沈麗蕓，吳紅楊，陳孫斌

（瓊海市中醫(yī)院超聲科，海南 瓊海 571400）

新生血管的形成在實體瘤發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色，其中微血管密度是用于評估腫瘤病灶血管是否存在的定量指標，是預(yù)測病灶是否具有侵襲性的關(guān)鍵性指標[1]。但微血管密度檢測步驟繁瑣、耗時長，對于指導(dǎo)臨床早期及時治療，特別是對于惡性腫瘤病人治療指導(dǎo)，有一定滯后性，部分病人甚至可能因此錯失最佳治療時機，因此，探尋一種與病理組織具有較好聯(lián)系的、可重復(fù)進行的無創(chuàng)檢查指標，來準確評估病灶血管生成情況及其惡性生物學行為，對改善惡性腫瘤病人預(yù)后尤為關(guān)鍵[2，3]。超聲造影技術(shù)是一種超聲定量檢查技術(shù)，可以通過檢測目標器官、組織血流情況，來判定該器官、組織的性質(zhì)及其功能狀態(tài)，目前已被用于諸多實質(zhì)性臟器疾病甄別，且取得一定成效[4]。研究指出，甲狀腺腫瘤病人微血管密度與其超聲表現(xiàn)有一定關(guān)系，因甲狀腺腫瘤病人的微血管密度可能提示了腫瘤生物學行為[5，6]，由此考慮，甲狀腺乳頭狀癌病人的主要超聲造影相關(guān)參數(shù)也可能對早期判定病灶性質(zhì)有一定指導(dǎo)價值，但相關(guān)研究并不多見。鑒于此，本研究通過觀察甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)、微血管密度、癌細胞惡性生物學行為，旨在分析各超聲參數(shù)與微血管密度、惡性生物學行為相關(guān)標志物的相關(guān)性，以指導(dǎo)臨床。報告如下。

1 資料與方法

1.1 納入對象

本次研究的設(shè)計均嚴格遵照醫(yī)學倫理相關(guān)標準，且在整理病人病歷資料前，均取得病人及其監(jiān)護人同意?；仡櫺苑治?，采集我院2016-03～2019-03期間收治的甲狀腺疾病353例病人病歷資料。（1）納入標準:①甲狀腺乳頭狀癌病人經(jīng)手術(shù)病理確診為甲狀腺乳頭狀癌，甲狀腺良性腫瘤病人經(jīng)組織病理排除甲狀腺乳頭狀癌；②甲狀腺乳頭狀癌病人接受甲狀腺根治術(shù)或全切術(shù)，良性腫瘤病人開展消融術(shù)、切除術(shù)等，手術(shù)均順利且術(shù)中均保存病理標本；③病人治療期間超聲成像等影像學資料、病歷資料等均完整；（2）排除標準:①合并其他部位腫瘤；②合并活動性感染癥狀；③合并甲狀腺局限性或彌漫性疾病；④既往有甲狀腺病史，且入院前接受過腫瘤相關(guān)治療，如放化療、I131治療等。

1.2 分組與一般資料

根據(jù)術(shù)中病理組織活檢結(jié)果將353例病人進行分組，其中268例惡性甲狀腺乳頭狀癌病人納入惡性組，其中男性68例，女性200例；年齡20～43歲，平均（31.52±3.12）歲；TNM分期Ⅰ～Ⅱ120例，Ⅲ～Ⅳ148例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有165例，無103例；病灶直徑（cm）＜3cm 123例，≥3cm 145例。將85例甲狀腺良性腫瘤病人納入良性組，男性22例，女性63例；年齡20～45歲，平均（32.02±3.35）歲。兩組病人性別、年齡基線資料對比，均衡性良好（P＞0.05），有可比性。

1.3 方法

1.3.1 主要儀器、設(shè)備及組織樣本來源采用美國GE公司提供GE-LOGIQ S6型彩色多普勒顯像儀，探頭頻率:8.0～12.0MHz，選擇甲狀腺條件掃描甲狀腺區(qū)域；檢測所用微血管常用試劑包括CD34與CD31等單克隆抗體，試劑盒為SP試劑盒，主要試劑及試劑盒均由福州邁新生物科技開發(fā)公司提供。所有組織標本均來源于術(shù)中切除組織，標本采集后均予以固定、石蠟包埋、染色等處理。

