葉 蕾，李浩榕

（上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院內分泌代謝科 上海市內分泌代謝病研究所上海市內分泌腫瘤重點實驗室，上海 200025）

甲狀腺結節(jié)在臨床非常常見，采用觸診方式，其檢出率即可達4%～8%，而采用高分辨率B 超檢查則可在高達68%的人群中檢出甲狀腺結節(jié)。女性和老年人群的甲狀腺結節(jié)患病率更高[1-2]，其中7%～15%為甲狀腺癌[3-4]。甲狀腺結節(jié)按其生物學行為可分為良性、交界性、惡性三大類。良性甲狀腺結節(jié)包括結節(jié)性甲狀腺腫、炎性結節(jié)、甲狀腺囊腫、濾泡性腺瘤等；惡性甲狀腺結節(jié)分為濾泡上皮來源和濾泡旁細胞來源，濾泡上皮來源又可根據其分化程度分為分化型甲狀腺癌、低分化型甲狀腺癌和未分化型甲狀腺癌。其中，分化型甲狀腺癌包括甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid,PTC）和濾泡狀甲狀腺癌 （follicular thyroid cancer,FTC）2 種亞型，PTC 是最常見的甲狀腺惡性腫瘤。濾泡旁細胞來源的惡性結節(jié)即為甲狀腺髓樣癌，由于其分泌降鈣素，可由血清檢測檢出，相對容易診斷。

甲狀腺結節(jié)診治的關鍵點是良惡性的鑒別。目前，術前鑒別甲狀腺結節(jié)良惡性的金標準方法是在超聲引導下細針穿刺抽吸活檢（fine-needle aspiration biopsy，FNAB）聯合細胞學檢查。FNAB 檢查已經使得甲狀腺結節(jié)患者術前診斷出甲狀腺癌的百分比有了顯著提升[5]。在Bethesda 分級為Ⅵ類的結節(jié)中，甲狀腺癌的百分比高達99%[6]，但目前也仍有約25%的甲狀腺結節(jié)無法通過FNAB 檢查來判斷其良惡性，尤其是Bethesda 分級為Ⅲ～Ⅳ類的結節(jié)，即濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤以及不確定分類的甲狀腺結節(jié)，其中惡性結節(jié)占6%～34%。在這種情況下，患者如接受手術，則需承受手術風險以及終身甲狀腺激素替代治療，且其中75%的患者在術后被確診為良性甲狀腺結節(jié)；患者如選擇采用超聲及FNAB 檢查進行隨訪，則需接受潛在的惡性腫瘤患病風險和心理負擔。可見，避免甲狀腺結節(jié)患者接受過度治療的關鍵在于對Bethesda 分級為Ⅲ～Ⅳ類的結節(jié)進行術前診斷。近年，甲狀腺結節(jié)的相關基因檢測進展為甲狀腺結節(jié)良惡性的定性提供了參考。

甲狀腺結節(jié)相關基因的突變及重組

一、甲狀腺癌相關基因的突變

體細胞基因變異是甲狀腺癌發(fā)生的主要原因[7]，與惡性結節(jié)相關的基因變異主要涉及MAPK通路和PI3K 通路，常見的突變基因包括BRAF、RAS、AKT1、PIK3CA、PTEN、TP53 以及RET/PTC 和PAX8/PPARG 基因重組等。學者研究了腫瘤基因組圖譜和中國人群PTC 基因圖譜后發(fā)現，絕大多數PTC 患者的扳機基因發(fā)生了改變，其中最常見的是BRAF V600E 突變,有45%的經典型PTC 以及80%～100%的高細胞亞型PTC 患者存在該突變[8]；其他PTC常見的基因突變還包括RAS、EIF1AX 及RET/PTC基因重組等[7]。而FTC 常見的基因突變則有RAS、DICER1、PAX8/PPARG 基因重組等[9]。甲狀腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma,ATC）中，TERT 基因突變最為常見,出現頻率為55.56%。74.07%的ATC 患者發(fā)生抑癌基因突變，其中TP53 頻率最高，為48.15%[10]。甲狀腺髓樣癌的致病基因為RET，主要以點突變?yōu)橹?。除此之外，miRNA 表達異常、甲基化等表觀遺傳學異常也被證實與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

