鞠曉紅,王月華,方 芳
PE_PGRS亞家族是分枝桿菌屬細(xì)菌特有蛋白,絕大多數(shù)只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,部分可在其他致病性分枝桿菌表達(dá),如海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌等[1]。因其N端有高度保守的脯氨酸-谷氨酸(Proline-Glutamic,PE)基序、C端富含多態(tài)性的鳥嘌呤胞嘧啶重復(fù)序列(polymorphic guanine cytosine rich repeat sequence,PGRS)而得名,是一個(gè)功能極其復(fù)雜的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的多態(tài)性蛋白家族,包括60多個(gè)成員。雖然近年來(lái)研究證實(shí)一些家族成員與結(jié)核分枝桿菌的致病性與毒力密切相關(guān),在研發(fā)新型疫苗和抗結(jié)核治療方面表現(xiàn)出巨大潛力[2-5]。但迄今為止的多數(shù)研究只集中于少數(shù)幾個(gè)成員的結(jié)構(gòu)和功能,大多數(shù)成員在致病性和生物學(xué)功能方面的作用仍不清楚。眾多成員中,最具代表性的是PE_PGRS33蛋白,有許多獨(dú)特功能,同時(shí)也是研究得較為深入的一個(gè)成員。本文就將近年來(lái)有關(guān)PE_PGRS33的研究進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述,以期為今后進(jìn)一步研究該家族蛋白的生物學(xué)功能、致病機(jī)制及基因調(diào)控機(jī)制等提供參考,為利用PE_PGRS蛋白開發(fā)新型疫苗和診斷試劑及治療策略提供依據(jù)。
PE_PGRS33蛋白由Rv1818c基因編碼,Rv1818c基因位于結(jié)核分枝桿菌H37Rv的2061178~2062674之間,全長(zhǎng)1 497 bp,GC含量高達(dá)78.16%。編碼的PE_PGRS33蛋白是一種穩(wěn)定的疏水蛋白,位于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁上,暴露于細(xì)胞表面。蛋白全長(zhǎng)498個(gè)氨基酸,分子量約41 kDa,共有19種氨基酸組成,其中甘氨酸約占41%,丙氨酸約占20%。完整蛋白由3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,分別是N端的PE結(jié)構(gòu)域(PE domain)、C端的PGRS結(jié)構(gòu)域(PGRS domain)和連接二者的一段短的連接區(qū)(linker region,LR),也有學(xué)者將其稱為過渡區(qū)(transition domain)或跨膜區(qū)(transmembrane region)(圖1)。但生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示[6],PE_PGRS33蛋白無(wú)跨膜螺旋,全部存在于膜外側(cè)。PE結(jié)構(gòu)域含100個(gè)氨基酸殘基,高度保守,第8位和第9位是PE家族蛋白的標(biāo)志性基序Proline-Glutamic(PE);PGRS結(jié)構(gòu)域含357個(gè)氨基酸殘基,富含甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列(GGAGG),極具多態(tài)性,主要表現(xiàn)在大小、氨基酸序列和重復(fù)片段的數(shù)量上;過渡區(qū)是一段高度保守序列,含41個(gè)氨基酸殘基[7]。生物信息學(xué)分析,PE_PGRS33蛋白含有5個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn),有27個(gè)B淋巴細(xì)胞抗原表位和4個(gè)T淋巴細(xì)胞抗原表位;結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有85個(gè)α-螺旋、111個(gè)β-折疊、52個(gè)β-轉(zhuǎn)角和250個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲,結(jié)構(gòu)較為松散[6]。
圖1 PE_PGRS33蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖Fig.1 Schematic of PE_PGRS33 protein domains
