吳海艷,姚 佳,饒國洲,李旭奎(西安交通大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科,西安 70004;西安交通大學口腔醫(yī)院陜西省顱頜面精準醫(yī)學研究重點實驗室;陜西省漢中市口腔醫(yī)院;通信作者,E-mail:lixukui@mail.xjtu.edu.cn)

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是涎腺第二常見惡性腫瘤,以持續(xù)的臨床病程和不良的長期預后為主要特征[1]。盡管采用包括手術和放療的多種治療方法,約16%-85%患者仍出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉移,而對這部分患者尚無有效的標準治療方案[2]。據(jù)報道,姑息性化療目前僅用于有癥狀或迅速進展的復發(fā)和/或轉移性疾病的患者,對控制局部癥狀有改善,但總體應答率較低且遠期療效不明確[3,4]。Bim是Bcl-2家族中僅含一個BH3結構域的促凋亡蛋白,其BH3結構決定了Bim的促凋亡活性;Bim除了在調(diào)節(jié)機體正常穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用,還是調(diào)控腫瘤發(fā)生的的關鍵蛋白[5]。目前發(fā)現(xiàn)其有三種異構體即BimHL、BimL和BimS,其中BimS的促凋亡活性最高[6]。我們前期的實驗通過構建轉染BimS真核質粒,在ACC-2細胞中過表達BimS蛋白,觀察到其對腫瘤細胞具有誘導凋亡作用[7]。為增強ACC-2細胞對化療藥物的敏感性、減少藥物毒副作用,本研究進一步利用分子生物學技術BimS過表達聯(lián)合常規(guī)化療藥物順鉑(DDP),探討其對人涎腺腺樣囊性癌細胞ACC-2抑制增殖和誘導凋亡的影響,為BimS協(xié)同化療藥物作為SACC的治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI-1640、FBS、胰蛋白酶(美國Gibco公司);MTT、DMSO(美國Sigma公司);細胞凋亡檢測試劑盒(美國Thermo Fisher公司);ACC-2細胞株(購于空軍軍醫(yī)大學);BimS過表達的ACC-2細胞株(前期研究[7]通過構建人BimS基因GV230真核過表達質粒pGV-BimS,穩(wěn)定轉染ACC-2細胞、驗證BimS過表達后凍存于本實驗室);順鉑(江蘇豪森公司);鼠抗人Bax、caspase-3、Bcl-2單抗(美國Santa Cruz公司),辣根酶標記的兔抗鼠IgG二抗(美國博士德公司),生物安全柜(海爾公司);臺式離心機(美國Sigma公司);CO2培養(yǎng)箱、酶標分析儀(美國Thermo公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);流式細胞儀(美國BD公司);蛋白電泳儀、自動凝膠成像分析儀(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復蘇ACC-2細胞和BimS過表達的ACC-2細胞于含有10%胎牛血清、1%青、鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞生長至80%-90%時經(jīng)胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞處理及分組 實驗一：選取ACC-2對數(shù)生長期細胞，分別添加0，2.5，5，10，20 μg/ml順鉑處理，繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

實驗二:分別選取ACC-2和BimS過表達的ACC-2對數(shù)生長期細胞(穩(wěn)定轉染pGV-BimS質粒48 h后),分為對照組(control組)、順鉑(DDP)組、BimS過表達組(BimS)和順鉑+BimS過表達(BimS+DDP)組。control組ACC-2細胞不作任何處理,DDP組、DDP+BimS組細胞中添加20 μg/ml順鉑處理,四組細胞置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 MTT檢測各組細胞增殖能力 收集1.2.2中實驗一及實驗二細胞,消化后制備細胞懸液,調(diào)整細胞密度為1×104個/ml接種96孔板,每組設3個平行孔,各組細胞分別培養(yǎng)12,24,48 h,在避光條件下向每孔加入20 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄上清,每孔加入150 μl DMSO,振蕩器混勻15 min,利用酶標儀檢測各孔570 nm處吸光度A值。生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.2.4 Western blot檢測Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白 收集1.2.2中實驗二細胞用試劑盒提取總蛋白,經(jīng)蛋白定量后做蛋白電泳,將蛋白轉至PVDF膜,室溫封閉1 h,洗膜,加入1 ∶500稀釋的Bcl-2、Bax和caspase-3鼠抗人抗體,4 ℃過夜,洗膜后加1 ∶500稀釋的帶辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG二抗,室溫孵育4 h,PBST洗膜,ECL發(fā)光檢測,全自動凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.2.5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況 收集1.2.2中實驗二細胞,按5×103/孔將每組細胞接種到96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng),分別于12,24,48 h用0.25%胰酶消化離心收集各組細胞,調(diào)細胞數(shù)為1×106個/孔,PBS洗滌2次,加入100 μl Binding Buffer和10 μl Annexin Ⅴ-FITC(20 μg/ml),室溫避光30 min,再將5 μl碘化丙啶(PI 50 μg/ml)加入各孔,避光反應5 min,加入400 μl Binding Buffer。同時以不加Annexin Ⅴ-FITC及PI的一管作陰性對照,立即上流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 BimS過表達聯(lián)合順鉑對細胞抑制率的影響

