王凱旋,李明新,陳 玲,彭馳偉,陳 薇(桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室,桂林 5400;桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科;通信作者,E-mail:daicw04@63.com)

近年來(lái),大量的納米材料被不斷地制備和研究,在工業(yè)生產(chǎn)中,納米粒子是冶煉中常見(jiàn)的副產(chǎn)物,金屬氧化物納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)各種冶金過(guò)程分散到空氣中[1],有研究表明停留在鼻黏膜上的納米粒子被認(rèn)為可以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2,3]。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,因?yàn)榧{米材料獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與性質(zhì),可以更容易地跨過(guò)血腦屏障,避免藥物傳遞問(wèn)題[4],所以納米粒子用于神經(jīng)診斷和神經(jīng)治療要比傳統(tǒng)方法更好[5,6];與此同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)部分納米顆粒可導(dǎo)致神經(jīng)毒性、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性變等[7-10]。因此納米粒子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)潛在的毒性也將成為評(píng)價(jià)納米材料生物安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

氧化石墨烯(graphene oxide,GO)又稱(chēng)功能化石墨烯,是一種由碳原子組成的單層蜂窩晶格材料,作為化學(xué)轉(zhuǎn)化石墨烯的前體,目前在新能源汽車(chē)、橡膠等方面研究和產(chǎn)業(yè)化已取得較大進(jìn)展。且因GO具有生產(chǎn)成本低、比表面積大、溶解度高、表面含有氧化基團(tuán)易于引入功能基團(tuán)進(jìn)行功能改進(jìn)等優(yōu)勢(shì),其在生物醫(yī)學(xué),包括微生物檢測(cè)、生物元件、疾病診斷和藥物輸運(yùn)系統(tǒng)等的領(lǐng)域研究日漸矚目[11-13]。無(wú)論是通過(guò)環(huán)境暴露還是直接接觸,氧化石墨烯納米粒子的暴露都對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。本研究擬采用具有神經(jīng)細(xì)胞特性,又可穩(wěn)定傳代的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞與納米氧化石墨烯納米共孵育,觀察其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖及凋亡的影響。研究氧化石墨烯納米粒子對(duì)人神經(jīng)系統(tǒng)的影響,為納米氧化石墨烯的神經(jīng)生物領(lǐng)域安全應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SH-SY5Y細(xì)胞(南昌大學(xué)眼科實(shí)驗(yàn)室);胎牛血清(S711-001S,GIBCO公司);DMEM培養(yǎng)液(C11995500BT,GIBCO公司);PBS緩沖液,0.25%胰蛋白酶(GIBCO公司);氧化石墨烯(XF020,江蘇先豐納米材料科技有限公司);CCK-8試劑(CK04,日本同仁化學(xué)研究所);Bcl-2抗體(ab32124,英國(guó)Abcam公司)Bax抗體(ab32503,英國(guó)Abcam公司);超凈工作臺(tái)(上海蘇凈實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司);多功能酶標(biāo)儀(Infinite F500,,瑞士TECAN);Zeta電位儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(IX73,日本OlYMPUS);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法與步驟

為研究納米粒徑的氧化石墨烯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞增殖及凋亡的影響。首先制備納米級(jí)氧化石墨烯并測(cè)定其表征;然后采用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞,加入不同濃度已制備的氧化石墨烯(40,80,120,160,200,240,280,320,360 μg/ml)分別處理24 h和48 h,不加氧化石墨烯(0 μg/ml)設(shè)為正常對(duì)照組。采用CCK8試劑盒檢測(cè)了各組濃度的GO對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響。為探究GO抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖的作用機(jī)制,分別運(yùn)用Western blot法檢測(cè)線粒體凋亡關(guān)鍵蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá);RT-PCR法檢測(cè)凋亡基因caspase-3,Bcl-2和Bax的水平。具體方法如下。

1.2.1 氧化石墨烯納米材料的制備 使用超聲破碎儀對(duì)購(gòu)買(mǎi)的氧化石墨烯進(jìn)行超聲,將GO的粒徑控制在300 nm以?xún)?nèi)。采用含血清的DMEM稀釋成不同濃度40,80,120,160,200,240,280,320,360 μg/ml用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 氧化石墨烯納米材料的表征測(cè)定 粒徑和Zeta電位測(cè)定:取適當(dāng)濃度納米級(jí)氧化石墨烯,加入比色皿和Zeta電位樣品池中進(jìn)行粒徑和電位檢測(cè),重復(fù)3次。電鏡觀察:取適當(dāng)濃度的GO滴一滴在銅網(wǎng)上,待其晾干后用透射電鏡(TEM)觀察。