PE_PGRS33蛋白介導(dǎo)的典型毒力特征依賴于其結(jié)構(gòu)的完整性,三者缺一不可。PE結(jié)構(gòu)域的主要功能有二:一是將蛋白經(jīng)由ESX分泌系統(tǒng)(EAST-6 secretion system,ESX)定向轉(zhuǎn)位至細(xì)胞壁,使PGRS結(jié)構(gòu)域暴露于細(xì)胞表面;二是提供T淋巴細(xì)胞識(shí)別表位,激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。PGRS結(jié)構(gòu)域的作用多樣而復(fù)雜,是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要功能區(qū),與致病和免疫逃逸密切相關(guān)。作為細(xì)胞表面暴露部分,PGRS結(jié)構(gòu)域首先觸發(fā)天然免疫應(yīng)答,如刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細(xì)胞,在細(xì)菌的持續(xù)性感染和致病中發(fā)揮作用;包含多個(gè)B細(xì)胞抗原表位,激發(fā)體液免疫應(yīng)答。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間連接區(qū)的確切功能尚不清楚,有研究顯示可能與細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞后PE_PGRS33蛋白定位于宿主細(xì)胞線粒體有關(guān)。全長(zhǎng)PE_PGRS33基因轉(zhuǎn)染人橫紋肌肉瘤細(xì)胞24 h后,染色發(fā)現(xiàn)表達(dá)的蛋白定位于細(xì)胞線粒體。進(jìn)一步構(gòu)建不同長(zhǎng)度基因片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn),缺失PE和PGRS結(jié)構(gòu)域之間41個(gè)氨基酸連接區(qū)后,蛋白不能在線粒體上定位,說明連接區(qū)是蛋白線粒體定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),推測(cè)連接區(qū)可能包含某種特定定位信號(hào)或是引導(dǎo)蛋白正確移位和折疊的必須序列[8]。
2.1分泌途徑 同大多數(shù)PE_PGRS家族成員缺乏典型分泌信號(hào)的特征一樣,PE_PGRS33也無(wú)蛋白信號(hào)肽,然而在細(xì)胞質(zhì)中合成的蛋白,最終卻表達(dá)于細(xì)胞壁表面,說明結(jié)核分枝桿菌能另辟蹊徑將胞內(nèi)合成的PE_PGRS33蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。研究發(fā)現(xiàn)[9-10],與PE_PGRS蛋白分泌有關(guān)的是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種新型分泌系統(tǒng)-Ⅶ型分泌系統(tǒng)(type VII secretion systems,T7SS),也被稱為ESX系統(tǒng),在結(jié)核分枝桿菌中存在5種ESX,分別命名為ESX-1~ESX-5,參與胞內(nèi)PE_PGRS蛋白分泌的主要是在進(jìn)化上出現(xiàn)較晚的ESX-5,推測(cè)PE_PGRS蛋白可能是ESX-5的特異底物。將攜帶PE_PGRS33基因的質(zhì)粒分別導(dǎo)入海分枝桿菌野生株E11和ESX-5突變株7CI中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESX-5缺失的突變株不能將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面,從而證實(shí)PE_PGRS33也是ESX-5的特異底物[7]。但與結(jié)核分枝桿菌不同的是海分枝桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)到胞壁的PE_PGRS33蛋白分子量明顯降低,推測(cè)在海分枝桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中蛋白可能經(jīng)過加工處理。Burggraaf等[11]研究海分枝桿菌質(zhì)粒表達(dá)PE_PGRS蛋白的分泌中發(fā)現(xiàn),C端具有天冬氨酸蛋白酶活性的PE_PGRS蛋白(如PE_PGRS35),包含典型的DTG/DSG序列,在運(yùn)送過程中先被加工裂解,然后再表達(dá)在細(xì)胞表面。由于海分枝桿菌不天然表達(dá)PE_PGRS33蛋白,可能在菌體內(nèi)的運(yùn)輸處理過程與結(jié)核分枝桿菌存在差異。