不同濃度順鉑顯著抑制ACC-2細胞的增殖，呈現(xiàn)出劑量依賴性。不同濃度順鉑處理12，24，48 h細胞抑制率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與12 h比較，不同濃度順鉑在24 h對細胞增值抑制率均明顯提高(P<0.05)，10 μg/ml組和20 μg/ml組在48 h對細胞抑制率顯著提高(P<0.01)，但不同濃度順鉑組24 h與48 h的細胞增殖抑制率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

本實驗選用20 μg/ml順鉑藥物濃度作為DDP組、BimS+DDP組的順鉑干預濃度。結果顯示，與DDP組、BimS組比較，BimS+DDP組12，24，48 h細胞增殖抑制率均明顯提高(P<0.01，見表2)。

2.2 BimS過表達聯(lián)合順鉑對蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與control組相比,DDP組和BimS組細胞的Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白相對表達水平具有明顯差異(P<0.05),BimS+DDP組蛋白表達差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與DDP組和BimS組相比,BimS+DDP組細胞中Bcl-2蛋白相對表達顯著降低,Bax和caspase-3蛋白相對表達顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1,2)。

表1 不同濃度順鉑、作用時間對ACC-2細胞增殖抑制率的影響

表2 BimS過表達聯(lián)合順鉑對ACC-2細胞抑制率的影響

2.3 BimS過表達聯(lián)合順鉑對細胞凋亡的影響

與control組相比，DDP組和BimS組處理細胞12，24，48 h細胞凋亡率均顯著升高(P<0.01)。與DDP組和BimS組相比，BimS+DDP組處理細胞12，24，48 h細胞凋亡率均顯著升高(P<0.01)；且與12 h和24 h相比，在48 h細胞凋亡率達最高(P<0.05,見表3)。

與control組相比，△P<0.05,△△P<0.01;與DDP組比較，*P<0.05；與BimS組比較，#P<0.05圖1 Western blot檢測各組Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白相對表達水平Figure 1 Relative expression of Bcl-2, Bax and Caspase-3 protein in each group by Western blot

表3 各組細胞凋亡率比較

3 討論

SACC是最常見的涎腺惡性腫瘤之一,也是口腔頜面部最具有特征的惡性腫瘤,雖然生長緩慢,卻具有較強的浸潤性和遠處轉移力[1]。對晚期復發(fā)轉移且不能手術的患者,缺乏有效治療手段,常規(guī)化療藥物的療效也不盡理想[2,8]。因此,開發(fā)新的化療藥物、探索新的藥物作用靶點、提高SACC對化療藥物的敏感性、提高遠期療效非常重要。

在生理和病理條件下,只有BH3結構域的Bim蛋白是啟動內(nèi)在凋亡通路的主要決定因素,它能夠直接激活多域促凋亡蛋白Bax/Bak,或者通過BH3結構域競爭性與Bcl-2結合,從而釋放Bax蛋白、激活線粒體途徑的細胞凋亡[9]。Bim缺失或表達降低與腫瘤發(fā)生和免疫疾病有關[10];而Bim過表達能夠抑制腫瘤生長及耐藥性[11,12]。研究已發(fā)現(xiàn)Bcl-2和Bcl-xl蛋白在SACC中過表達[13],而與BimS共享BH3結構域的NOXA顯著下調(diào),并與更侵襲性表型和較差的總生存率顯著相關[14]。近年來,大量的BH3模擬藥物在多種腫瘤中顯示出良好的前景,Acasigua等[15]則報道了BH3小分子擬合物能夠抑制腺樣囊性癌發(fā)生和復發(fā)。以上研究提示BimS可作為增強SACC細胞對化療敏感性的靶點。本研究探討B(tài)imS過表達蛋白是否能增強順鉑對ACC-2細胞的抗腫瘤活性,結果顯示:雖然BimS過表達和順鉑對ACC-2細胞均有一定的抑制增殖和誘導凋亡作用,但BimS過表達蛋白聯(lián)合順鉑對ACC-2細胞的生長抑制作用及誘導凋亡作用均明顯高于兩者的單一作用(P<0.01),BimS過表達蛋白聯(lián)合順鉑48 h細胞凋亡率可最高達(32.31±0.58)%。

此外,BimS過表達聯(lián)合順鉑組Bcl-2蛋白表達顯著降低,同時Bax和caspase-3蛋白表達增加,與順鉑組和BimS過表達兩組比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。大量研究表明,當Bcl-2蛋白表達增高與Bax形成二聚體抑制Bax活性時阻斷cyt-C的釋放抑制下游caspase-3的激活從而抑制細胞凋亡的發(fā)生[16,17]。因此,我們推測通過BimS過表達活化Bax蛋白或拮抗Bcl-2活性促進Bim信號通路啟動細胞凋亡線粒體途徑從而使ACC-2誘導發(fā)生凋亡。提示誘導BimS蛋白表達藥物能夠提高SACC對化療藥物順鉑的敏感性。因此,深入探討B(tài)imS在SACC中的表達變化及其協(xié)同現(xiàn)有抗癌藥物和化療藥物的作用關系和分子機制,有望為SACC的臨床治療提供新的作用靶點。