路殿英，姜 海, 田國忠，楊曉雯，趙鴻雁，樸東日，魏俊妮

布魯氏菌病是由布魯氏菌屬的細(xì)菌侵入機(jī)體后引起的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人獸共患病[1-2]。由于布魯氏菌胞內(nèi)寄生的特點(diǎn)，天然的具有逃避宿主機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫的能力，想要完全的消滅它尚有很長的一段路要走[3]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)了解到布魯氏菌具有除趨化基因外幾乎全部的鞭毛基因，并且有研究表明布魯氏菌在侵入機(jī)體后會有短暫的鞭毛表達(dá)情況[4]。鞭毛蛋白作為革蘭氏陰性菌的主要結(jié)構(gòu)蛋白，當(dāng)其與其它抗原結(jié)合時表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫原性，而布魯氏菌LS蛋白(BLS)是布魯氏菌的一種優(yōu)勢抗原，是由2個五聚體組成的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的十聚體，為光滑型和粗糙型布魯氏菌所共有，用于布魯氏菌的診斷可提高其敏感性；另外BLS可以激發(fā)抗原特異性細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生IFN-γ，從而對宿主產(chǎn)生保護(hù)力，是一種理想的布魯氏菌病亞單位疫苗的候選蛋白。故本研究嘗試表達(dá)布魯氏菌鞭毛鉤蛋白F1gE和融合蛋白BLS-F1gE以期找到布魯氏菌病更合適的診斷抗原。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和血清樣品 羊種布魯氏菌16M核酸由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所布魯氏菌病室保存，pET-30a質(zhì)粒由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所診斷室提供。布病陽性病人血清收集自新疆烏蘭察布旗疾控中心，健康人血清收集自北京市昌平區(qū)疾控中心。

1.2主要試劑 HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG抗體，TMB顯色液購自康為世紀(jì)公司，LB培養(yǎng)基組分(酵母提取物和胰蛋白胨)購自O(shè)xoid公司，BL21感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物公司，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自擎科生物公司，IPTG購自AMRESCO公司，His標(biāo)簽純化試劑盒(可溶性)購自康為世紀(jì)生物公司。

1.3 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

1.3.1表達(dá)鞭毛鉤蛋白FlgE 從NCBI網(wǎng)站下載布魯氏菌鞭毛鉤蛋白基因flgE的基因序列，利用clone manager軟件設(shè)計其兩側(cè)引物以表達(dá)鞭毛鉤蛋白FlgE。引物信息如下：上游引物：5′- GGAATTCATGAGCCTCTACGGTATGATG -3′，下游引物：5′- CCCTCGAGTCTCTTCAGATTAACCAGCACGTC -3′，酶切位點(diǎn)：EcoRⅠ和XhoⅠ。

1.3.2獲得融合基因 從NCBI網(wǎng)站下載布魯氏菌bls的基因序列, 利用clone manager軟件將去除終止子的BLS基因序列與鞭毛基因序列連接，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計兩側(cè)的酶切引物和中間的融合引物,融合引物a與b之間堿基互補(bǔ)且各自含有bls和flgE基因序列的一部分。利用PCR常規(guī)技術(shù)多次擴(kuò)增得到該融合基因序列。引物信息如下：上游引物：5′-CGGGATCCATGAACCAAAGCTGTCCGAAC-3′，下游引物：5′- CCCTCGAGTCTCTTCAGATTAACCAGCACGTC -3′，融合引物a: 5′- CTTGTCATGAGCCTCTACGGTATGATGC-3′，融合引物b: 5′- GCTCATGACAAGCGCGGCGATGCGGCTGC-3′。

1.4雙酶切鑒定、蛋白表達(dá)與純化 將得到的目的基因與質(zhì)粒同時進(jìn)行雙酶切反應(yīng)(37 ℃,2 h),酶切產(chǎn)物使用DNA連接酶連接(16 ℃，過夜)，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按一定比例涂布于具有卡納抗性的培養(yǎng)基上，挑選陽性克隆子，進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定及測序鑒定，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞以供表達(dá)。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET30a-flgE和pET30a-bls-flgE分別調(diào)整蛋白表達(dá)條件予以表達(dá)，對表達(dá)前OD值、溫度、轉(zhuǎn)速、時間等條件進(jìn)行摸索，以最優(yōu)表達(dá)條件大量表達(dá)目的蛋白后使用蛋白純化試劑盒純化目的蛋白。

1.5Western Blot驗證 選取1 mL誘導(dǎo)表達(dá)后的目的蛋白菌液，以同樣條件誘導(dǎo)的空載體菌液，超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，應(yīng)用廣譜彩虹預(yù)染蛋白marker,跑膠結(jié)束后進(jìn)行常規(guī)Western Blot實驗，TBST作為常規(guī)洗液，5%馬血清作為封閉液，以陽性病人血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗人(IgG)作為二抗，DAB顯色液(HRP)最終顯色。