2.2亞細(xì)胞定位 完整表達(dá)的PE_PGRS33蛋白定位于結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁,PE區(qū)起錨定作用嵌埋在胞壁外膜上,PGRS結(jié)構(gòu)域暴露于細(xì)胞表面,負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞相互作用,未發(fā)現(xiàn)分泌至胞外可溶形式存在的蛋白。只有PE結(jié)構(gòu)域而無(wú)PGRS結(jié)構(gòu)域的蛋白能在細(xì)胞壁上檢測(cè)到但不能暴露于細(xì)胞外,反之只有PGRS結(jié)構(gòu)域則只能在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到,進(jìn)一步證實(shí)了PE結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)將胞質(zhì)內(nèi)合成的PE_PGRS33蛋白轉(zhuǎn)位至細(xì)胞壁的功能[7]。侵入巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的PE_PGRS33蛋白可能經(jīng)過MHC-Ⅰ類和Ⅱ類途徑經(jīng)過抗原提呈以MHC-肽段的形式表達(dá)于感染細(xì)胞表面,被T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞識(shí)別,在特異性細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮作用[12]。
重組恥垢分枝桿菌表達(dá)不同長(zhǎng)度PE_PGRS33蛋白的結(jié)果顯示,PE結(jié)構(gòu)域全部缺失菌株只能在胞質(zhì)中檢測(cè)到不完整PE_PGRS33蛋白,表達(dá)全長(zhǎng)蛋白的菌株可在胞質(zhì)和胞壁上同時(shí)檢測(cè)到PE_PGRS33蛋白,在細(xì)菌培養(yǎng)上清液中均檢測(cè)不到PE_PGRS33蛋白,說明PE_PGRS33不是分泌型蛋白,屬于細(xì)胞壁上的結(jié)合蛋白,蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)存在于PE結(jié)構(gòu)域。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),缺失PE結(jié)構(gòu)域最初30個(gè)氨基酸的菌株,蛋白同樣定位于胞質(zhì)中,在胞壁上僅有極少量蛋白表達(dá),提示轉(zhuǎn)位信號(hào)存在于蛋白最前端的30個(gè)氨基酸中,下游氨基酸維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[7]。目前尚未獲得PE_PGRS33蛋白PE結(jié)構(gòu)域的確切構(gòu)象,研究最為清楚的PE結(jié)構(gòu)域來(lái)源于該家族的獨(dú)特成員PE25(僅有PE結(jié)構(gòu)域,與其后的PPE41形成異源二聚體),考慮到PE結(jié)構(gòu)域的高度保守性,推測(cè)PE_PGRS33蛋白應(yīng)該具有相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。PE25的PE結(jié)構(gòu)域有兩個(gè)α-螺旋,分別位于8~37位氨基酸和45~84位氨基酸之間,由38~44之間一段成環(huán)狀的氨基酸連接[13]。結(jié)合PE_PGRS33蛋白缺失N端最初30個(gè)氨基酸不能轉(zhuǎn)位到細(xì)胞壁上的事實(shí),推測(cè)第1個(gè)α-螺旋直接參與將蛋白輸送至ESX-5分泌系統(tǒng)并最終將其錨定在細(xì)胞壁上,第2個(gè)α-螺旋和環(huán)狀連接區(qū)維持完整蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性。
在天然表達(dá)PE_PGRS33蛋白的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG)和結(jié)核分枝桿菌的研究中同樣發(fā)現(xiàn),缺失PE結(jié)構(gòu)域的菌株蛋白主要存在于胞質(zhì)中,但表達(dá)完整PE_PGRS33的結(jié)核分枝桿菌,只能在胞壁上檢測(cè)到蛋白,不同于恥垢分枝桿菌,說明在野生型菌株胞質(zhì)中合成的蛋白全部轉(zhuǎn)位至細(xì)胞壁,不會(huì)在胞質(zhì)中積聚。據(jù)此推測(cè),在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群可能存在PE_PGRS33蛋白合成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,不會(huì)合成過量的PE_PGRS33蛋白使其積聚,這也可能是細(xì)菌在不同生長(zhǎng)環(huán)境和生長(zhǎng)階段差異性表達(dá)該蛋白的原因之一。
