姚蘇霞,薛紅波,王真祥,杜江鋒(山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)院,太原 0000;山西省疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生檢驗(yàn)二科;山西青山化工有限公司研發(fā)部;通信作者,E-mail:xuehongbo00@6.com)

熒光增白劑(fluorescent brightener)能夠吸收近紫外區(qū)域的光,并且發(fā)出藍(lán)光的有機(jī)化合物,具有良好的染色功能[1]。作為一種特殊的染料,其通過(guò)光補(bǔ)償?shù)脑韺?duì)發(fā)黃的織物進(jìn)行增白,使織物在光照下產(chǎn)生的藍(lán)光和黃色進(jìn)行疊加,通過(guò)白度的明顯增加,使物品顯得更加潔白和亮麗。近年來(lái),廣泛應(yīng)用于造紙、洗滌劑和涂料等多個(gè)領(lǐng)域[2]。隨著人民環(huán)保意識(shí)的提高,人民群眾越來(lái)越青睞淺色的衣物和紡織品,而熒光增白劑作為一種綠色環(huán)保的熒光染料,已經(jīng)成為淺色織物保持亮麗和鮮艷不可或缺的一部分。熒光增白劑的廣泛應(yīng)用,使人們?cè)诠ぷ骱蜕钪信c其接觸的概率也明顯增加;同時(shí)生產(chǎn)企業(yè)工作場(chǎng)所的內(nèi)部和外部空氣中也包含有大量懸浮的熒光增白劑粉塵,印染或者洗滌織物后,含有熒光增白劑的廢水會(huì)進(jìn)入環(huán)境中,這些有可能對(duì)人類(lèi)的身體健康帶來(lái)影響,因此熒光增白劑的生物安全性受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[3,4]。

作為“二苯乙烯基聯(lián)苯類(lèi)”和“雙三嗪氨基二苯乙烯類(lèi)”熒光增白劑的代表物,熒光增白劑CBS(染料索引編號(hào):C.I.F.B.351)和熒光增白劑CXT(染料索引編號(hào):C.I.F.B.71)及其不同劑型的衍生物,是目前在洗滌劑和印染領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的兩個(gè)品種。CBS和CXT具備良好的低溫溶解性、物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、增白效果均一、耐漂白等優(yōu)異性能。近年來(lái),隨著合成洗滌劑,尤其是液體洗滌劑的飛快發(fā)展,對(duì)CBS和CXT的需求量越來(lái)越多,這也使人們對(duì)其生物安全性有了更多的擔(dān)憂(yōu)[5]。熒光增白劑的生物安全性評(píng)價(jià)應(yīng)該綜合考慮各個(gè)方面,包括其進(jìn)入生物體后與蛋白質(zhì)、DNA、組織、生物體液等體內(nèi)組織的相互作用。雖然已有相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了報(bào)道[6-8],但是以前實(shí)驗(yàn)都是把動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,而在細(xì)胞層次的研究很少有報(bào)道。商品化的熒光增白劑中除了熒光增白劑成分以外,還有一些反應(yīng)的副產(chǎn)物,有機(jī)溶劑和無(wú)機(jī)鹽等,但是產(chǎn)品的主體成分的色譜純度都在90%以上[9-11]。本文選用熒光增白劑CBS和CXT分別作為不同化學(xué)結(jié)構(gòu)熒光增白劑的代表,使用人支氣管上皮細(xì)胞16HBE和人正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCaT分別作為研究對(duì)象,研究熒光增白劑對(duì)呼吸道細(xì)胞和皮膚細(xì)胞的生物安全性影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

熒光增白劑CBS和CXT(山西青山化工有限公司),純度:CBS和CXT均大于95%;溶解熒光增白劑的超純水(Milli-Q凈水系統(tǒng));細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、DMEM、胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素(上海Gibco有限公司);細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning中國(guó)有限公司);細(xì)胞活力檢測(cè)試劑MTT(日本同仁化學(xué)研究所);DCFH-DA和凋亡檢測(cè)試劑盒(上海前塵生物科技有限公司);其余化學(xué)試劑均購(gòu)自北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫1260),細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司Forma Series II),流式細(xì)胞儀C6(美國(guó)BD公司),紅外線(xiàn)染色機(jī)(美國(guó)SDL ATLAS公司ECO),Zetasizer Nano S90(英國(guó)馬爾文儀器有限公司),酶標(biāo)儀(Tecan公司TECAN Infinite M200),分光測(cè)色儀(美國(guó)HunterLab公司UltraScan PRO),掃描電子顯微鏡(日立S-4800),島津高效液相色譜儀SPD-10AVP,熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯IX71),全自動(dòng)卡爾費(fèi)休水分儀(瑞士C30)。