二、良性甲狀腺結節(jié)相關的基因突變

部分良性甲狀腺結節(jié)也存在體細胞驅動基因變異。在甲狀腺良性結節(jié)中，自主高功能性腺瘤與TSHR、GNAS、EZH1 基因突變有關[11]；腺瘤樣結節(jié)與SPOP、EZH1 與ZNF148 這3 個基因突變有關。良性甲狀腺結節(jié)與惡性甲狀腺結節(jié)之間不僅具有不同的突變譜，兩者的遺傳進化也不相同[12]。值得注意的是，RAS 突變雖然在甲狀腺良惡性結節(jié)中均有出現，但當合并不同其他基因突變時，研究者有不同的解讀意義。

對各類甲狀腺結節(jié)分子機制的深入研究為甲狀腺結節(jié)的分子診斷提供了詳實的依據。2015 年，美國甲狀腺協(xié)會建議將分子診斷納入良惡性甲狀腺結節(jié)鑒別診斷的手段[12]。分子診斷能在FNAB檢查的基礎上，進一步提高惡性甲狀腺結節(jié)術前診斷的準確率，尤其是可提高濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤以及不確定分類的甲狀腺結節(jié)的診斷準確率。

基于體細胞基因的分子診斷

一、單基因分子診斷

1.BRAF：BRAF 基因突變是診斷甲狀腺癌價值最高的基因突變。良性甲狀腺結節(jié)中幾乎不存在BRAF 基因突變，而高達80%的PTC 中存在BRAF V600E 突變。薈萃分析顯示，BRAF V600E 突變檢測診斷PTC 的特異度和陽性預測值均高達100%[13]。在缺乏FNAB 檢查提示的惡性證據時，BRAF V600E 突變強烈提示PTC 可能。除診斷價值外，BRAF V600E 突變可能還與PTC 患者的預后相關。多中心、大樣本隊列研究發(fā)現，存在BRAF V600E突變的PTC 患者死亡風險較無該突變的PTC 患者增加了2.66 倍，而其復發(fā)風險則增加了1.82 倍[14]。但也有研究不支持該結果，因此還需要進一步收集更多的研究數據來明確BRAF 單基因突變預測預后的價值。

2.RAS：RAS 突變雖然是FTC 最常見、PTC 第二常見的基因突變，但其在良性結節(jié)中也存在。因此，如果細胞學檢查提示結節(jié)為良性，而患者存在RAS 單基因突變，建議以隨訪為主，但患者如果還合并有其他基因突變，特別是TERT 啟動子區(qū)、EIF1AX 或TP53 突變時，則預示其為高侵襲性甲狀腺癌的風險明顯增高。

3.TERT：TERT 是具有預后價值的基因，尤其是與BRAF 突變同時存在時，提示患者預后不良。TERT 基因突變在ATC 中最為常見，出現頻率為55.56%。BRAF 與TERT 雙突變則預示PTC 患者的死亡風險將增加9.34 倍，復發(fā)風險增加8.51 倍[15]。因此，聯合檢測BRAF 和TERT 突變具有預后判斷價值。

4.RET：RET 基因重組是PTC 的特征性突變之一，而RET 基因點突變是則甲狀腺髓樣癌的特征性突變。RET/PTC 基因重組在PTC 中的發(fā)生率為6.8%；約25%的甲狀腺髓樣癌患者攜帶胚系RET基因突變，臨床可表現為多發(fā)性內分泌腺瘤病Ⅱ型，故胚系RET 基因突變檢測對多發(fā)性內分泌腺瘤病Ⅱ型具有診斷價值，而75%的散發(fā)MIT 患者存在體細胞RET 基因突變。

總之，單基因的DNA 水平分子診斷成本低、操作方便、解讀簡單。然而，單個基因的診斷價值有限 （如RAS），或者預后判斷價值有限 （如BRAF 或TERT），單個基因突變也不足以同時診斷各類型甲狀腺結節(jié)，還存在樣本量和診斷周期問題。因此，單基因檢測已經不能滿足臨床診斷的需求。