PE_PGRS33蛋白組成性表達(dá)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,不具有家族其他成員還能表達(dá)于海分枝桿菌的特性,是結(jié)核分枝桿菌在進(jìn)化過程中獲得的一組Rv1818c基因編碼的毒力因子,暴露于細(xì)胞表面,在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下差異性表達(dá),與結(jié)核分枝桿菌的致病性密切相關(guān),影響著疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸[14-15]。實(shí)驗(yàn)室菌株H37Rv、減毒株BCG、臨床菌株CDC1551和臨床分離株中表達(dá)的PE_PGRS33存在明顯多樣性,主要表現(xiàn)為PGRS結(jié)構(gòu)域重復(fù)序列的數(shù)量、氨基酸種類和序列差異,如H37Rv、BCG、CDC1551分別有21、26、32個(gè)GGAGG重復(fù)序列。
PE_PGRS33蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上受Sigma因子調(diào)控,參與調(diào)控的主要有Sigma A、Sigma B和Sigma D[16]。PE_PGRS33起始密碼為ATG,終止密碼為TAG,5′-RACE分析顯示,轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于PE結(jié)構(gòu)域上游5′端距ATG 75個(gè)核苷酸處,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游7個(gè)核苷酸位置有典型的-10區(qū)序列(TACGCT),未發(fā)現(xiàn)-35區(qū)序列,在假定的-35區(qū)附近出現(xiàn)一個(gè)多聚A拉伸(poly-A stretch)。轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn),Sigma A識(shí)別PE_PGRS33蛋白的啟動(dòng)子,促進(jìn)基因表達(dá)。在啟動(dòng)子區(qū)還存在一個(gè)操縱序列,能被誘導(dǎo)阻遏蛋白識(shí)別,在應(yīng)激條件下參與蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié),如當(dāng)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)或暴露于營(yíng)養(yǎng)匱乏及低氧等不利環(huán)境時(shí),阻遏蛋白通過某種途徑被誘導(dǎo)表達(dá),下調(diào)PE_PGRS33的轉(zhuǎn)錄水平。Sigma B促進(jìn)基因表達(dá),在Sigma B過表達(dá)菌株,PE_PGRS33表達(dá)顯著增加。Sigma D可能通過直接或間接驅(qū)動(dòng)誘導(dǎo)性阻遏蛋白表達(dá),從而抑制PE_PGRS33表達(dá),在Sigma D突變株P(guān)E_PGRS33表達(dá)明顯上調(diào)。SigmaD在穩(wěn)定生長(zhǎng)期和營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)表達(dá)上調(diào),PE_PGRS33與之正好相反。但低氧環(huán)境時(shí),二者均表達(dá)下調(diào),說明在結(jié)核分枝桿菌中還存在其他的調(diào)控機(jī)制,需要進(jìn)一步深入探討。
PE_PGRS33蛋白在基因水平存在廣泛變異,是結(jié)核分枝桿菌抗原變異的重要原因。以堿基的插入、刪除和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)為主,突變主要集中于PGRS結(jié)構(gòu)域,所有插入序列均位于PGRS結(jié)構(gòu)域,影響到1至多個(gè)重復(fù)序列,移碼突變只有1個(gè),余者均為非移碼突變[17-18],說明在菌體內(nèi)存在選擇壓力來(lái)維持基因開放讀碼框的穩(wěn)定性,據(jù)此可以推測(cè)PE_PGRS33蛋白在結(jié)核分枝桿菌生存中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。突變集中于PGRS結(jié)構(gòu)域的原因可能是在重復(fù)序列的復(fù)制和重組過程中,發(fā)生滑鏈錯(cuò)配(replicationslippage)。Camassa等[18]研究135株臨床菌株發(fā)現(xiàn),PE_PGRS33基因變異的dN/dS為0.64,屬于純化突變,進(jìn)一步證實(shí)PE_PGRS33的基因多態(tài)性可能損害結(jié)核分枝桿菌的重要功能,因此菌體內(nèi)存在負(fù)向選擇壓力,對(duì)抗有害突變。插入堿基范圍9~270 bp,均為非移碼突變;刪除堿基大小在1~363 bp之間,唯一發(fā)生的移碼突變是在1 014 bp處刪除1bp(-1 bp),刪除后基因繼續(xù)編碼36個(gè)氨基酸后提早出現(xiàn)終止密碼,丟失后續(xù)C端的160個(gè)氨基酸,其中包含12個(gè)重復(fù)序列。