尚秋，雷嗣超，黃雪薇，葉鵬輝，張美

（武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205）

板栗又名魁栗、毛栗、風(fēng)栗，向來有“干果之王”的美譽(yù)。目前，板栗加工主要以果仁精深加工為主，而作為副產(chǎn)物的板栗殼主要是作為燃料或丟棄，這樣既不利于板栗殼加工產(chǎn)業(yè)鏈向綠色經(jīng)濟(jì)方向發(fā)展，對環(huán)境產(chǎn)生一定的污染[1]。板栗殼的天然活性物質(zhì)已經(jīng)得到研究人員的廣泛關(guān)注，少數(shù)研究者用板栗殼用來制備生物質(zhì)碳[2]、吸附劑[3-4]。板栗殼的化學(xué)成分有纖維素、木質(zhì)素、有機(jī)酸、黃酮以及鞣質(zhì)等，黃酮類物質(zhì)的含量為6%左右[5]，以鞣花單寧和原花青素為主[6]。目前研究表明，黃酮類物質(zhì)有清除自由基、降血脂、抗腫瘤、抗菌及調(diào)節(jié)免疫功能等作用[7]，同時具有降脂減肥的功效[8]。

人體過量攝入脂肪會造成脂質(zhì)代謝紊亂，引起高脂血癥，由此引發(fā)心腦血管等一系列疾病。胰脂肪酶是水解膳食中甘油三酯的關(guān)鍵酶，若能抑制其活性，則可有效減少過量脂質(zhì)的消化吸收，是治療肥胖癥的有效策略。目前市場上治療肥胖的藥物有奧利司他、氯卡色林、酚特明、安非他酮以及利拉魯?shù)萚9]，但部分減肥藥物有一定的副作用，如油性斑點、便秘、腹瀉等[10]。因此，研究板栗殼黃酮類物質(zhì)對胰脂肪酶的抑制作用，能為開發(fā)具有脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用的功能因子提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗，購于羅田，顆粒飽滿，無害蟲。蘆丁，麥克林生化科技有限公司（97%）。無水乙醇、三氯化鋁、乙酸鉀、無水甲醇、二水合磷酸二氫鉀、十二水合磷酸二氫鉀、胰脂肪酶、對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP），均為分析純；對硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，PNPP）、曲拉通X-100，均為生物級；甲醇、乙腈、乙醇，默克公司；奧利司他，山東新時代藥業(yè)有限公司（0.12g/膠囊）；實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10 真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵，上海貝茵科技有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；JJ124BC 電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；20 目孔標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩，浙江上虞市五四紗篩廠；V-500 可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機(jī)，武漢志?？萍加邢薰荆籊ZX-9030 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海博訊實業(yè)有限公司；KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MM400 型冷凍研磨儀，德國Retsch（萊馳）公司；Ultimate 3000 型超高效液相色譜儀，美國Dionex（戴安）公司；QTRAP 6500 型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技有限公司；Water ACQUITY UPLC HSS T3 C18 型色譜柱，賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 板栗殼黃酮的提取工藝

將板栗殼去雜后用水洗凈，自然干燥至表面沒有水分后粉碎，過20 目篩。板栗殼黃酮提取方法參考蘇云霞等[11]和郭雷等[12]的方法，并稍作修改。精密稱取20.00 g 板栗殼粉置于具塞錐形瓶中，按1:15（g:mL）料液比加入300 mL70%的乙醇，塞緊瓶塞，在65 ℃水浴中超聲提取90 min，提取1 次，自然冷卻，將濾液在40 ℃下真空抽濾濃縮，再冷凍干燥制得板栗殼凍干粉，稱量，低溫保存。

1.3.2 總黃酮的測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用分光光度法測定總黃酮含量，配制0.05 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液母液，分別吸取母液0、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 于10 mL 容量瓶中，加入0.1 mol/L 三氯化鋁溶液2 mL、1 mol/L 乙酸鉀溶液3 mL，用70%甲醇定容至刻度，搖勻后靜置30 min。在420 nm 條件下測定其吸光度，以濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總黃酮含量和得率的測定：準(zhǔn)確稱量一定量板栗殼，按1.3.1 中方法經(jīng)提取、抽濾濃縮提取得到板栗殼黃酮提取液，準(zhǔn)確吸取1.0 mL 提取液于10 mL 容量瓶中，加入三氯化鋁溶液2 mL、乙酸鉀溶液3 mL，用70%甲醇溶液定容至刻度，搖勻靜置30 min。于420 nm 波長下測定其吸光度，根據(jù)式（1）（2）計算樣品中的黃酮含量和得率[13]。