1.3.2 超聲參數(shù)檢測囑病人仰臥位，確保頸部充分暴露，首先選擇可以充分顯示病灶處的最佳切面，常規(guī)超聲確定病灶位置、大小、形態(tài)、邊界、內(nèi)部回聲等，選擇脈沖反相諧波造影條件，機械指數(shù)設(shè)置為0.07，之后經(jīng)肘靜脈注入Sono Vue造影劑2.4mL，記錄病灶組織顯影，數(shù)據(jù)導(dǎo)出后，采用QLAB軟件計算興趣區(qū)域內(nèi)的峰值強度（peak intensity，PI）、達峰時間（time to peak，TTP）、平均渡約時間（mean transit time，MMT）。

1.3.3 微血管密度采用weidner計數(shù)方法，將染成棕黃色的單個內(nèi)皮或內(nèi)皮細胞簇列入計算的血管，位置不同的血管內(nèi)皮細胞獨立計數(shù)血管，管腔超過8個細胞直徑，較厚的肌層、腫瘤細胞稀少區(qū)、硬化區(qū)等部位均不列入計算范圍，在光鏡100倍鏡下尋找目標區(qū)域，分別計算5個區(qū)域下微血管計數(shù)，取其平均值視為微血管密度（microvascular density，MVD）。

1.3.4 癌細胞惡性生物學行為采用熒光定量PCR檢測組織中與增殖、侵襲及自噬基因相關(guān)生物學指標的表達情況，增殖基因包括:溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromine domain protein 4，BRD4）、叉頭蛋白M1抗體（FoxM1）；侵襲基因包括:轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducers and activators of transcription 5,STAT5）、Twist相關(guān)蛋白1（twist related protein 1，Twist1），自噬基因包括:微血管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β（microvascular associated protein 1 light chain 3-β，LC3）、磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計分析軟件，全部計量資料均經(jīng)正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，甲狀腺乳頭癌超聲參數(shù)與微血管密度、癌細胞惡性生物學行為之間的相關(guān)性，采用雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組超聲參數(shù)、微血管密度、癌細胞惡性生物學行為對比

與良性組病人相比，惡性組病人PI、TTP、MMT、MVD水平均較高，BRD4、FoxM1、Stat5、Twist1表達均較高，LC3、PTEN表達較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 兩組超聲參數(shù)、微血管密度、癌細胞惡性生物學行為對比（）

表1 兩組超聲參數(shù)、微血管密度、癌細胞惡性生物學行為對比（）

組別惡性組（n=268）良性組（n=85）超聲參數(shù)PI（%）22.87±6.12 14.85±4.86 12.410 TTP（s）48.56±9.85 32.12±7.85 15.768 MMT（s）63.12±18.21 55.36±16.85 3.627 MVD（條/mm2）210.23±39.89 118.23±30.23 22.521 t P增殖基因（相對表達）BRD4 130.45±14.23 100.15±11.52 30.681 FoxM1 120.14±13.25 92.12±9.52 21.357侵襲基因（相對表達）Stat5 125.45±12.56 90.56±9.23 27.662 Twist1 102.23±13.25 85.12±9.12 13.387自噬基因（相對表達）LC3 62.45±7.12 97.45±10.23 29.368 PTEN 80.56±9.06 105.12±13.25 15.948＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)與微血管密度的相關(guān)性分析

經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)（PI、TTP、MMT）與MVD均呈正相關(guān)（r＞0，P＜0.05）（見表2）。

表2 甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)與微血管密度的相關(guān)性分析

2.3 甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)與癌細胞生物學特性的相關(guān)性分析

經(jīng)雙變量Pearson直線相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)（PI、TTP、MMT）分別與BRD4、FoxM1、Stat5、Twist1均呈正相關(guān)（r＞0，P＜0.05），與LC3、PTEN均呈負相關(guān)（r＜0，P＜0.05）（見表3）。

表3 甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)與癌細胞生物學特性的相關(guān)性分析

3 討論

超聲造影是通過向病人體內(nèi)注入造影劑，借助造影劑分布與運動情況，來評估腫瘤內(nèi)部血管生成及分布，在病灶與正常組織中有實質(zhì)性區(qū)別，可指導(dǎo)各腫瘤疾病的病變性質(zhì)的區(qū)分[7]。超聲造影對角度的要求不高，能夠清晰顯示組織毛細血管情況，即使是流速較低、管徑較細的微血管也能清晰顯示，該技術(shù)將超聲檢查從形態(tài)顯像過渡到功能顯像，有效彌補了常規(guī)超聲無法顯示微血管的局限，在甲狀腺乳頭狀癌的良惡性鑒別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷中的應(yīng)用價值已被證實[8，9]。

