代雅蕊,張佳璐,王小杰,趙依納,王 歡,李 欣(承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學研究所,承德 067000;河北生殖婦產醫(yī)院生殖醫(yī)學科;承德醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室;通信作者,E-mail:hbcdlx@cdmc.edu.cn)

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一[1],在中國,盡管發(fā)生率和死亡率一直在穩(wěn)步下降,但胃癌仍是僅次于肺癌的第二大新診斷癌癥病例和因癌癥死亡的主要原因[2]。目前,胃癌的治療主要以外科手術為主,輔以化療、靶向治療、支持治療的綜合治療[3],但由于大多數(shù)患者晚期發(fā)現(xiàn)有廣泛浸潤和淋巴轉移,胃癌的治療效果仍然較差[1]。尋找能夠影響胃癌細胞增殖、凋亡和遷移的生物制劑成為亟需解決的問題。

ANXA5屬于膜聯(lián)蛋白基因超家族[4],能鈣依賴性地對磷脂酰絲氨酸產生極高的親和力,同時有膜修復、抗凝血、抗炎癥等多種生物學功能[5],對藥物研制表現(xiàn)出了較大的臨床潛力。大量研究表明ANXA5在多種腫瘤中表達改變并影響了腫瘤細胞的惡性行為,Zhang等[6]報道ANXA5可抑制小鼠黑色素瘤的生長。本課題組研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A5(annexin A5,ANXA5)對胃癌的發(fā)生發(fā)展有一定影響[7-9]。但ANXA5蛋白是否可通過外源性添加的方式來影響胃癌細胞,目前還鮮有報道。

本研究中,我們將ANXA5蛋白外源性作用于人胃癌細胞系MGC-803細胞,檢測其增殖、凋亡和遷移性能,并對與腫瘤轉移密切相關的鈣黏蛋白E-cadherin和基質金屬蛋白酶MMP-9的表達進行了檢測,可望為臨床治療胃癌提供新思路、新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞系MGC-803細胞購自中國科學院上海細胞庫,細胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)及胎牛血清購自美國Gibco公司。ANXA5蛋白凍干粉、MTT增殖及細胞毒性檢測試劑盒、RIPA裂解液與5×蛋白上樣緩沖液(loading buffer)分別購自武漢云克隆科技股份有限公司、碧云天公司、上海Bebo Biotech公司。BCA蛋白定量試劑盒、PI染液購自北京索萊寶科技有限公司。E-cadherin、MMP-9、β-actin兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司,PCNA鼠抗人單克隆抗體購自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將MGC-803細胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),并置于5%CO2、37 ℃的HER Aceu150細胞培養(yǎng)箱(購自德國賀利公司)內孵育。第2天更換培養(yǎng)基,當細胞密度達到80%-90%,將其用0.25%的胰蛋白酶消化后傳代,實驗取對數(shù)生長期細胞,并在實驗處理前1 d對細胞進行換液。

1.2.2 ANXA5蛋白培養(yǎng)液的制備 將1 ml經高壓過的超純水加入ANXA5蛋白凍干粉試劑瓶中,制備成0.1 mg/ml的貯存液,通過0.22 μm微孔濾膜過濾除菌并分裝,儲存在-80 ℃中以供使用。使用時將貯存液加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中配制所需濃度的ANXA5蛋白培養(yǎng)液。

1.2.3 ANXA5蛋白應用濃度測定及分組 將MGC-803細胞制備成濃度為2×104/ml的細胞懸液,每孔100 μl接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h利用0,20,40,80,160 nmol/L濃度梯度的ANXA5蛋白培養(yǎng)液對細胞進行處理,每個濃度設置3個復孔,作用24 h檢測細胞在不同ANXA5蛋白濃度下的細胞活力,測量其OD值并應用SPSS計算IC50的方法[10]求得IC50值為42 nmol/L,以此為ANXA5蛋白應用濃度。實驗分為兩組:外源ANXA5組應用42 nmol/L ANXA5蛋白培養(yǎng)液進行培養(yǎng),空白對照組應用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。兩組細胞分別通過形態(tài)學觀察、MTT實驗、PI熒光染色法、細胞劃痕實驗,以及PCNA、MMP-9、E-cadherin蛋白表達情況檢測ANXA5對MGC-803細胞增殖、凋亡和遷移的影響。