式中，c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的提取液總黃酮濃度，mg/mL；m為板栗殼總質(zhì)量，g；V為待測樣品溶液的體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 總黃酮的組成分析

樣品預(yù)處理：將1.3.1 中制備的板栗殼黃酮凍干粉用研磨儀研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末狀，稱取100 mg 粉末，復(fù)溶于1.0 mL 70%的甲醇水溶液中，渦旋3 次，于4℃冰箱過夜。提取完成后離心（10 000 r/min、10 min），取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜后，備用。

色譜條件：使用Dionex Ultimate 3 000 超高效液相色譜儀對板栗殼黃酮類化合物進(jìn)行分離，色譜柱為Water ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。色譜柱溫度40 ℃，在進(jìn)樣前后，用200 μL 70%甲醇洗滌自動進(jìn)樣器，洗滌2 次。流動相：A 相為超純水（0.04%的乙酸），B 相為乙腈（0.04%的乙酸），進(jìn)樣量2 μL，流速0.4 mL/min。梯度洗脫條件為0 min，A：95%；11 min，A：5%；12 min，A：5%；12.1 min，A：95%；15 min，A：95%。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI 電離源，溫度500 ℃；質(zhì)譜電壓為5 500 V；簾氣壓力設(shè)置為25 psi；碰撞誘導(dǎo)電離：高；掃描質(zhì)量為100～1 000m/z；MS1 阱填充時間設(shè)定為250 ms，自動增益控制設(shè)置為1 000 000；MS2 阱填充時間設(shè)置為120 ms，自動增益控制設(shè)置為200 000；標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能設(shè)定為25 eV，階梯能量設(shè)置為40%；根據(jù)MS1 的離子強(qiáng)度，進(jìn)行MS1-MS2 的切換。利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.3.4 板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制作用

（1）PNP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取定量PNP，用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH7.4，下同）配制成5 mmol/LPNP 母液，經(jīng)稀釋得0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.20 mmol/L的PNP 標(biāo)準(zhǔn)溶液。取各個濃度的PNP 溶液于比色皿中，用分光光度計在405nm下測吸光度，每個濃度3 次平行，結(jié)果取平均值。以PNP 濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）胰脂肪酶酶活的測定

胰脂肪酶酶活力單位定義為37 ℃下保溫10 min，每分鐘內(nèi)催化1 μmol 底物轉(zhuǎn)化為PNP 所需要的酶量定為一個酶單位，1 U=1 μmol/min。參考Liang 等[14-15]的方法加以改進(jìn)，分別取濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL 的胰脂肪酶液2 mL 于10 mL EP 管中，加入2 mL PBS 緩沖液，37 ℃水浴保溫10 min，再加2 mL PNPP 啟動反應(yīng)，37℃水浴避光反應(yīng)20 min，沸水浴煮沸1 min 滅酶。4 000 r/min 離心5 min，取上清液在405 nm 下測定吸光度?？瞻子肞BS 代替酶液，每組試驗重復(fù)3 次。根據(jù)胰脂肪酶活力計算公式見式（3）。

式中n 為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間，min；V為反應(yīng)體系總體積，L；Y為測定的吸光度值。

（3）板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制作用

樣品溶液的配制：稱取一定量板栗殼黃酮凍干粉，用PBS 緩沖液分別配成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0 mg/mL 的樣品溶液；稱取奧利司他粉末0.020 g，用少量二甲基亞砜溶解，再加適量緩沖液超聲，取上清液，用PBS 緩沖液配成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0 mg/mL 的奧利司他溶液。

測定方法：參考文獻(xiàn)[16－17]的方法并加以改進(jìn)。分別取2 mg/mL 胰脂肪酶液2 mL 于10 mL EP 管中，加入3.5 mL PBS 緩沖液、0.5 mL 板栗殼黃酮溶液或奧利司他溶液，37 ℃水浴保溫10 min，再加2 mL PNPP 啟動反應(yīng)，37 ℃水浴避光反應(yīng)20 min，沸水浴煮沸1 min，滅酶。4 000 r/min 離心5 min，取上清液在405 nm 測吸光度。空白組用滅活的同濃度的酶液；每組試驗重復(fù)三次。抑制率計算公式見式（4）和（5）。

