尚文麗,張瑩瑩,陳芬芬,王貴佐,韓 冬(陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安 70068;西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科;西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部保健辦公室;通信作者,E-mail:sesory@yeah.net)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension,PAH)是由多種因素引起的肺血管功能及結(jié)構(gòu)性異常,導(dǎo)致肺血管阻力增加,引起肺動(dòng)脈壓力升高的臨床綜合征,嚴(yán)重者可導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡[1]。PAH的發(fā)病機(jī)制包括:肺血管緊張性增高、肺血管重塑和原位血栓形成[2]。肺血管重塑是PAH的主要病理學(xué)基礎(chǔ),目前普遍認(rèn)為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的增殖及其向內(nèi)膜下的遷移是肺血管重塑的主要病理機(jī)制[3]。因此,闡明PASMCs異常增殖的分子生物學(xué)機(jī)制及尋找相關(guān)的干預(yù)措施,明確有效的治療靶點(diǎn)是目前PAH治療的關(guān)鍵。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種廣泛參與人體內(nèi)能量代謝活動(dòng)的重要蛋白激酶[4],其常見激動(dòng)劑有二甲雙胍及AICAR等。研究發(fā)現(xiàn),激活A(yù)MPK可抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH模型的發(fā)生[5],其作用機(jī)制尚待研究。一項(xiàng)人頭頸部鱗癌細(xì)胞中的研究[6]發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可劑量依賴性地抑制癌細(xì)胞系的生長。與此同時(shí),二甲雙胍上調(diào)了磷酸化AMPK的蛋白水平并下調(diào)了S期蛋白相關(guān)激酶2(S phase kinase associated protein 2,Skp2)的表達(dá)。另一項(xiàng)小鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),敲除AMPKα2可上調(diào)Skp2的表達(dá)并下調(diào)P27的蛋白水平[7]。然而激活A(yù)MPK對大鼠PAH模型發(fā)生的抑制作用是否通過調(diào)控Skp2/P27信號通路尚不明確。

在本研究中,我們應(yīng)用野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠模型,評估二甲雙胍激活A(yù)MPK信號通路抑制PAH模型發(fā)生的可能機(jī)制,為肺動(dòng)脈高壓治療提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

選用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的4周齡近交系雄性SD大鼠30只,體質(zhì)量在200-250 g之間。二甲雙胍(格華止,國藥準(zhǔn)字H20023371),由上海施貴寶制藥有限公司提供。野百合堿(monocrotaline,MCT)購于美國Sigma-Aldrich公司。兔抗鼠AMPK、p-AMPK、Skp2、P27、GAPDH一抗購于美國Cell Signaling Technology公司,HRP偶聯(lián)的羊抗兔抗體由美國Sigma-Aldrich公司提供,RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組和模型構(gòu)建

將4周齡體質(zhì)量200-250 g的30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組:對照組、PAH組和PAH+二甲雙胍治療組(簡稱為二甲雙胍組)。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,PAH組按60 mg/kg腹腔注射野百合堿(Day 1);二甲雙胍組按60 mg/kg腹腔注射野百合堿(Day 1),并按150 mg/(kg·d)腹腔注射二甲雙胍(Day 1-28);對照組腹腔注射等量生理鹽水(Day 1-28)。大鼠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級動(dòng)物房。

1.3 右心室收縮壓測定

通過血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測確定PAH大鼠模型構(gòu)建是否成功,10%水合氯醛(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠,從右側(cè)頸外靜脈插入微導(dǎo)管,通過壓力傳感器及多導(dǎo)生理記錄儀測定大鼠右心室收縮壓(right ventricle systolic pressure,RVSP),待壓力波形圖平穩(wěn)后記錄三組數(shù)據(jù),計(jì)算平均值。

1.4 右心室肥大指數(shù)測定

將心臟去除左、右心房,沿室間隔(interventricular septum,S)分離左、右心室,生理鹽水沖洗后濾紙吸干,分別稱量右心室(right ventricular,RV)、室間隔加左心室(left ventricular,LV)質(zhì)量,計(jì)算右心肥大指數(shù)[RV/(LV+S)]。

1.5 肺臟蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察肺血管病理學(xué)

取出分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液固定,石蠟包埋,切片(6 μm),蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺血管病理學(xué)變化。