1.6 重組抗原的ELISA檢測

1.6.1抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 將純化后的重組蛋白用包被液梯度稀釋為2 g/mL、4 g/mL、6 g/mL、8 g/mL、10 g/mL和12 g/mL；已知陽性布病血清和健康人血清分4個稀釋度1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。計算陽性血清孔與陰性血清孔的平均OD450值之比(P/N),P/N值最大且陽性血清孔OD450值接近1時所對應(yīng)的抗原包被濃度和陰陽性血清對照的稀釋度為最佳條件，確定最終蛋白質(zhì)包被濃度和血清稀釋度。檢測的其他條件為：封閉液選取5%脫脂奶粉，酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為5 000倍，TMB底物作用時間為15 min。

1.6.2封閉液的選取 分別用5%馬血清、5%馬血清+2% Tween-20、5%脫脂奶粉和5%脫脂奶粉+2% Tween-20共4 種封閉液，4 ℃封閉過夜，分別檢測其OD450值， P/N值最大且陽性血清孔OD450值接近1時即為最佳封閉液。

1.6.3酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)與TMB底物顯色時間的確定 酶標(biāo)二抗的稀釋度分別為1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000，確定P/N值最大時且陽性血清孔OD450值接近1 時為酶標(biāo)二抗最佳稀釋度；按已確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度進(jìn)行ELISA，底物的顯色時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min、確定P/N值最大且陽性血清孔OD450值接近1 時為底物最佳顯色時間。

1.6.4陰陽性臨界值的確定 選取臨床采集的病原學(xué)分離培養(yǎng)判定為陰性的42 份血清作為ELISA方法判定陰陽性臨界值的陰性血清。根據(jù)公式：陰陽性臨界值=陰性樣品OD450值平均值+2.58×標(biāo)準(zhǔn)差，計算陰陽性臨界值。

1.6.5臨床樣品血清檢測 對46 份布病陽性血清和46 份健康人血清分別進(jìn)行常規(guī)檢測(試管凝集實驗)和ELISA檢測，比較結(jié)果，確定此次建立的iELISA方法的靈敏度、特異度和符合率。

2 結(jié) 果

2.1目的基因PCR結(jié)果 應(yīng)用設(shè)計好的PCR反應(yīng)體系和程序，添加對應(yīng)引物，目的基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1。其片段大小與預(yù)計長度相符。flgE片段長度為1 191 bp；bls-flgE片段長度為1 668 bp，條帶較為明顯。

M為DNA marker；a為flgE；b為bls-flgE圖1 重組蛋白基因片段擴(kuò)增Fig.1 Amplification of recombinant proteins gene fragment

2.2重組質(zhì)粒酶切結(jié)果 對菌落PCR鑒定陽性的克隆子進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定。酶切結(jié)果見圖2，載體和目的基因處在預(yù)期的位置，載體構(gòu)建成功。

M為DNA marker；a和b分別為flgE、bls-flgE雙酶切鑒定結(jié)果圖2 蛋白重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of protein recombitant plasmid

2.3蛋白表達(dá)結(jié)果 將插入質(zhì)粒的BL21重組大腸桿菌在160 r/min，27 ℃、30 ℃、32 ℃及0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L IPTG濃度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)的重組蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析，鞭毛鉤蛋白FlgE的最佳誘導(dǎo)條件為27 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度，此條件下表達(dá)蛋白主要以可溶性狀態(tài)存在，而融合蛋白BLS-FlgE的最佳誘導(dǎo)條件為32 ℃、0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度，此條件下表達(dá)蛋白主要以可溶性狀態(tài)存在。經(jīng)過鎳柱純化后大部分雜蛋白被去除，最后得到的蛋白純度較高。見圖3。

A(插入pET30a-flgE質(zhì)粒)：M為Marker；a1為27 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)18 h的全菌蛋白；a2為30 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)18 h的全菌蛋白；a3為32 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)18 h的全菌蛋白；a0為純化后的FlgE蛋白。B(插入pET30a-bls-flgE質(zhì)粒)：M為Marker；b1為27 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)18 h的全菌蛋白；b2為30 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)18 h的全菌蛋白；b3為32 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)18 h的全菌蛋白；b0為純化后的BLS-FlgE蛋白。圖3 SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)與純化情況Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of flagellar protein

2.4重組蛋白鑒定結(jié)果 以布魯氏菌病陽性病人血清為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗人IgG作為二抗進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示FlgE蛋白和BLS-FlgE蛋白均能與陽性病人血清反應(yīng)，具有抗原性，分別在41 kDa和58 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，見圖4。

M為maker；a和b分別為FlgE和BLS-FlgE WB鑒定結(jié)果圖4 重組蛋白與病人陽性血清Western blot檢測結(jié)果Fig.4 Western blot of recombinant proteins against human positive serum samples

2.5以重組蛋白為包被抗原的檢測方法的建立 確定重組鞭毛鉤蛋白FlgE最佳包被濃度為12 g/mL，血清最佳稀釋度為1∶50，5%脫脂奶+0.1%Tween-20為最佳封閉液，酶標(biāo)二抗的最佳工作稀釋度為4 000倍，底物最佳顯色時間為10 min，結(jié)果見表1—4。檢測42份陰性血清，計算得出，平均OD450的值為0.380，標(biāo)準(zhǔn)差(s)為0.063，陰陽性臨界值為0.543。因此，確定被檢血清樣品的OD450≥0.543即判定為陽性，OD450<0.543即可被判定為陰性。