發(fā)生-1bp突變的菌株毒力明顯降低,可能與C末端258 bp保守序列丟失有關(guān)。突變頻率最高的位點(diǎn)是717 bp處發(fā)生TC的同義突變;其次是1 240 bp處插入9 bp,增加1個(gè)甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列,二者同時(shí)突變占25.4%[19]。移碼突變和大片段的非移碼突變損害結(jié)核分枝桿菌侵入人類巨噬細(xì)胞能力,但不影響細(xì)菌在胞內(nèi)的生存繁殖和蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用,可能是結(jié)核分枝桿菌持續(xù)性感染階段發(fā)生組織損傷和成人肺結(jié)核缺乏空洞的主要原因。值得注意的是,在兒童和肺外結(jié)核病中,PE_PGRS33基因的多態(tài)性不影響結(jié)核分枝桿菌毒性,但能限制細(xì)菌的高效傳播[18]。
臨床菌株P(guān)E結(jié)構(gòu)域基因突變以SNP為主,同義和非同義突變各占50%,在131~133 bp處發(fā)現(xiàn)1個(gè)刪除突變[19]。結(jié)構(gòu)域的功能研究中發(fā)現(xiàn)[7],PE結(jié)構(gòu)域N端的2、3位氨基酸發(fā)生SF→AA(絲氨酸苯丙氨酸→丙氨酸丙氨酸)變異和8、9氨基酸發(fā)生PE→AA(脯氨酸谷氨酸→丙氨酸丙氨酸)變異后,不影響PE_PGRS33蛋白表型,但蛋白在細(xì)胞壁表達(dá)的穩(wěn)定性明顯降低。推測(cè)可能的原因有二:一是這兩個(gè)部位的氨基酸參與PE結(jié)構(gòu)域的錨定功能,變異后錨定不牢固致使胞壁蛋白不穩(wěn)定;二是變異后可能改變了PE_PGRS33蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)或空間構(gòu)象,進(jìn)而影響了蛋白的穩(wěn)定性。
分析上述PE_PGRS33蛋白的變異特征不難發(fā)現(xiàn),在多種類型的變異中對(duì)結(jié)核分枝桿菌影響最大的是1 014 bp處發(fā)生的移碼突變,其次是1 240 bp處的插入突變,雖然不同程度影響了結(jié)核分枝桿菌的毒力和入侵宿主細(xì)胞的能力,但對(duì)細(xì)菌生存能力影響甚微,結(jié)合dN/dS小于1(0.64)的研究結(jié)果,證實(shí)在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)存在負(fù)向選擇壓力,迫使其發(fā)生純化突變,印證了PE_PGRS33蛋白對(duì)于維持結(jié)核分枝桿菌功能的重要價(jià)值。進(jìn)一步需要深入探討的是臨床分離菌株P(guān)E_PGRS33基因發(fā)生不同變異后,對(duì)細(xì)菌與巨噬細(xì)胞的相互作用及逃避宿主免疫防御能力的影響,明確基因多態(tài)性與臨床表型的關(guān)系,作為今后研究其在臨床菌株中功能差異的基礎(chǔ)。
PE_PGRS33蛋白的致病機(jī)制主要是通過調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)逃避殺傷,為細(xì)菌生存贏得空間和時(shí)間、加重組織細(xì)胞損傷、促進(jìn)細(xì)菌擴(kuò)散。PE_PGRS33蛋白發(fā)揮作用的關(guān)鍵是依賴PGRS結(jié)構(gòu)域直接與巨噬細(xì)胞表面的Toll 樣受體2(Toll-like receptors 2,TLR-2)結(jié)合,通過TLR-2誘導(dǎo)細(xì)菌入侵細(xì)胞、活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor,NF-κB)轉(zhuǎn)錄釋放多種炎性細(xì)胞介質(zhì),并能定位宿主細(xì)胞線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖2)。細(xì)菌侵入細(xì)胞后,PE_PGRS33蛋白能抑制吞噬溶酶體形成、提升結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)存活能力,與結(jié)核病的持續(xù)性感染有關(guān)。
圖2 PE_PGRS33蛋白致病機(jī)制示意圖Fig.2 Schematic of PE_PGRS33 protein pathogenesis