1.6 免疫印跡法檢測AMPK、p-AMPK、Skp2及P27

精密稱取各組大鼠肺組織,根據(jù)RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿,肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg ∶7.5 μl,用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解1 h后,14 000 r/min離心20 min,取上清,利用Western blot檢測各組大鼠肺組織Skp2(稀釋度1 ∶1 000)及P27(稀釋度1 ∶1 000)表達(dá)、AMPK(稀釋度1 ∶500)及p-AMPK(稀釋度1 ∶500)變化,Skp2及P27表達(dá)應(yīng)用GAPDH(稀釋度1 ∶5 000)作為內(nèi)參校正。Image Lab圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度值的測量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況觀察

對照組大鼠食量穩(wěn)定,皮毛光澤,呼吸、心跳平穩(wěn),活動(dòng)自如,體質(zhì)量明顯增加,無死亡;PAH組大鼠食量減少,皮毛粗糙,活動(dòng)減少,體質(zhì)量增加緩慢,4周內(nèi)總計(jì)死亡4只;二甲雙胍組大鼠與PAH組相比,食量有所增加,毛發(fā)稍光滑,活動(dòng)增多,體質(zhì)量較PAH組增加,狀態(tài)明顯好于PAH組,且大鼠無死亡。

2.2 右心室收縮壓及右心室肥大指數(shù)

造模4周后測定大鼠右心室收縮壓(RVSP)及計(jì)算各組大鼠右心肥大指數(shù)[RV/(LV+S)]。PAH組RVSP較對照組明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(45.88±3.45)mmHgvs(22.36±2.19)mmHg,P<0.05,見圖1],提示肺動(dòng)脈高壓模型建立成功;而二甲雙胍組RVSP[(29.81±1.97)mmHg]較PAH組顯著下降(P<0.05,見圖1),提示二甲雙胍可顯著降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈壓力增高。同樣與對照組相比,PAH組RV/(LV+S)顯著增加[(58.97±3.62)%vs(15.94±0.87)%,P<0.05,見圖1],提示PAH組大鼠右心室明顯肥厚;而二甲雙胍組RV/(LV+S)[(32.80±3.05)%]較PAH組則顯著降低(P<0.05,見圖1),提示二甲雙胍可顯著抑制右心室重構(gòu)的發(fā)生。

與對照組比較,#P<0.05;與PAH組比較,*P<0.05圖1 二甲雙胍抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的發(fā)生Figure 1 Metformin prevents against MCT-induced PAH

2.3 肺血管病理學(xué)HE染色

各組大鼠的肺血管病理形態(tài)學(xué)改變?nèi)缦?光鏡下可見對照組大鼠肺小動(dòng)脈管壁厚薄較一致,形態(tài)規(guī)則,血管腔內(nèi)壁及外周均未見炎細(xì)胞浸潤(見圖2)。而PAH組大鼠肺小動(dòng)脈管壁明顯增厚,管腔狹窄嚴(yán)重,內(nèi)膜處可見大量炎性細(xì)胞浸潤;肺血管損傷明顯,大量的血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性,部分已突向血管腔內(nèi),甚至出現(xiàn)壞死、脫落(見圖2)。二甲雙胍組肺小動(dòng)脈管壁增厚較PAH組明顯改善,其炎細(xì)胞浸潤及內(nèi)皮損傷亦較PAH組減輕(見圖2)。

2.4 總AMPK及磷酸化AMPK蛋白的水平

Western blot結(jié)果顯示,三組的T-AMPK蛋白水平無明顯差異(見圖3);PAH組p-AMPK蛋白水平較對照組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而二甲雙胍組的p-AMPK蛋白水平與對照組相比無顯著差異,而較PAH組顯著升高(P<0.05,見圖3)。

2.5 二甲雙胍抑制野百合堿誘發(fā)的Skp2表達(dá)增高

Western blot結(jié)果顯示,PAH組Skp2蛋白表達(dá)水平較對照組顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而二甲雙胍組Skp2蛋白水平較PAH組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

2.6 二甲雙胍逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)的P27表達(dá)減低

Western blot結(jié)果顯示,PAH組P27表達(dá)水平較對照組顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而二甲雙胍組P27蛋白水平較PAH組顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

圖2 各組大鼠肺小動(dòng)脈HE染色 (×200)Figure 2 HE-staining of small pulmonary vessels in rats (×200)

與對照組比較,#P<0.05;與PAH組比較,*P<0.05圖3 Western blot檢測二甲雙胍對肺組織內(nèi)AMPK磷酸化水平的影響Figure 3 Effects of metformin on the phosphorylation of AMPK in rat lung tissues by Western blot

與對照組比較,#P<0.05;與PAH組比較,*P<0.05圖4 Western blot檢測二甲雙胍對肺組織內(nèi)Skp2表達(dá)的影響Figure 4 Effects of metformin on the expression of Skp2 protein in rat pulmonary tissues by Western blot