1.2.4 形態(tài)學觀察 以每孔3×105個細胞數(shù)量將MGC-803細胞接種于6孔板中,2 ml培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。待24 h細胞貼壁后用2 ml ANXA5蛋白培養(yǎng)液和等量培養(yǎng)基分別對兩組細胞進行處理,培養(yǎng)24 h將兩組細胞置于倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化,并進行拍照。

1.2.5 MTT實驗檢測細胞增殖 收集MGC-803細胞,將細胞密度調整為2×104/ml,每孔100 μl接種于96孔板中。實驗分為外源ANXA5組和空白對照組,每個時間點設5個復孔,邊緣孔用RPMI-1640培養(yǎng)基進行填充。置于培養(yǎng)箱約24 h待細胞貼壁后將原培養(yǎng)基棄掉,將100 μl ANXA5蛋白培養(yǎng)液添加到外源ANXA5組中,將等量培養(yǎng)基添加到空白對照組中,處理后將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0,24,48,72 h時,每孔加入MTT(5 mg/ml)溶液10 μl,進一步培養(yǎng)4 h,將上清培養(yǎng)基棄掉并取150 μl DMSO加入到每孔中。待作用10 min后,使用MK3酶聯(lián)免疫檢測儀(購自美國Thermo公司)測定每孔在波長490 nm下的吸光度值(OD值)。

1.2.6 PI熒光染色法檢測細胞凋亡 在96孔板中每孔接種2×103個細胞并于100 μl培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,將外源ANXA5組培養(yǎng)基更換為100 μl ANXA5蛋白培養(yǎng)液,并為空白對照組更換等量新的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,行PI熒光染色法[11]。將PI染液加入培養(yǎng)基中進行染色,在37 ℃下避光孵育10 min,用PBS溶液洗滌2次,然后在配備有紫外濾光片的Nikon 80i熒光顯微鏡(購自日本東京尼康公司)下觀察細胞,每組隨機選擇5個視野進行圖像采集并計數(shù)凋亡細胞。

1.2.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 取MGC-803細胞接種于6孔板(3×105/孔)中,于2 ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,細胞貼壁狀態(tài)良好且細胞數(shù)量達60%時,棄掉原來培養(yǎng)基,用無菌1 ml槍頭尖端在6孔板上進行劃痕,無菌PBS溶液輕輕沖洗2次。將2 ml ANXA5蛋白培養(yǎng)液添加到外源ANXA5組中,將等量培養(yǎng)基添加到空白對照組中,繼續(xù)培養(yǎng)0,12,24,48,72 h,分別觀察細胞的遷移情況并拍照記錄。

1.2.8 Western blot法檢測PCNA、MMP-9、E-cadherin蛋白表達 取MGC-803細胞以4×105/皿細胞數(shù)量分別接種于2個6 cm的細胞培養(yǎng)皿中,24 h待細胞長到60%-70%時,外源ANXA5組、空白對照組分別用ANXA5蛋白培養(yǎng)液和含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),每皿各3 ml。處理后將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每皿加入210 μl裂解液,對總蛋白進行提取并通過BCA法定量蛋白。將蛋白與5×上樣緩沖液混合,在沸水中煮沸10 min,室溫放置待冷卻后放入-20 ℃冰箱儲存。配置15% SDS-PAGE凝膠進行上樣電泳(電壓80-120 V,2 h),濕轉法轉膜(電壓80 V,70 min)后,用5%脫脂奶粉封閉3 h,加入E-cadherin、MMP-9兔抗人單克隆一抗(1 ∶500),β-actin兔抗人單克隆一抗(1 ∶1 000),及PCNA鼠抗人單克隆一抗(1 ∶10 000)后孵育2 h,放入4 ℃冰箱過夜。第2天均以15,10,5 min時間間隔TBST洗膜后加入一抗所對應羊抗兔、羊抗鼠二抗(1 ∶5 000)孵育80 min,之后均以10,10,10 min時間間隔TBST洗膜,并使用Tanon 6100化學發(fā)光儀(購自上海天能公司)進行顯影。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 形態(tài)學變化

