黨穎慧,萬陜寧,宋婷婷,鄭蕓蕓,李 佳,楊 紅(空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院婦產科,西安 710032;通信作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

Miller-Dieker綜合征(MDS)是一種罕見的常染色體遺傳病,是由位于17號染色體17p13.3區(qū)域的PAFAH1B1和/或YWHAE基因缺失或突變引起,又稱17p13.3缺失綜合征,它屬于無腦回畸形(agyria)中一類,臨床上以中樞神經系統(tǒng)異常包括無腦回小頭畸形、胼胝體缺如或發(fā)育不良為特點,伴有特征性面容等先天性異常。作為一種嚴重的大腦皮層發(fā)育畸形疾病,其發(fā)病率大約為1/13 000-1/20 000[1,2]。數據庫顯示該區(qū)域重復的患者常見的臨床表現(xiàn)有腦結構異常、先心病、發(fā)育遲緩、特殊面容等,是由Miller-Dieker綜合征區(qū)域內的關鍵基因重復導致的,由于該綜合征胎兒出生后預后較差,因此產前診斷該疾病顯得非常重要。

本文對5例產前超聲提示結構異常/血清學篩查異常的胎兒利用染色體微陣列分析技術(CMA)進行全基因組范圍內微缺失/微重復的檢測,評價CMA技術在產前診斷中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

孕婦1,29歲,孕28周因超聲檢查異?！跋刃牟?膜周部室間隔缺損,永存左上腔靜脈”行羊水穿刺。已產一男性,體健,此次為第二胎,孕婦否認近親婚配,無家族遺傳性病史及不良接觸史。

孕婦2,25歲,孕30周因超聲檢查異?！白髠葌饶X室前角旁小囊狀高信號,考慮室管膜下囊腫,雙側側腦室增寬,寬約1.2 cm,顱后窩池寬約1.3 cm”行羊水穿刺。此次為第一胎,孕婦否認近親婚配,無家族遺傳性病史及不良接觸史。

孕婦3,28歲,孕24+3周超聲檢查正常,因唐氏篩查提示“神經管缺陷高風險”行羊水穿刺。此次為第一胎,孕婦否認近親婚配,無家族遺傳性病史及不良接觸史。

孕婦4,23歲,孕26+2周因超聲檢查異?！跋刃牟　毙醒蛩┐?。此次為第一胎,孕婦否認近親婚配,無家族遺傳性病史及不良接觸史。

孕婦5,30歲,孕25+5周因超聲檢查異?！胺逅穆?lián)癥,右側側腦室寬1.1 cm”行羊水穿刺。此次為第二次懷孕,曾因骶尾部畸胎瘤引產一次,孕婦否認近親婚配,無家族遺傳性病史及不良接觸史。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 孕婦簽署知情同意書后,在超聲引導下經腹部行羊膜腔穿刺術,抽取羊水20 ml,其中10 ml按照常規(guī)方法進行細胞培養(yǎng),另外10 ml提取基因組DNA進行CMA檢測。

1.2.2 染色體核型分析 10 ml羊水離心后進行細胞培養(yǎng)、收獲、制片及G顯帶分析,按常規(guī)方法進行按照人類細胞遺傳學國際命名體系(ISCN)標準在油鏡下分析30個分裂象,采集3-5個核型圖(染色體分辨率應達到320條帶水平),如果出現(xiàn)染色體異常/多態(tài)性時,計數50個分裂相并增加分析的核型數。

1.2.3 CMA檢測 取10 ml羊水,基因組DNA提前按照試劑盒(QIAamp?DNA Blood Mini Kit)說明書操作,接著將樣本DNA與750k芯片(美國Affymetrix公司Cyto ScanTM)雜交,嚴格按照標準操作流程:酶切—連接—擴增—純化—片段化—標記—雜交—洗染—掃描,掃描獲得的數據應用ChAS(Chrosome Analysis Suite)軟件進行結果分析。

2 結果

2.1 染色體核型分析

5例羊水核型結果顯示:胎兒1、3、4、5核型未見異常,胎兒2核型結果為46,XN,-17,+der(17)t(15;17)(q24.1;p13.3),胎兒2的17號染色體短臂末端有增長,其遺傳自患有平衡易位父親異常的17號染色體,17號自身短臂缺少了,而是多了15號染色體一部分(見圖1)。

胎兒1,3,4,5未見異常,胎兒2的17號染色體短臂明顯有增長,其遺傳自父親(平衡易位)異常的17號染色體(箭頭所示)圖1 5例胎兒羊水染色體G顯帶核型結果Figure 1 Karyotypic results of 5 fetuses by chromosome G banding

2.2 CMA檢測

胎兒1結果顯示17p13.3p13.2區(qū)域出現(xiàn)3.58 Mb的重復,胎兒2結果顯示17p13.3區(qū)域發(fā)生2.15 Mb的缺失,胎兒3結果顯示17p13.3區(qū)域發(fā)生1 Mb的缺失,胎兒4結果顯示17p13.3區(qū)域發(fā)生1.66 Mb的缺失,胎兒5結果顯示17p13.3區(qū)域發(fā)生2.52 Mb的缺失,通過ChAS軟件進行結果分析,藍色代表該區(qū)域重復,紅色代表該區(qū)域缺失,結果見圖2。

胎兒1為17p13.3區(qū)域的重復,箭頭所指藍色區(qū)域;胎兒2,3,4,5為17p13.3區(qū)域的缺失,箭頭所指紅色區(qū)域圖2 5例胎兒羊水CMA檢測結果Figure 2 CMA results of amniotic fluid in 5 fetuses