與對照組比較,#P<0.05;與PAH組比較,*P<0.05圖5 Western blot檢測二甲雙胍對肺組織內(nèi)P27表達(dá)的影響Figure 5 Effects of metformin on the expression of P27 protein in rat pulmonary tissues by Western blot

3 討論

細(xì)胞增殖與細(xì)胞增殖周期相關(guān),而細(xì)胞增殖周期受細(xì)胞周期蛋白(cyclin)及其依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)和CDK抑制物(CDK inhibitor,CDKI)的共同調(diào)控。P27是抑制細(xì)胞增殖的重要因子之一[8]。近年來動(dòng)物模型和細(xì)胞層面的研究發(fā)現(xiàn),PAH時(shí)P27是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中唯一表達(dá)量顯著減少的CDKI,上調(diào)P27可抑制PASMC增殖,抑制肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生[9-11]。Skp2是P27泛素化降解過程中的一個(gè)重要調(diào)控分子,其過表達(dá)可下調(diào)P27的蛋白水平[12,13]。

Gao等[9]研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀可降低左肺全切并野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的mPAP和右室肥大指數(shù),并可上調(diào)P27的表達(dá)。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾可通過上調(diào)P27的表達(dá),抑制血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells,HPASMCs)增殖。另一項(xiàng)研究[11]發(fā)現(xiàn),PPARδ的特異性配體GW501516,可通過激活PPARδ上調(diào)P27的表達(dá),并顯著抑制PDGF誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。以上這些研究表明,通過不同途徑上調(diào)P27的表達(dá),可抑制體外培養(yǎng)的PASMCs的過度增殖,并抑制PAH動(dòng)物模型中肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。

被藥理學(xué)方法激活的AMPK,可抑制Skp2介導(dǎo)的P27的降解,上調(diào)P27的表達(dá)。Song等[7]在一項(xiàng)小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),敲除AMPKα2可上調(diào)Skp2的表達(dá)并下調(diào)P27的水平。另一項(xiàng)人頭頸部鱗癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可上調(diào)磷酸化AMPK的蛋白水平并下調(diào)Skp2的表達(dá),劑量依賴性地抑制癌細(xì)胞系的生長[6]。本研究中,野百合堿誘發(fā)的PAH大鼠模型中肺組織Skp2蛋白水平顯著升高,P27蛋白水平明顯降低,提示Skp2/P27信號通路的失衡參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生。模型動(dòng)物經(jīng)AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍治療后,肺組織中AMPK磷酸化水平顯著升高,Skp2的過表達(dá)被抑制,P27蛋白水平基本恢復(fù)正常。提示激活A(yù)MPK可抑制Skp2的過表達(dá),減少P27的泛素化降解,從而抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的過度增殖,進(jìn)一步抑制肺血管重塑的發(fā)生。

本研究中我們發(fā)現(xiàn),在野百合堿誘發(fā)的PAH大鼠模型中,存在著明顯的肺血管重塑,表現(xiàn)為肺血管壁明顯增厚,中膜平滑肌細(xì)胞層增厚,導(dǎo)致肺小動(dòng)脈管腔嚴(yán)重狹窄甚至阻塞。血流動(dòng)力學(xué)檢測提示肺動(dòng)脈壓力顯著增高;右心室質(zhì)量增加,提示右心室肥厚。上述結(jié)果表明,由PASMCs異常增殖導(dǎo)致的肺血管重塑在PAH的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。而目前大多數(shù)PAH的靶向治療藥物,其治療靶點(diǎn)多為擴(kuò)張肺血管,而對PASMCs的異常增殖無顯著作用。因此,建立新的治療思路,尋求新的治療靶點(diǎn),開發(fā)新的靶向治療藥物,抑制介導(dǎo)PASMCs增殖信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié),重建失衡的信號通路,預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)PASMCs的增殖,應(yīng)該是目前抑制肺血管重塑,治療PAH的主要研究方向。

本研究顯示二甲雙胍通過激活A(yù)MPK抑制大鼠PAH模型的發(fā)生,這種保護(hù)作用伴隨Skp2表達(dá)下調(diào)及P27蛋白水平上調(diào),提示激活A(yù)MPK抑制野百合堿誘導(dǎo)大鼠PAH模型的保護(hù)作用可能與調(diào)控Skp2/P27信號通路有關(guān)。本研究為肺動(dòng)脈高壓的防治提供了新思路。