1.3 物理化學(xué)性質(zhì)表征分析

配備10 μg/ml的CBS和CXT溶液,然后裝在專(zhuān)用的比色皿中用以檢測(cè)粒徑分布和Zeta電勢(shì),分別將CBS和CXT固體粉末涂抹在專(zhuān)用膠帶上,使用倒置顯微鏡對(duì)其表面形貌進(jìn)行分析,同時(shí)將CBS和CXT的水溶液滴在專(zhuān)用膠帶上,待其晾干后,使用倒置顯微鏡再次觀察材料析出后的表面形貌。使用C18反相柱,以甲醇和水為流動(dòng)相,分析CBS和CXT的色譜純度。使用紅外染色法對(duì)兩種熒光增白劑對(duì)棉布的增白強(qiáng)度進(jìn)行分析。水不溶物按照目視判定法進(jìn)行判定,使用紫外分光光度計(jì)對(duì)消光系數(shù)進(jìn)行檢測(cè),熒光增白劑所含水分使用全自動(dòng)水分儀進(jìn)行檢測(cè)。使用紅外線(xiàn)試色機(jī)對(duì)棉布進(jìn)行染色,利用白度測(cè)定儀對(duì)熒光增白劑的增白效果進(jìn)行測(cè)定。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

分別稱(chēng)量不同質(zhì)量的熒光增白劑CBS和CXT,然后攪拌溶解在超純水中,配置成不同濃度的液體(0,10,25,50,100,200,400,600,800,1 000 μg/ml)待用。人支氣管上皮細(xì)胞16HBE和人正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞HaCaT分別使用RPMI-1640和DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中含有10%的血清和1%的青霉素-鏈霉素。所有細(xì)胞的培養(yǎng)都維持在37 ℃、含有5%CO2的濕潤(rùn)條件中。16HBE細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞首先在培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)至第5天時(shí),在96孔板中,每孔接種約8 000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,將不同濃度的CBS和CXT溶液(0,10,25,50,100,200,400,600,800,1 000 μg/ml)加入到96孔板中與細(xì)胞進(jìn)行孵育,孵育24 h后,將上清液吸出,使用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.4)清洗3遍,然后加入MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)試劑,細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)30 min-2 h,然后加入二甲基亞砜(DMSO)溶解細(xì)胞內(nèi)生成的結(jié)晶紫,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞液在490 nm處的吸光度。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

通過(guò)研究與熒光增白劑作用后的細(xì)胞凋亡情況,可充分反映熒光增白劑對(duì)細(xì)胞是否會(huì)產(chǎn)生急性或慢性毒性。首先我們將16HBE和HaCaT細(xì)胞被分別接種在6孔板中,細(xì)胞接種密度為5×104個(gè),分別使用RPMI-1640和DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),然后將所有的孔分成4組,每組平行3個(gè)孔。4個(gè)組分別為:對(duì)照組、50 μg/ml熒光增白劑組、100 μg/ml熒光增白劑組,200 μg/ml熒光增白劑組。當(dāng)六孔板中的細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%時(shí),各個(gè)熒光增白劑組分別與對(duì)應(yīng)濃度的材料孵育24 h,然后將綠色熒光標(biāo)記的Annexin Ⅴ和PI工作液加入到六孔板中,染色1 h,綠色熒光標(biāo)記的Annexin Ⅴ可以與細(xì)胞膜外翻后暴露的磷酯酰絲氨酸結(jié)合,反映細(xì)胞早期和晚期凋亡情況,可產(chǎn)生紅色熒光的PI可以穿過(guò)破壞的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核,和染色質(zhì)結(jié)合,反應(yīng)細(xì)胞晚期凋亡情況。將細(xì)胞消化、離心洗滌3次,棄掉游離的綠色熒光標(biāo)記的Annexin Ⅴ和PI,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞不同熒光的強(qiáng)度,綠色熒光代表細(xì)胞發(fā)生早期凋亡、紅色熒光代表細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡。Q1-LL區(qū)域代表正常細(xì)胞,Q1-LR區(qū)域代表早期凋亡細(xì)胞,Q1-UR代表晚期凋亡細(xì)胞,Q1-UL區(qū)域代表壞死細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 熒光增白劑的物理化學(xué)性質(zhì)