外源ANXA5組將ANXA5蛋白外源性作用于MGC-803細胞24 h,細胞數(shù)量減少、貼壁不牢,細胞培養(yǎng)液中懸浮細胞明顯增多,倒置顯微鏡下觀察細胞明顯變圓,細胞間隙變大,胞漿呈空泡狀,細胞碎片增多(見圖1)。

圖1 ANXA5蛋白對MGC-803細胞的形態(tài)學影響(×1 000)Figure 1 Effect of ANXA5 protein on the morphology of MGC-803 cells (×1 000)

2.2 ANXA5蛋白對MGC-803細胞增殖的影響

將ANXA5蛋白外源性作用于MGC-803細胞后,經MTT法測定,對兩組OD值進行比較,結果見圖2。與空白對照組相比,外源ANXA5組24,48,72 h均表現(xiàn)出增殖抑制作用,差異有統(tǒng)計學意義(24 h:P<0.05;48 h和72 h:P<0.001)。

與空白對照組相比，*P<0.05,***P<0.001圖2 ANXA5蛋白抑制MGC-803細胞的增殖Figure 2 Exogenous ANXA5 protein inhibits proliferation of MGC-803 cells

2.3 ANXA5蛋白對MGC-803細胞凋亡的影響

在熒光顯微鏡下對兩組經PI染料染色的細胞進行觀察可以得出:外源ANXA5組有紅色熒光著色的細胞明顯多于空白對照組,將ANXA5蛋白外源性作用于MGC-803細胞24 h,凋亡細胞的數(shù)量與空白對照組比較明顯增加(P<0.001,見圖3)。

圖3 PI熒光染色法檢測ANXA5蛋白對MGC-803細胞凋亡的影響Figure 3 Effect of ANXA5 protein on apoptosis of MGC-803 cells by PI staining

2.4 ANXA5蛋白對MGC-803細胞遷移的影響

ANXA5蛋白外源性作用于外源ANXA5組MGC-803細胞0,12,24,48,72 h拍照記錄細胞的遷移情況,結果見圖4。劃痕兩側細胞的距離為愈合距離,通過計算愈合率,兩組進行比較可知,0 h和12 h兩組愈合率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),24,48,72 h兩組愈合率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明,ANXA5蛋白抑制了胃癌MGC-803細胞的遷移能力。

圖4 ANXA5蛋白抑制MGC-803細胞的遷移Figure 4 Exogenous ANXA5 protein inhibits migration of MGC-803 cells

2.5 ANXA5蛋白對MGC-803細胞PCNA、MMP-9、E-cadherin表達的影響

ANXA5蛋白外源性作用于MGC-803細胞后,PCNA、MMP-9和E-cadherin蛋白表達見圖5。經灰度值分析顯示,外源ANXA5組增殖相關蛋白PCNA的蛋白表達量比空白對照組低(0.315±0.049vs0.498±0.061,P<0.05)。EMT相關蛋白MMP-9蛋白表達量較空白對照組降低(0.556±0.645vs0.722±0.080,P<0.05);EMT相關蛋白E-cadherin蛋白表達量比空白對照組高(0.826±0.093vs0.417±0.103,P<0.01)。結果說明ANXA5蛋白抑制了胃癌MGC-803細胞PCNA和MMP-9的表達,促進了E-cadherin的表達。

與空白對照組相比，*P<0.05,**P<0.01圖5 Western blot檢測PCNA,MMP-9,E-cadherin蛋白的表達改變Figure 5 Expression of PCNA, MMP-9, E-cadherin protein by Western blot

3 討論

膜聯(lián)蛋白A5(ANXA5),也被稱為胎盤抗凝蛋白Ⅰ、凝血活酶抑制劑Ⅴ、內聯(lián)蛋白Ⅱ、鈣磷脂結合蛋白Ⅰ和脂皮素Ⅴ,是膜聯(lián)蛋白家族的成員。其基因位于人類染色體4q26-q28上,編碼具有319個氨基酸的非糖基化單鏈蛋白,ANXA5的分子量為35.7 kD[4,12]。越來越多的證據(jù)證實其異常表達與多種惡性腫瘤的生物學行為關系密切[13],參與了腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲過程中的多個環(huán)節(jié)。Ding等[14]研究發(fā)現(xiàn),抑制ANXA5的表達可顯著降低人膽管癌QBC-939細胞的增殖、遷移和侵襲能力,并增加其凋亡。但Li等[15]研究發(fā)現(xiàn),ANXA5過表達可能抑制了人宮頸癌細胞的增殖和轉移,Liu等[16]的研究發(fā)現(xiàn),ANXA5促進了人喉表皮樣癌Hep-2細胞的凋亡。ANXA5兼具的促瘤和抑瘤作用,引起課題組對ANXA5研究的很大興趣。