3 討論

17p13.3缺失綜合征(OMIM:247200)遺傳學病因主要為涉及PAFAH1B1和/或YWHAE基因的染色體17p13.3區(qū)缺失/微缺失。患者的臨床表現(xiàn)主要包括無腦回、胼胝體發(fā)育不良、腦室擴大、小頭畸形、智力低下、發(fā)育遲緩、心臟畸形及異常面容(前額突出、短鼻、鼻孔上翹、上唇外凸),而數據庫顯示該區(qū)域重復的患者常見臨床表現(xiàn):腦結構異常、先心病、發(fā)育遲緩、特殊面容、智力殘疾、自閉癥譜系障礙等,此類特征是由Miller-Dieker綜合征區(qū)域內的關鍵基因重復導致的[3]。本文回顧性分析了5例17p13.3微缺失/微重復綜合征,旨在為此類綜合征的產前診斷提供參考。

本文中5例樣本檢測結果大小在1-3.6 Mb之間,文獻報道在這個區(qū)域有PAFAH1B1(以前是LIS1)、YWHAE和CRK基因。與MDS相關的缺失是可變的,大小從0.1 Mb到2.9 Mb不等。PAFAH1B1基因被認為是導致與該疾病相關的無腦畸形的原因,YWHAE被認為在MDS的發(fā)育遲緩和面部畸形中起一定作用,在神經元遷移中發(fā)揮重要作用,該基因的缺失可導致腦結構異常[4]。而CRK基因編碼一種信號蛋白,在細胞增殖、分化、遷移和軸突生長中起關鍵作用,是典型的生長受限的候選基因。胎兒1和5相關區(qū)域包含3個基因:PAFAH1B1、YWHAE和CRK,而胎兒2,3,4缺失區(qū)域包含YWHAE和CRK,這些均是具有明確致病的基因。胎兒1的17p13.3p13.2區(qū)域有約3.58 Mb的重復,該重復區(qū)域包含43個OMIM基因,與OMIIM數據庫中的17p13.3重復綜合征(OMIM:613215)有重疊區(qū)域,數據庫文獻顯示該區(qū)域重復的患者可能有腦異常、特殊面容、發(fā)育遲緩、先心病等臨床表現(xiàn)[5],5位孕婦對檢測結果進行遺傳咨詢后決定終止妊娠。

Miller-Dieker綜合征與17p13.3片段缺失有關,該缺失由17號染色體發(fā)生易位或倒位所致,可通過父母平衡易位攜帶遺傳或新發(fā)突變引起[6],研究預估約80%的病例是新發(fā),異常中約20%遺傳自父母重排染色體[7]。Chen等[8]研究29例Miller-Dieker綜合征病例中產前診斷羊水染色體核型未見異常占24%,其中包含高齡及習慣性流產,而超聲異常僅使用常規(guī)核型分析易導致該病漏診,該研究表明至少45%病例與父母染色體隱匿易位或倒位有關。但幾乎所有該綜合征患者的染色體變異是父親或母親生殖細胞形成過程中的自發(fā)變異,對于曾生育過該綜合征患兒的健康夫婦,再次生育此綜合征患兒的概率小于1%。

染色體核型分析可準確檢測染色體數目的變化和易位/倒位及大于5 Mb的結構異常,檢測結果準確可靠,是目前細胞遺傳學產前診斷的“金標準”,但其效率低(耗時長約15 d左右),增加孕婦等待結果的焦慮。羊水染色體核型結果提示正常是由于這些病例缺失/重復區(qū)域大小<5 Mb在鏡下肉眼不能分辨,正如本文中5例羊水樣本的檢測結果,其中胎兒2染色體核型分析發(fā)現(xiàn)17號染色體短臂有增長,其父親染色體核型為46,XY,t(15,17)(q24,p13),胎兒遺傳了父親異常的17號染色體。其他4例染色體核型未見異常,父母驗證未見異常,說明染色體拷貝數變異(CNVs)是新發(fā)的。

CMA技術能夠檢測出常規(guī)染色體核型不能發(fā)現(xiàn)的染色體微缺失和微重復,從而大大提高了染色體結構異常的檢出率。目前該項技術已被推薦作為不明原因生長發(fā)育遲緩、智力低下、自閉癥譜系障礙以及先天性畸形患兒的一線遺傳學檢測技術[9-12]。在產前診斷領域該技術也被推薦為產前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒存在結構異常的一線檢測方法[13,14]。文中胎兒3是由于“神經管缺陷高風險”該孕婦行羊水穿刺術選擇CMA技術進行檢測,結果17p13.3區(qū)域發(fā)生1 Mb的缺失?？梢娂韧鶛z測方法可能導致部分患病胎兒被漏診。因此,當染色體核型結果及超聲診斷結果均正常時,也不能完全排除染色體微缺失/微重復而導致的生長發(fā)育異常、先天畸形、智力低下等疾病。CMA技術能在全基因組范圍內檢測并精確定位染色體拷貝數變異,具有分辨率、通量及準確率均高等優(yōu)點,且無需細胞培養(yǎng),與傳統(tǒng)的染色體核型分析相比,具有明顯的優(yōu)越性,技術平臺也比較成熟,目前已被廣泛應用于產前診斷領域[15]。同時CMA技術的應用極大地提高了對已知疾病的檢測水平,以及對未知染色體微缺失/微重復綜合征的發(fā)現(xiàn),覆蓋了更多的疾病,對傳統(tǒng)的染色體核型分析也是一種補充和完善,提高了產前診斷的效率,同時也降低了胎兒出生缺陷的發(fā)生率,促進了臨床診斷和遺傳咨詢水平的提高。