二、多基因分子診斷

隨著高通量測序技術的發(fā)展，針對體細胞基因突變的靶向第二代測序技術開始被應用于不確定分類的甲狀腺結節(jié)FNAB 檢查中。2011 年，匹茲堡大學病理系的Nikiforov 等[16]首次報道了7 個基因的聯合突變檢測，包括BRAF V600E、NRAS codon 61、HRAS codon 61 和KRAS codons 12/13 點突變，以及RET/PTC1、RET/PTC3、PAX8/PPAR 重組，使得陽性預測值達到95%。2013 年，ThyroSeq開始進入大家的視野[17]，第1 版包括了12 個基因（BRAF、NRAS、KRAS、HRAS、CTNNB1、PIK3CA、RET、PTEN、TSHR、AKT1、TP53 與GNAS）。3 年后，第1版本升級為ThyroSeq 第2 版[18]，增加了TERT 熱點變異檢測 （C228T、C250T） 和42 種融合基因檢測（RET、PAX8 融合基因等）。前瞻性研究的數據表明，第2 版對于FNAB 檢查分類為濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤的診斷準確率達到92%[19]。2018 年ThyroSeq 第3 版發(fā)布，增加至112 個基因，除點突變及融合基因之外，其還納入拷貝數變異和基因表達異常。該第3 版基于多基因的 “基因分類器（genomic classifier）” 診斷甲狀腺癌的靈敏度達到98.0%，特異度達81.8%，準確率達到90.9%[20]。之后，美國和加拿大的2 項前瞻性研究均證實其具有高效的診斷價值。美國的多中心、雙盲前瞻性研究納入了286 例FNAB 檢查結果不明確的甲狀腺結節(jié)患者，結果顯示，ThyroSeq 第3 版診斷甲狀腺癌的靈敏度為94%，特異度為82%，良性報告率為61%，在報告為良性的甲狀腺結節(jié)中，僅有3% 惡性風險[21]，這與FNAB 檢查結果為良性的惡性風險一致。加拿大的單中心研究納入了50 例FNAB 檢查結果不明確的病例，結果顯示，ThyroSeq 第3 版的良性報告率為58%，其評估為陽性的24 例樣本，術后病理均為惡性；檢測結果為陰性的26 例患者中有3 例行手術，術后病理檢查提示僅1 例為惡性[22]。

基于RNA 和miRNA 表達的分子診斷

一、基于RNA 的分子診斷

過去，基于RNA 表達的分子診斷，其最大瓶頸是靈敏度不足。直到2010 年，來自Veracyte 公司的Kennedy 博士團隊運用FNAB 檢查結果的基因表達譜數據進行分析，在納入100 余個在良惡性結節(jié)間差異表達的基因之后，初步發(fā)現基因表達譜分析診斷甲狀腺癌的靈敏度達到95%，特異度為75%。2012 年，新英格蘭醫(yī)學雜志發(fā)表了多中心、前瞻性研究結果，研究者在之前研究的基礎上，選擇了167 個基因，建立了Afirma Gene Expression Classifier （Afirma GEC）表達譜芯片，發(fā)現Afirma GEC 診斷甲狀腺濾泡性腺瘤或可疑濾泡性腺瘤的陰性預測值達到96%，靈敏度高達92%，但特異度僅為52%[24]。2018 年，在Afirma GEC 的基礎上，學者采用第二代測序技術構建了Genomic Sequencing Classifier（GSC），其納入了1 115 個核心基因進行綜合分析，GSC 在陰性預測值維持在96%的情況下，可將特異度提高至91%[25]。

有研究對Afirma GEC、GSC 與ThyroSeq 系列的診斷效能進行了比較分析。2018 年，一項平行隨機對照研究直接比較了Afirma GEC 與ThyroSeq第2 版在Bethesda Ⅲ、Bethesda Ⅳ結節(jié)中的診斷效能[26]，結果發(fā)現，ThyroSeq 第2 版的診斷特異度更高（66%比91%），其可以讓更多的受試者避免診斷性手術，兩者的陽性預測值則分別為39%和57%。39%接受Afirma GEC 檢測的患者避免了診斷性甲狀腺腺葉切除，而62%接受ThyroSeq 第2 版檢測的患者避免了手術。