熒光增白劑CBS和CXT及其不同劑型的衍生物的分子式見(jiàn)圖1。我們分別對(duì)其消光系數(shù)、棉布增白強(qiáng)度、含水量、水不溶物、色譜純度和Zeta電勢(shì)進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 熒光增白劑CXT和CBS及其不同劑型的分子結(jié)構(gòu)式Figure 1 The formula of fluorescent brighteners CXT and CBS

表1 熒光增白劑CXT和CBS的物理化學(xué)參數(shù)

從表1中可以看出,實(shí)驗(yàn)選取的兩種熒光增白劑各項(xiàng)指標(biāo)均符合產(chǎn)品出廠的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo),色譜純度均在95%以上,對(duì)棉布的增白強(qiáng)度也都達(dá)到了99%以上,具有良好的染色效果。Zeta電勢(shì)結(jié)果顯示,CXT和CBS熒光增白劑的電勢(shì)-23.8 mV和-13.8 mV。熒光增白劑CBS和CXT從水溶液中析出后,顯微鏡圖片顯示CBS其呈塊狀、大小尺寸不一,但具有明顯的晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2A)。CXT呈均勻細(xì)小的粉末狀,無(wú)明顯的晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2B)。掃描電子顯微鏡圖片顯示,熒光增白劑CBS為眾多細(xì)小的薄片層狀結(jié)構(gòu)堆積形成的團(tuán)塊結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖2C),熒光增白劑CXT為小顆粒和大塊狀材料的混合體,但是整體的尺寸要明顯小于熒光增白劑CBS(見(jiàn)圖2D)。動(dòng)態(tài)光散射儀結(jié)果顯示熒光增白劑CBS溶液的水合粒徑約為136.6 nm(見(jiàn)圖3A),CXT溶液的水合粒徑約為122.3 nm(見(jiàn)圖3B)。

A.熒光增白劑CBS粉末的顯微鏡成像 B.熒光增白劑CXT粉末的顯微鏡成像 C.熒光增白劑CBS粉末的掃描電子顯微鏡成像 D.熒光增白劑CXT的SEM成像圖2 熒光增白劑CBS和CXT的形貌Figure 2 Morphology of fluorescent brighteners CBS and CXT

A.熒光增白劑CBS的水合粒徑 B.熒光增白劑CXT的水合粒徑圖3 動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)熒光增白劑CBS和CXT溶于水后的粒徑分布Figure 3 The size distribution of fluorescent brighteners in water by dynamic light scattering

2.2 熒光增白劑的細(xì)胞毒性結(jié)果

細(xì)胞活力研究結(jié)果顯示16HBE和HaCaT細(xì)胞有著濃度依賴(lài)效應(yīng)的毒性(見(jiàn)圖4)。但這兩種細(xì)胞的耐受性還是有明顯的區(qū)別,對(duì)于熒光增白劑CBS,當(dāng)其濃度達(dá)到100 μg/ml時(shí),16HBE細(xì)胞的細(xì)胞活力下降到了80%左右;而對(duì)于熒光增白劑CXT,當(dāng)其濃度達(dá)到100 μg/ml時(shí),16HBE細(xì)胞的細(xì)胞活力下降到了90%左右。而相對(duì)于HaCaT細(xì)胞,當(dāng)熒光增白劑CBS和CXT濃度均達(dá)到600 μg/ml時(shí),其細(xì)胞活力下降到了80%左右。

我們使用顯微鏡觀察了細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,發(fā)現(xiàn)在與200 μg/ml濃度的CBS和CXT作用24 h后,除極少量細(xì)胞死亡懸浮的培養(yǎng)液的上層,大部分的細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯改變(見(jiàn)圖5)。

圖4 不同濃度熒光增白劑CBS和CXT對(duì)16HBE和HaCaT細(xì)胞活力的影響Figure 4 The cell viability of 16HBE and HaCaT cells after cultured with various concentrations of fluorescent brighteners for 24 h