那么ANXA5在胃癌細胞中扮演了什么樣的角色?在現(xiàn)有的研究中,敲低ANXA5的表達水平后,促進了人胃癌細胞系MKN-45細胞的增殖[7],并可能通過調控人胃癌細胞系HGC-27細胞中Galectin-3的表達抑制細胞增殖[8],這些提示ANXA5表達的增加可能會抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展?；诖?我們猜想ANXA5蛋白是否可通過外源性添加的方式來影響胃癌細胞呢?

本研究將ANXA5蛋白外源性作用于人胃癌細胞系MGC-803細胞后,細胞數(shù)量減少、貼壁不牢,細胞培養(yǎng)液中懸浮細胞明顯增多,同時發(fā)生了明顯的形態(tài)學變化,細胞明顯變圓,細胞間隙變大,胞漿呈空泡狀,細胞碎片增多,我們猜測ANXA5蛋白可能抑制了MGC-803細胞的增殖并誘導其凋亡。通過MTT實驗和與細胞增殖有關的增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白表達結果我們得知,ANXA5蛋白對MGC-803細胞的增殖有明顯的抑制作用。ANXA5蛋白雖因與磷脂酰絲氨酸結合的特性被廣泛用作細胞凋亡的測定方法,但很少有關于其在細胞凋亡中潛在作用的信息[17]。故我們采用PI熒光染色法檢測了ANXA5蛋白對MGC-803細胞凋亡的影響。當細胞處于壞死或晚期凋亡時,PI染料可以通過被破壞的細胞膜與核DNA結合,使細胞在熒光顯微鏡下發(fā)出紅色熒光,而PI染料無法通過正常的細胞膜使細胞核著色[18],染色結果顯示,外源ANXA5組較空白對照組細胞呈現(xiàn)了更明顯的凋亡現(xiàn)象,經ANXA5蛋白培養(yǎng)液處理的細胞,凋亡細胞數(shù)量明顯增多,提示其對胃癌細胞凋亡產生了積極影響。

在初步探討了ANXA5蛋白對MGC-803細胞的增殖和凋亡作用后,探索其是否會限制癌細胞的遷移顯得十分重要。細胞劃痕實驗結果表明,外源ANXA5組細胞的遷移能力明顯降低,在蛋白水平上也得到證實。E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜蛋白,在上皮組織中主要介導細胞間以及細胞-基質的黏附反應,在維持組織結構完整性方面發(fā)揮重要作用[19],其是上皮間質轉化(EMT)發(fā)生的一種標志物和影響腫瘤細胞轉移的關鍵因子[20]。EMT是腫瘤細胞遷移和侵襲的關鍵調控機制,在腫瘤進展期間EMT被重新激活[21],部分上皮細胞間連接喪失,失去游離面-基底面極性,從而獲得遷移性和侵襲性[22]。ANXA5蛋白可能通過上調E-cadherin的表達從而抑制EMT,進而抑制腫瘤細胞的遷移能力。而MMP-9表達水平的降低也佐證了這一實驗結果,基質金屬蛋白酶(MMPs)能降解和重塑細胞外基質(ECM)[23],在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,其中MMP-9對EMT有輔助作用[24],MMP-9表達降低可減少腫瘤細胞的遷移。這些結果表明,ANXA5蛋白可抑制MGC-803細胞的遷移性能,從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。

本實驗一方面為進一步研究ANXA5在人胃癌中的作用提供了實驗依據(jù),另一方面證實ANXA5蛋白可以抑制人胃癌細胞的增殖和遷移,對細胞凋亡具有促進作用,可望促進胃癌藥物的開發(fā)并改善胃癌患者的治療。雖初步探討了ANXA5蛋白可能是通過對E-cadherin和MMP-9的調控作用進而影響細胞的遷移,但其在信號通路中的詳細作用機制尚未完全闡明。接下來我們將著重研究ANXA5對細胞侵襲性能的影響及探討其影響胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的確切機制。