5.1介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細(xì)胞 非致病的恥垢分枝桿菌重組表達(dá)PE_PGRS33后表現(xiàn)出結(jié)核分枝桿菌的典型毒力特征,能侵入巨噬細(xì)胞,在巨噬細(xì)胞和宿主組織中的存活能力明顯增強(qiáng)。Rv1818c基因發(fā)生轉(zhuǎn)座子Tn5367插入突變的菌株,在液體培養(yǎng)基失去聚集生長(zhǎng)的能力呈分散生長(zhǎng),侵入巨噬細(xì)胞和胞內(nèi)存活能力下降,回補(bǔ)完整Rv1818c基因后回復(fù)野生型的毒力特征。PE_PGRS33基因缺失株(Mtb-Δ33)和只表達(dá)PE結(jié)構(gòu)域的菌株,進(jìn)入巨噬細(xì)胞的能力顯著下降,主要存在于細(xì)胞外,但侵入上皮細(xì)胞的能力不受影響[18]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TLR-2缺失小鼠用表達(dá)PE_PGRS33的恥垢分枝桿菌感染后,細(xì)菌亦不能進(jìn)入巨噬細(xì)胞,腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factors α,TNF-α)的釋放水平極低,由此說明暴露于結(jié)核分枝桿菌表面的PE_PGRS33蛋白主要借助PGRS結(jié)構(gòu)域與巨噬細(xì)胞表面的TLR-2特異結(jié)合[20-21]。推測(cè)PE_PGRS33介導(dǎo)細(xì)菌侵入巨噬細(xì)胞可能的機(jī)制有兩個(gè):一是PE_PGRS33蛋白可能類似于病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMP),能被巨噬細(xì)胞的模式識(shí)別受體(patern recognition receptor,PRR)TLR識(shí)別,促進(jìn)內(nèi)化;二是結(jié)核分枝桿菌表面成分復(fù)雜,有脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖及其他非蛋白成分,PE_PGRS33蛋白與這些表面成分相互作用,形成適合細(xì)菌黏附的空間構(gòu)象,增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌的黏附能力,促進(jìn)細(xì)菌侵入。另外,TLR-2介導(dǎo)的細(xì)菌內(nèi)吞與Ca2+濃度亦密切相關(guān),PE_PGRS家族普遍存在鈣結(jié)合基序蛋白,與Ca2+高親和,當(dāng)Ca2+濃度耗盡時(shí),PE_PGRS與TLR-2親和力顯著降低[22-23]。
5.2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞死亡的形式有3種:凋亡、自噬和壞死。PE_PGRS家族不同成員誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式不同,同一種死亡方式誘導(dǎo)途徑亦不相同[24]。PE_PGRS33誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡以凋亡為主,主要途徑是TLR-2依賴的刺激TNF-α釋放。至于能否誘導(dǎo)細(xì)胞壞死目前尚存分歧,有待深入研究。
可溶性的純化PE_PGRS33和表達(dá)于細(xì)胞壁表面的PE_PGRS33可同樣誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。刺激TNF-α分泌是PE_PGRS33誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵,如事先用TNF-α抗體處理細(xì)胞,則細(xì)胞不發(fā)生凋亡。PE_PGRS33介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細(xì)胞和刺激細(xì)胞釋放TNF-α的能力均依賴TLR-2[21]。PGRS結(jié)構(gòu)域與TLR-2特異結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)TNF-α基因表達(dá),刺激TNF-α分泌,同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1),TNF-α與TNFR1結(jié)合觸發(fā)死亡信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。刪除PGRS結(jié)構(gòu)域后,不能刺激TNF-α釋放。通過構(gòu)建PGRS結(jié)構(gòu)域不同基因片段缺失變異體回補(bǔ)Mtb-Δ33發(fā)現(xiàn),介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌侵入巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵序列位于N端140~260個(gè)氨基酸之間,該片段的許多疏水區(qū)存在短的親水片段插入,可能是TLR-2的結(jié)合位點(diǎn)[21]。誘導(dǎo)TNF-α釋放的信號(hào)通路為TLR-2依賴的凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apotosis signal-regulating kinase 1,ASK1)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路。