A.16HBE細(xì)胞正常形態(tài);B.16HBE細(xì)胞與200 μg/ml熒光增白劑CBS溶液作用24 h;C.16HBE細(xì)胞與200 μg/ml熒光增白劑CXT溶液作用24 h;D.HaCaT細(xì)胞正常形態(tài);E.HaCaT細(xì)胞與200 μg/ml熒光增白劑CBS溶液作用24 h;F.HaCaT細(xì)胞與200 μg/ml熒光增白劑CXT溶液作用24 h圖5 熒光增白劑CBS和CXT對(duì)16HBE和HaCaT細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Figure 5 The morphology of 16HBE and HaCaT cells after incubation with fluorescent brighteners CBS and CXT

流式細(xì)胞儀聯(lián)合凋亡試劑檢測(cè)結(jié)果顯示,無(wú)論是對(duì)于16HBE細(xì)胞還是HaCaT細(xì)胞,熒光增白劑CBS和CXT濃度即使達(dá)到200 μg/ml,也均未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖6-9)。

圖6 不同濃度熒光增白劑CBS對(duì)16HBE細(xì)胞的凋亡影響Figure 6 Effect of fluorescent brighteners CBS on apoptosis of 16HBE cells by flow cytometric analysis

圖7 不同濃度熒光增白劑CBS對(duì)HaCaT細(xì)胞的凋亡影響Figure 7 Effect of fluorescent brighteners CBS on apoptosis of HaCaT cells by flow cytometric analysis

圖8 不同濃度熒光增白劑CXT對(duì)16HBE細(xì)胞的凋亡影響Figure 8 Effect of fluorescent brighteners CXT on apoptosis of 16HBE cells by flow cytometric analysis

圖9 不同濃度熒光增白劑CXT對(duì)HaCaT細(xì)胞的凋亡影響Figure 9 Effect of fluorescent brighteners CXT on apoptosis of HaCaT cells by flow cytometric analysis

3 討論

熒光增白劑CBS和CXT每年產(chǎn)量的大部分都被用在洗滌劑領(lǐng)域,如被添加在洗衣粉、洗衣液、肥皂和皂粉中,廣泛的應(yīng)用在人民群眾的日常生活中,所以研究其潛在的毒理學(xué)特征具有重要的意義。本文分別選取了呼吸系統(tǒng)中的16HBE細(xì)胞和皮膚系統(tǒng)中的HaCaT細(xì)胞做為研究對(duì)象,以評(píng)價(jià)熒光增白劑對(duì)呼吸系統(tǒng)和皮膚系統(tǒng)的毒理學(xué)效應(yīng)。

首先,我們分別使用倒置顯微鏡、掃描電子顯微鏡和粒度分布儀對(duì)兩種熒光增白劑的形貌、尺寸和電勢(shì)進(jìn)行了檢測(cè),這3個(gè)指標(biāo)對(duì)于熒光增白劑的溶解性均有一定的影響。一般來(lái)講,電勢(shì)負(fù)值越大,其溶解性越好。但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)熒光增白劑CBS的溶解性要明顯好于CXT,這是因?yàn)闊晒庠霭讋〤BS的晶型結(jié)構(gòu)、片層式堆積更有利于其溶解。這說(shuō)明,在這兩種熒光增白劑中,晶型結(jié)構(gòu)對(duì)溶解性起著更為關(guān)鍵的作用。熒光增白劑CBS和CXT的水合粒徑與棉布的纖維間隙較為匹配,使得熒光增白劑分子在洗滌過(guò)程中能夠有效的“鑲嵌”在布料中,從而達(dá)到增白的效果。研究顯示,材料的尺寸對(duì)其生物效應(yīng)有著重要的影響[12]。熒光增白劑的尺寸大小對(duì)細(xì)胞攝入和外排效應(yīng)也有一定的影響,因此檢測(cè)熒光增白劑的大小和尺寸就顯得極為重要。

