～30 ℃的搖床中培養(yǎng)，測得的SY-3生長曲線及其對石油烴的降解曲線如圖5所示，其中S為降解體系中石油烴含量，培養(yǎng)基中石油烴的降解與菌株的增殖同步進行[19]，菌株SY-3的最大OD600值為1.111，與其它文獻報道的石油烴降解試驗中的石油降解菌細胞密度[20-22]相比，本研究中SY-3菌株細胞密度較高，且菌株在生長1 d后迅速進入增長期和穩(wěn)定期，對比石油烴的降解主要在菌株穩(wěn)定期和衰亡期完成，說明菌株在復(fù)雜培養(yǎng)環(huán)境下生長良好且能夠有效降解石油烴，對于降解浮選油泥中的石油烴具有一定參考價值。

本試驗中，石油降解菌SY-3的微生物種群生長方式呈S型增長，因此采用Logistic模型對細菌的生長曲線進行擬合，Logistic方程如公式（4）所示：

Nt：生長時間為t時的細胞密度（OD600）;t：細菌生長時間（h）;r：石油降解菌SY-3生長平均速率（h-1）;K：菌株生長的環(huán)境承載量（OD600），a：與K和N0相關(guān)的一個參數(shù)[23]。

基于菌株SY-3的初始細胞濃度為N0為0.010，最大細胞濃度為N50（t=50 h）為1.111，菌株SY-3的細胞濃度與培養(yǎng)時間的Logistic擬合曲線如圖5所示。由圖5可知菌株SY-3的生長情況由（2）表示，其中K= 1.296， r= 0.12，a =4.78，決定系數(shù)R2=0.951 7。

根據(jù)圖5可知，Logistic S增長模型可較好的描述菌株SY-3的生長情況，理想條件下菌株SY-3可以利用浮選油泥中的石油烴作為碳源、能源促進其自身代謝，但實驗室條件下SY-3不能完全利用營養(yǎng)等物質(zhì)，因此有必要對菌株降解石油烴的過程進行分析，SY-3石油降解菌處于增長期時，其實驗室條件下的細胞濃度略高于Logistic模型，石油烴的降解也主要是在SY-3菌株生長的增長期、穩(wěn)定期，而隨著石油烴濃度的進一步降低時，菌株逐漸進入衰亡期。這反映出SY-3降解石油烴并利用其作為碳源、能源進而促進其自身生長。

2.6 菌株SY-3增長與石油烴降解動力學(xué)模型構(gòu)建

在最佳降解條件下，采用線性簡化的動力學(xué)模型Monod方程式來描述菌株SY-3增長與石油烴降解動力學(xué)關(guān)系，假定石油烴的降解符合如下Monod方程式[24]：

式中：v—有機物的比降解速率，g·（kg·d）-1;

vmax—有機物底物的最大比增長速度，g·（kg·d）-1;

KS—飽和常數(shù)（也稱半速率常數(shù)），其值為當v=vmax/2時的基質(zhì)含量;

S—有機物底物含量，g·kg-1。

圖5中SY-3對石油烴的降解曲線各點的斜率為SY-3菌株對石油烴的降解速率v，利用石油烴含量的倒數(shù)1/S和SY-3菌株對石油烴降解速率的倒數(shù)1/v關(guān)系如圖6所示，在線性區(qū)間范圍內(nèi)采用線性簡化的方法，以1/S對1/v作圖，求得Monod方程中Vmax和KS的值。

由圖6可知，擬合得到方程為：y= 0.382 2x- 0.309 1，R2=0.991 3。由此方程可得斜率B為0.382 2，縱截距A為0.309 1。又由縱截距A=1/vmax，計算得出vmax為3.24 d-1;由斜率B=KS/vmax，計算得出KS為1.24。所以SY-3菌株降解石油烴的速率與石油烴含量的關(guān)系為：

石油烴的初始含量S0為5 g·kg-1，擬合得出的KS為1.24，其值符合有機物的比降解速率與有機物底物含量的線性簡化區(qū)間KS≤S≤10 KS的要求，假定成立，vmax越高，KS越低，表明物質(zhì)越容易降解[10，25]。

不同初始含量條件下SY-3對TPH（C10～C40）降解的實際降解速率v，利用生物動力學(xué)模型Monod方程計算的降解速率v0，具體數(shù)據(jù)如下表3所示。

由表3可以看出，當石油烴含量大于34.47 g·kg-1時，實際降解速率V大于Monod方程中的vmax;當石油烴含量小于34.47 g·kg-1時，SY-3的實際降解速率與Monod方程計算結(jié)果基本吻合。這表明，石油烴含量較低時，Monod模型能夠較好地模擬菌株SY-3降解石油烴的反應(yīng)過程。

3 結(jié) 論

本研究通過對大慶油田某采油場地的含油污泥進行富集、篩選，分離出1株高效石油降解菌SY-3，并對其進行16S rDNA分子鑒定。以中石化金陵公司浮選油泥為處理對象，探究pH值、NaCl含量、接菌量等對浮選油泥中的石油烴降解效能的影響，構(gòu)建了SY-3菌生長動力學(xué)與浮選污泥中的石油烴降解動力學(xué)的本構(gòu)模型，得到如下結(jié)論。

（1）本文經(jīng)培養(yǎng)基富集、分離純化、篩選出的高效石油烴降解菌株SY-3，菌落呈圓形、稍透明且表面光滑。經(jīng)常規(guī)生理生化試驗及16S rDNA序列分析鑒定該菌革蘭氏呈陰性，屬于副球菌（Paracoccus sp.）。

（2）在接菌量為3%，pH值為7，NaCl含量為1%的降解體系中，相較于NaCl含量，pH值對SY-3降解石油烴影響更大。30 d內(nèi)菌株對石油烴的降解率為82%，石油烴含量由5 g·kg-1降低至0.9 g·kg-1。其中對短鏈烷烴（C10～C28）和長鏈烷烴（C30～C40）的降解率分別為88%，72%，半衰期分別為9.9 d和17.3 d，且SY-3對短鏈烷烴（C10～C28）的降解速率是長鏈烷烴（C30～C40）的1.75倍。相較于長鏈烷烴，短鏈烷烴更易被SY-3菌生物降解。

（3）SY-3菌株在最適降解條件下的無機鹽&石油烴培養(yǎng)基中的生長趨勢符合Logistic模型，呈“S”型增長，相關(guān)性達0.970 2，SY-3降解石油烴并利用其作為碳源以促進自身生長。當石油烴初始含量小于34.47 g·kg-1時，其降解動力學(xué)符合Monod方程，半飽和常數(shù)Ks=1.24 g·kg-1，最大反應(yīng)速率vmax=3.24 g·（kg·d）-1。

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