TLR-2與PE_PGRS33的PGRS結(jié)構(gòu)域結(jié)合后,激活下游MAP3K家族的ASK1,活化的ASK1繼而激活MAPK家族的p38蛋白和c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK),通過一系列磷酸化反應(yīng)促使NF-κB活化,最終觸發(fā)包括TNF-α在內(nèi)的多種細(xì)胞因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄、釋放。在此過程中,ASK1是p38蛋白和JNK活化的關(guān)鍵。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)信號(hào)抑制劑不能影響TNF-α釋放,p38蛋白和JNK抑制劑均能顯著降低TNF-α的釋放,證實(shí)PE_PGRS33刺激TNF-α釋放依賴于p38蛋白和JNK信號(hào)通路。小鼠和人類巨噬細(xì)胞對(duì)PE_PGRS33蛋白的反應(yīng)有所不同,可能與TLR-2可變區(qū)在小鼠和人類存在多態(tài)性有關(guān)。
結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的PE_PGRS 33蛋白具有定位線粒體的能力,侵入細(xì)胞后通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26-27]。目前研究未發(fā)現(xiàn)PE_PGRS33蛋白有線粒體靶向序列(mitochondrial targeting sequence,MTS),蛋白主要依賴連接區(qū)將PGRS結(jié)構(gòu)域定位于線粒體。與PE_PGRS 33蛋白有55%同源性的PE_PGRS 1不能定位線粒體,提示PE_PGRS 33的PGRS結(jié)構(gòu)域結(jié)合線粒體是特異的,但還不清楚結(jié)核分枝桿菌將蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體上的確切路徑以及信號(hào)傳導(dǎo)的具體機(jī)制,推測(cè)可能通過吞噬逃逸進(jìn)入胞質(zhì)或通過某個(gè)分泌系統(tǒng)與線粒體相互作用的結(jié)果,也可能與TLR-2介導(dǎo)的內(nèi)吞有關(guān)[27]。PE_PGRS 33定位于轉(zhuǎn)染或感染的哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞線粒體后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率明顯下降,凋亡和壞死細(xì)胞顯著增高,其中以凋亡為主。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PE_PGRS 33誘導(dǎo)后細(xì)胞Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(fas-associated death domain,FADD) 蛋白和半胱氨酸蛋白酶(caspase)表達(dá)上調(diào),提示線粒體可能通過死亡受體途徑或caspase8、9、3的依次活化,釋放凋亡信號(hào)誘導(dǎo)凋亡[8]。廣譜caspase 抑制劑ZVAD-FMK、caspase 8抑制劑均能阻斷PE_PGRS 33誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。值得注意的是,缺失PE結(jié)構(gòu)域或替換成家族其他蛋白的PE結(jié)構(gòu)域,雖然在線粒體上也能檢測(cè)到蛋白表達(dá),但不能誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞壞死,說明PE結(jié)構(gòu)域在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞壞死中發(fā)揮重要作用。 另有研究顯示[24],PE_PGRS 33蛋白定位人巨噬細(xì)胞線粒體后誘導(dǎo)線粒體融合,但不影響鈣離子吸收、活性氧釋放和線粒體膜電位。作為線粒體融合蛋白,PE_PGRS 33應(yīng)該正調(diào)控機(jī)體的天然抗菌免疫,但上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明PE_PGRS 33可能通過調(diào)控某種信號(hào)通路抑制宿主的天然免疫應(yīng)答,具體機(jī)制有待研究。