緊接著,我們選取熒光增白劑CBS和CXT不同濃度的溶液(50,100,200 μg/ml)用來(lái)研究其對(duì)16HBE細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞活力和凋亡壞死的影響,以了解熒光增白劑對(duì)細(xì)胞的毒理學(xué)效應(yīng)。MTT法是一種經(jīng)典的細(xì)胞活力評(píng)價(jià)手段,檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明熒光增白劑CBS相對(duì)于CXT,其對(duì)呼吸系統(tǒng)的毒性更為明顯,而對(duì)皮膚系統(tǒng)來(lái)講,這兩種熒光增白劑沒(méi)有明顯的區(qū)別。這說(shuō)明皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的耐受性要優(yōu)于呼吸系統(tǒng)的細(xì)胞,這和細(xì)胞自身的生理功能也有著密切的關(guān)系。相對(duì)于呼吸系統(tǒng)的上皮細(xì)胞,角質(zhì)形成細(xì)胞可以產(chǎn)生增強(qiáng)皮膚硬度和防水功能的角蛋白,有效地抑制其對(duì)熒光增白劑的攝入,進(jìn)而降低外來(lái)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果顯示,無(wú)論是熒光增白劑CBS還是CXT,即使在200 μg/ml的濃度下,所有的細(xì)胞正常排列接觸生長(zhǎng),細(xì)胞體積未明顯縮小,胞膜完整無(wú)小泡,這說(shuō)明熒光增白劑并不會(huì)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)產(chǎn)生明顯的影響。

當(dāng)細(xì)胞與能引起損傷的因子作用到一定強(qiáng)度或持續(xù)一定時(shí)間時(shí),細(xì)胞會(huì)分泌一些產(chǎn)物調(diào)控細(xì)胞發(fā)生程序性死亡而不伴隨炎癥的發(fā)生,如細(xì)胞膜表面出現(xiàn)囊泡、細(xì)胞膜外翻等,從而保護(hù)機(jī)體的健康,這個(gè)過(guò)程叫做細(xì)胞凋亡。在凋亡階段,細(xì)胞膜的通透性未發(fā)生明顯改變,所以只有綠色熒光素標(biāo)記的Annexin Ⅴ可以與早期和中期凋亡的細(xì)胞結(jié)合,而發(fā)射紅色熒光的PI染料不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞對(duì)細(xì)胞核染色。細(xì)胞壞死是受到了強(qiáng)烈的理化或生物因素影響,導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)序變化的一種死亡過(guò)程,其細(xì)胞膜被破壞,細(xì)胞核內(nèi)染色體發(fā)生濃縮、碎裂或者溶解分解,此時(shí)PI可以進(jìn)入細(xì)胞核對(duì)DNA進(jìn)行染色。因此,利用流式細(xì)胞儀結(jié)合凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡是一種經(jīng)典可靠的評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的手段。正常的細(xì)胞中,磷酯酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡早期時(shí)其會(huì)外翻至胞膜外側(cè),從而與熒光素標(biāo)記的Annexin Ⅴ結(jié)合。PI不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,但是可以進(jìn)入處于凋亡晚期的細(xì)胞核內(nèi),進(jìn)而將細(xì)胞核染紅。細(xì)胞凋亡的流式數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了前述結(jié)論,即使在200 μg/ml熒光增白劑的作用下,也未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡,這說(shuō)明熒光增白劑CBS和CXT在和呼吸道或者皮膚表層細(xì)胞發(fā)生接觸后,只是降低細(xì)胞的活力,不能破壞細(xì)胞膜的完整性。以上結(jié)論證實(shí)熒光增白劑對(duì)細(xì)胞的影響是一種溫和的、緩慢的刺激,可能會(huì)降低線(xiàn)粒體的功能,導(dǎo)致細(xì)胞活力降低,但是不會(huì)使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

一般來(lái)講,熒光增白劑CBS或者CXT在洗滌劑生產(chǎn)中的添加量一般為0.01%-0.4%,而洗滌劑在實(shí)際使用時(shí)還會(huì)再被稀釋100-1 000倍,即熒光增白劑最終與消費(fèi)者接觸時(shí)的濃度僅有4-40 μg/ml。在該濃度條件下,無(wú)論是CBS還是CXT,均不會(huì)對(duì)呼吸道或者皮膚表面的細(xì)胞造成毒性損傷。但對(duì)于直接暴露在熒光增白劑粉塵中的職業(yè)人員來(lái)講,還是需要做好一定的防護(hù)措施,以防止工人直接暴露于高濃度的熒光增白劑粉塵中。