二、基于miRNAs 的分子診斷

業(yè)內對基于miRNAs 的分子診斷，認可度相對較低。早在2008 年，研究發(fā)現，相對于良性甲狀腺結節(jié)，甲狀腺癌組織具有特異的miRNA 表達譜，且病理類型不同，miRNA 表達譜也不同。甲狀腺髓樣癌與濾泡細胞來源的甲狀腺癌miRNA 表達譜完全不同。miR-187、miR-221、miR-222、miR-181b、miR-146b、miR-155、miR-224 在濾泡細胞來源的甲狀腺癌中均一致高表達。而在ATC 中，這7 個miRNA表達的水平較低，但miR-302c、miR-205、miR-137會有顯著的高表達。該研究提示，檢測miRNA 異常表達可能也可以作為甲狀腺癌的分子診斷方法[27]。2018 年，基于19 種miRNAs 表達的panel （包含miR-221、miR-222 和miR-146b 等）發(fā)表，結果證實其能夠從FNAB 檢查結果不確定的甲狀腺結節(jié)中準確鑒別出分化良好的甲狀腺癌，其診斷特異度和陽性預測值均為100%，陰性預測值為87%，靈敏度為91%，總體準確率達到了94%[28]。

不同分子診斷平臺的比較及分子診斷的局限性

一、不同分子診斷平臺

上述幾種分子診斷共同的優(yōu)勢在于陰性預測價值較高，因此主要臨床用途為避免不必要的手術，但陽性預測值尚待進一步提升，尤其是Afirma GEC、GSC 平臺。ThyroSeq，尤其是第3 版本綜合了DNA 和RNA 檢查，使得陽性預測值在Bethesda Ⅲ類結節(jié)中達到77%，Ⅳ類結節(jié)中達到83%。但這需要同時獲取FNAB 的DNA 和RNA 樣本，分別建庫測序，因此檢測成本也大幅提高。目前，以上幾類平臺均未進入中國，因而其在我國甲狀腺結節(jié)患者中的診斷價值尚未被確認。目前，國內有多個企業(yè)自主研發(fā)的甲狀腺癌基因檢測panel，但納入基因數量普遍偏少，缺少大樣本的人群數據證實其診斷價值。

二、分子診斷的局限性

雖然分子診斷為甲狀腺良惡性結節(jié)的術前診斷提供了有效的工具，但是存在取材失敗、費用昂貴、缺失有效信息的風險分層標志物等方面的問題，極大限制了其被廣泛應用。比如取材問題，雖然甲狀腺因其獨特的解剖學位置，醫(yī)師能通過細針穿刺獲取組織，但FNAB 穿刺樣本仍有其特殊性，約1%的穿刺樣本中濾泡細胞數量太少，無法獲得可靠的分子診斷數據。此外，標本中攜帶陽性突變腫瘤細胞的百分比也會直接影響陽性位點的檢出。昂貴的檢測成本也是一個重要的問題，雖然測序成本日益下降，然而這些商業(yè)檢測方案的價格仍舊很昂貴。在我國，醫(yī)療手術費用遠低于西方國家，因此當分子檢測成本接近手術費用時，更多的患者和醫(yī)務人員會直接選擇手術。最后，目前缺乏提示甲狀腺癌風險分層的分子事件，不能有效指導手術治療的范圍和隨訪管理方案。

前景及展望

精準醫(yī)學包括精準診斷和精準治療，是現代醫(yī)學的發(fā)展趨勢。因此，甲狀腺結節(jié)的分子診斷也是大勢所趨。目前，真實世界數據已經證實分子診斷可以避免相當數量的甲狀腺結節(jié)患者接受不必要的手術。未來希望分子檢測能夠進一步降低成本，并在甲狀腺癌風險分層方面提供更多的臨床幫助，實現分子診斷預測甲狀腺結節(jié)患者預后的價值。