表1 采用不同抗原包被濃度和血清稀釋度進(jìn)行ELISA得到的P/N值Tab.1 P/N values obtained by ELISA using different antigen coating concentrations and serum dilutions

表2 采用不同封閉液進(jìn)行的ELISA得到的P/N值Tab.2 P/N values obtained by ELISA using different blocking solutions

表3 采用不同底物顯色時間進(jìn)行的ELISA得到的P/N值Tab.3 P/N values obtained by ELISA using different substrate coloring time

表4 采用不同二抗稀釋度進(jìn)行的ELISA得到的P/N值Tab.4 P/N values obtained by ELISA with different dilutions of secondary antibodies

同樣的流程下確定重組融合蛋白BLS-FlgE最佳包被濃度為10 g/mL，血清最佳稀釋度為1∶100，5%脫脂奶+0.1%Tween-20為最佳封閉液，酶標(biāo)二抗的最佳工作稀釋度為2 000倍，底物最佳顯色時間為15 min。檢測42 份陰性血清，計算得出，平均OD450的值為0.356，標(biāo)準(zhǔn)差(s)為0.058，陰陽性臨界值為0.506。因此，確定被檢血清樣品的OD450≥0.506即可被判定為陽性，OD450<0.506即可被判定為陰性。

2.6臨床血清樣品的檢測 如表5所示，以試管凝集法作為參照標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)lgE蛋白和BLS-FlgE蛋白單獨(dú)作為布病診斷抗原表現(xiàn)出靈敏度和特異度均低的特點(diǎn)。

表5 兩重組蛋白ELISA法評價指標(biāo)結(jié)果Tab.5 Evaluation results of two recombinant proteins by ELISA

3 討 論

病原分離和鑒定是布魯氏菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其要求條件高，各項操作均須在P3實驗室進(jìn)行，費(fèi)時費(fèi)力，過程繁瑣，所以一般不用此方法檢測診斷。如今已經(jīng)出現(xiàn)許多布魯氏菌血清學(xué)檢測方法，有20 種以上，其中大多數(shù)原理是檢測布魯氏菌表面的脂多糖抗原，如試管凝集試驗、虎紅平板凝集試驗、緩沖平板凝集試驗、間接ELISA和熒光偏振試驗等[5-8]。

經(jīng)基因組測序發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌具有除趨化基因外所有鞭毛結(jié)構(gòu)基因，并被認(rèn)為屬于隱性遺傳物[9-11]。通過構(gòu)建鞭毛蛋白和保護(hù)性抗原結(jié)合后的融合蛋白，由此方法已經(jīng)產(chǎn)生許多證明有效的診斷試劑。本研究構(gòu)建了flgE、bls-flgE基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均能以可溶性蛋白的形式表達(dá)。優(yōu)化FlgE蛋白誘導(dǎo)條件時發(fā)現(xiàn)，不同的誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)前OD600值等條件下表達(dá)量未出現(xiàn)明顯變化。低溫誘導(dǎo)(27 ℃)表達(dá)量要顯著高于高溫誘導(dǎo)(32 ℃)，這可能是因為溫度高會使表達(dá)物大量降解的關(guān)系。對于BLS-FlgE蛋白，不同誘導(dǎo)條件的摸索蛋白表達(dá)產(chǎn)量未有明顯變化。經(jīng)過Western Blot的鑒定，F(xiàn)lgE蛋白與BLS-FlgE蛋白均能被布病陽性病人血清識別，說明其具有良好的免疫原性，為之后建立布病新的診斷方法奠定了基礎(chǔ)。然而通過ELISA檢測法與常規(guī)檢測法對比，該診斷方法靈敏度和特異度均較低，整體符合率低，免疫診斷價值較低，均不適合單獨(dú)作為診斷抗原。但以BLS-FlgE融合蛋白作為包被抗原建立的ELISA法特異度要高于以FlgE蛋白作為包被抗原建立的ELISA法，推測BLS蛋白在一定程度上可增加融合蛋白的免疫原性。

根據(jù)本研究建立的重組抗原的iELISA方法檢測樣品，與常規(guī)布魯氏菌病血清學(xué)方法相比檢測結(jié)果差異較大，靈敏度和特異度均較低，分析其原因可能有以下幾點(diǎn)：①人群中存在潛伏感染者影響結(jié)果；②蛋白抗原純度不夠、等電點(diǎn)不合適等因素；③優(yōu)化條件不完善。下一步應(yīng)提高抗原純度，進(jìn)一步優(yōu)化條件，并根據(jù)金標(biāo)準(zhǔn)來評價本檢測方法，與常規(guī)血清學(xué)方法等結(jié)果比較做出系統(tǒng)的評價。

利益沖突：無