式中，A為空白組的吸光度；B為板栗殼黃酮實驗組的吸光度；C為奧利司他對照組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與總黃酮測定

根據(jù)不同蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對應(yīng)吸光度數(shù)據(jù)，得到回歸方程：Y=27.537X-0.007 5，R2=0.999 8，相關(guān)性良好。將吸光度值帶入回歸方程得黃酮含量，帶入公式（1）計算得樣品中總黃酮含量為0.21%，即2.1 mg/g。

按照1.3.1 所述方式提取20 g 板栗殼中的黃酮類物質(zhì)，得到板栗殼黃酮凍干粉為0.423 9 g，帶入公式（2）計算得板栗殼黃酮提取得率為2.12%。

2.2 板栗殼黃酮類物質(zhì)的組成分析

采用UPLC-ESI-MS/MS 技術(shù)分析其黃酮組成，結(jié)果見表1（見下頁）。由表1 知，板栗殼中含有31 種黃酮類物質(zhì)，主要包括5 種黃烷醇類、2 種花青素、8 種黃酮、9 種黃酮醇、5 種二氫黃酮、1 種二氫黃酮醇以及1 種查爾酮七類黃酮類物質(zhì)。其中，黃酮醇類物質(zhì)的種類最多，為9 種。

2.3 胰脂肪酶酶活的測定

由不同濃度胰脂肪酶液的吸光度結(jié)果得到了PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=12.154X-0.008 1，R2=0.999 4。將405 nm 處測得的樣品吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得酶促反應(yīng)產(chǎn)生的PNP 濃度為0.049 mmol/L，再根據(jù)公式（3）計算得胰脂肪酶的活力為0.016 6 U。

表1 板栗殼黃酮類物質(zhì)的組成Table 1 The composition of flavonoids in chestnut shell

2.4 板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制作用

將試驗測定的A（對照組吸光值）、B（板栗殼黃酮組）以及C（奧利司他組）分別帶入公式（4）和（5）中，計算板栗殼黃酮和奧利司他的抑制率，結(jié)果見表2。

表2 板栗殼黃酮與奧利司他抑制效果對比Table 2 Comparison of the inhibitory effects of chestnut shell flavonoids and orlistat

實驗結(jié)果顯示，0.1、0.5 及1.0 mg/mL 的板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制率分別為0.6%、2.1%和6.4%，由此可以看出，隨著板栗殼黃酮濃度的增加，其對胰脂肪酶的抑制率顯著增加。且在一定濃度范圍內(nèi)，板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制作用，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。本實驗條件下，板栗殼黃酮與奧利司他的抑制效果（14.9%、22.1%及29.9%）存在一定差距，未來可進(jìn)一步研究板栗殼黃酮純化工藝，提高提取物中黃酮類物質(zhì)的含量，以提高其抑制胰脂肪酶活性的效果。

3 結(jié)論

本文在提取板栗殼黃酮的基礎(chǔ)上，初步研究其對胰脂肪酶的抑制效果，結(jié)果表明，0.1、0.5、1.0 mg/mL 的板栗殼黃酮對胰脂肪酶的抑制率分別為0.6%、2.1%及6.4%，且隨著濃度提高，其對胰脂肪酶的抑制效果顯著提高，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。板栗殼黃酮類物質(zhì)為天然植物活性成分，毒理學(xué)研究結(jié)果顯示，多數(shù)黃酮類化合物一般無毒[18]，在胰脂肪酶抑制劑領(lǐng)域的開發(fā)具有實際應(yīng)用價值，相關(guān)食品與藥物研究與開發(fā)具有廣闊前景，同時，還可以解決板栗加工廢棄物的處理問題。今后，可進(jìn)一步提高板栗殼黃酮的純度和添加量以提高抑制效果，同時，加強(qiáng)其構(gòu)效關(guān)系和活性作用機(jī)制方向的研究，促進(jìn)相關(guān)功能性食品的開發(fā)。