5.3抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答 結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌,主要保護(hù)作用來(lái)源于細(xì)胞免疫,PE_PGRS33蛋白的T淋巴細(xì)胞抗原表位主要存在于PE結(jié)構(gòu)域,刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答。PGRS結(jié)構(gòu)域的重復(fù)序列與EB病毒(Epstern Barr virus,EBV)富含甘氨酸和丙氨酸序列的核抗原1(EBV nuclear antigen EBNA-1)具有明顯同源性,推測(cè)可能有類似于EBNA-1的作用,阻止PE結(jié)構(gòu)域的抗原加工提呈,通過抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答逃避宿主的免疫殺傷,提升細(xì)菌胞內(nèi)存活能力,在結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染(latent tuberculosis infected,LTBI)中發(fā)揮作用。此外,有研究顯示PE_PGRS蛋白家族存在無(wú)序結(jié)構(gòu)區(qū)和無(wú)序蛋白,在與宿主的相互作用中發(fā)生從無(wú)序到有序的結(jié)構(gòu)改變,從而影響宿主的免疫應(yīng)答[28]。PE_PGRS33蛋白是否也具有此種特性尚不清楚,需深入探討。
PE_PGRS33的PGRS結(jié)構(gòu)域是介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌與宿主細(xì)胞相互作用的主要區(qū)域,在結(jié)核的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用,拮抗該結(jié)構(gòu)域的功能可能是抗結(jié)核病治療的新方向。PE結(jié)構(gòu)域具有靶向轉(zhuǎn)位胞內(nèi)蛋白的功能,是構(gòu)建重組DNA疫苗的理想載體。
用重組純化的PE_PGRS33蛋白免疫小鼠后,可在血清中檢測(cè)到特異性抗體IgG,與其他結(jié)核分枝桿菌蛋白無(wú)交叉反應(yīng),再次感染時(shí)可中和PE_PGRS33的促炎活性、抑制細(xì)菌侵入巨噬細(xì)胞。因此,通過檢測(cè)PE_PGRS33蛋白特異的IgG抗體可用于結(jié)核病的快速診斷;利用特異性抗PE_PGRS33抗體可拮抗細(xì)菌與巨噬細(xì)胞相互作用的特性,可通過重組純化蛋白制備特異性抗體用于結(jié)核病的免疫學(xué)治療[29]。此外,基于PE結(jié)構(gòu)域能將C端蛋白靶向轉(zhuǎn)位至細(xì)胞壁的特點(diǎn),可將PE結(jié)構(gòu)域作為轉(zhuǎn)運(yùn)工具,在其C末端融合保護(hù)性抗原MPT64,構(gòu)建重組BCG疫苗(rBCG)。rBCG通過PE將MPT64輸送至細(xì)胞表面,使其成為表面暴露抗原[30]。與BCG相比,接受rBCG免疫的小鼠感染結(jié)核分枝桿菌后,肺和脾中細(xì)菌數(shù)量明顯減少(P<0.05),特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞及釋放IFN-γ水平均明顯增加。由此可見,PE_PGRS33可作為對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌感染的體液免疫的中和靶點(diǎn)或血清學(xué)檢測(cè)的良好指標(biāo),亦可作為理想的候選疫苗加以研發(fā)。
PE_PGRS33蛋白由于其復(fù)雜的生物學(xué)功能及強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用,近年來(lái)成為結(jié)核分枝桿菌研究領(lǐng)域廣為關(guān)注的熱點(diǎn)。PE結(jié)構(gòu)域靶向轉(zhuǎn)位胞內(nèi)蛋白的特性為開發(fā)高效疫苗提供了新方向,PGRS結(jié)構(gòu)域的毒性和特異體液免疫特性為結(jié)核分枝桿菌的治療和診斷提供了新靶點(diǎn)。然而,關(guān)于PE_PGRS33蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路、基因表達(dá)的調(diào)控及與其他蛋白相互作用的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)至今尚未闡明,能高效誘導(dǎo)免疫保護(hù)作用的抗原表位有待明確,蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)目前是生物信息學(xué)分析結(jié)果,真正的空間構(gòu)象尚未闡明。尋找PE_PGRS33蛋白的保護(hù)性和特異性抗原表位、明確決定其毒力的關(guān)鍵序列,是開發(fā)疫苗和開展免疫學(xué)治療對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌耐藥性的重要手段,也是未來(lái)需重點(diǎn)關(guān)注的研究方向。
利益沖突:無(wú)