與良性組相比，惡性組超聲參數(shù)PI、MTT、TTP參數(shù)水平均較低（見表1）。究其原因，惡病質(zhì)病灶中，血管生成較多，但功能尚不成熟，且排列順序雜亂無章，對于快速增殖的腫瘤病灶，新生血管無法滿足癌細胞對氧及營養(yǎng)的需求，因此常呈現(xiàn)缺血、缺氧狀態(tài)，造成在超聲造影檢查過程中病灶出現(xiàn)無增強顯像或低增強顯像的情況，故而導(dǎo)致超聲參數(shù)表現(xiàn)為TTP提前、MTT壓縮、PI降低的現(xiàn)象[10]。該結(jié)果提示，臨床針對腫瘤高度疑似惡變病人，可及時通過超聲血管檢查來提供判定依據(jù)，旨在早期指導(dǎo)并干預(yù)疾病的治療。

癌細胞惡性增殖的根本是由于抗增殖與促增殖基因之間表達失去平衡，因此檢測增殖基因表達對評估病灶惡性程度有一定指導(dǎo)價值[11]。侵襲基因的非正常表達將直接導(dǎo)致癌細胞轉(zhuǎn)移，同時，侵襲基因的異常表達也是導(dǎo)致腫瘤細胞向惡性進展的根本原因。Stat5、Twist1均為侵襲基因，既往研究顯示，甲狀腺乳頭狀癌細胞中，Twist1呈高表達，通過介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來促進癌細胞的淋巴轉(zhuǎn)移；Stat5屬于STAT家族成員之一，該家族在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用，Stat5的高表達及異?；罨瘏⑴c了誘發(fā)腫瘤細胞癌變、促進癌細胞轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性生物學行為過程[12]。BRD4的高表達在乳腺癌、鼻咽癌等惡病質(zhì)中被證實具有促進作用，該基因主要通過促進Sonic Hedghog信號通路，并以此推動癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移過程；FoxM1在部分代謝過程中具有調(diào)控作用，且在細胞增殖、分化周期中尤為重要，其高表達將直接阻礙細胞分化，導(dǎo)致細胞始終停留在幼稚狀態(tài)，但仍然繼續(xù)增殖，最終誘導(dǎo)細胞向惡性發(fā)展[13]。自噬基因是癌細胞凋亡的一種反應(yīng)方式，LC3、PTEN均為自噬基因，LC3是典型自噬細胞，其在病灶中的表達情況直接反應(yīng)細胞自噬活性；PTEN是擁有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，是自噬細胞形成的關(guān)鍵基因，同時還能抑制癌細胞的生長[14]。本研究結(jié)果顯示，與良性組病人相比，BRD4、FoxM1、Stat5、Twist1表達均較高，LC3、PTEN表達較低。表明BRD4、FoxM1等基因的表達情況與腫瘤病灶的病變性質(zhì)緊密相關(guān)。與良性組相比，惡性組MVD較高，其原因可能因為惡性病灶生長迅速、細胞增殖活躍，病灶周邊新生毛細血管較多導(dǎo)致（見表1）。

為進一步明確甲狀腺乳頭狀癌病人超聲參數(shù)是否直接與腫瘤細胞良惡性有關(guān)，本研究將病人各主要超聲參數(shù)分別與微血管密度及癌細胞生物學特性之間的關(guān)系（見表2、3），甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)各指標與MVD、BRD4、FoxM1、Stat5、Twist1均呈正相關(guān)，與LC3、PTEN均呈負相關(guān)。推測對于早期具有甲狀腺乳頭狀癌風險的病人，及時展開超聲造影檢查，并對PI、TTP、MMT指標異常增高者給予高度重視，及時聯(lián)合其他相關(guān)檢查，對早期惡性病灶及時檢出、干預(yù)等意義重大，是改善甲狀腺乳頭狀癌病人預(yù)后的關(guān)鍵。因病灶細胞生物學行為相關(guān)指標較多，本次研究僅選取部分指標，可能還有更具代表性與價值的指標被忽視；此外，因微血管密度的檢測、病理組織的選取均易受個人主觀性影響；加之研究屬于回顧分析，在納入樣本資料時可控因素較少，故研究仍有一定局限，研究所得結(jié)論的真實性與可信度還需在未來開展大量前瞻性、大樣本、長時間、多指標的研究加以驗證。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌超聲參數(shù)有其特點，且與微血管密度、癌細胞惡性生物學行為密切相關(guān)，對高度疑似甲狀腺乳頭狀癌的病人可考慮早期進行超聲檢查，并對主要超聲參數(shù)值進行分析，這對指導(dǎo)疾病惡性程度評估及治療有一定價值。