1.2.3 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出細(xì)胞,用1 ml無(wú)菌槍頭吸出細(xì)胞懸液加入到15 ml離心管內(nèi),加入2 ml DMEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、1% 100 U/ml的青霉素和鏈霉素混合液),1 000 r/min離心5 min,棄去上清液。在細(xì)胞沉淀中加入DMEM培養(yǎng)液,吹勻后接種于25 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)液,細(xì)胞生長(zhǎng)至80%-90%時(shí)消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的的細(xì)胞進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 CCK8法進(jìn)行細(xì)胞毒性分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以4×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h,按照GO終濃度不同進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組:0 μg/ml(即正常對(duì)照組)以及40,80,120,160,200,240,280,320,360 μg/ml,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48 h后棄去培養(yǎng)基,在每孔加入配置好的100 μl WST-8檢測(cè)試劑,37 ℃孵育2 h后置于連續(xù)光柵型酶標(biāo)儀,讀取450 nm波長(zhǎng)處吸光度值,然后計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組)×100%。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以8×104/孔接種于6孔培養(yǎng)板,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度GO(0,40,120,200,280,360 μg/ml)的培養(yǎng)液,再繼續(xù)培養(yǎng)24,48 h,分別置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.6 Western blot法檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞以2×105/孔接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h,按照1.2.5的給藥濃度加入GO,分別繼續(xù)培養(yǎng)24,48 h后,收集細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞總蛋白,并采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量;經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離,冰浴轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,用1 ∶1 000稀釋的Bcl-2、Bax一抗4 ℃孵育過(guò)夜,次日,采用對(duì)應(yīng)1 ∶5 000濃度的二抗室溫孵育1 h,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光顯影,通過(guò)凝膠成像儀采集圖片,蛋白表達(dá)水平采用Image-J進(jìn)行定量分析。

1.2.7 RT-PCR法檢測(cè)凋亡基因caspase-3、Bcl-2和Bax的水平 采用Trizol法提取各組細(xì)胞RNA,測(cè)定RNA濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件:42 ℃,15 min,95 ℃,3 min,4 ℃結(jié)束。后續(xù)RT-PCR反應(yīng)在95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸30 s,40個(gè)循環(huán)條件下執(zhí)行。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 GO的粒徑及形貌

采用TEM對(duì)GO的形貌進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示:GO呈不規(guī)則片狀分布,分散性良好,未發(fā)現(xiàn)明顯聚集情況(見(jiàn)圖1)。Zeta電位粒徑儀結(jié)果顯示GO的Zeta電位為(2.75±0.72)mV,平均有效粒徑為(232.66±0.74)nm,多分散性指數(shù)(PDI)為0.018±0.006(見(jiàn)圖2),表明粒徑分布范圍較窄,保證了本研究中GO的粒徑均一性。

圖2 氧化石墨烯粒徑分布圖Figure 2 The distribution of graphene oxide particle size

2.2 GO對(duì)細(xì)胞存活率的影響

CCK8結(jié)果顯示,不同濃度的納米GO懸液作用24,48 h,各組細(xì)胞的存活率受到不同程度的影響。細(xì)胞與GO懸液共孵育24 h,當(dāng)GO濃度為40,80 μg/ml時(shí),細(xì)胞相對(duì)活力(109.5%±21.5%,110.6%±18.5%)較正常對(duì)照組有增強(qiáng)趨勢(shì),并存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01,見(jiàn)圖3),說(shuō)明較低濃度的納米GO有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用;當(dāng)GO濃度高于200 μg/ml時(shí),細(xì)胞相對(duì)活力(82.5%±15.0%)與正常組比較降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見(jiàn)圖3),說(shuō)明高濃度(>200 μg/ml)納米GO抑制細(xì)胞增殖,且從統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖中看出GO呈濃度依賴(lài)性抑制細(xì)胞活力。納米GO作用48 h后,在160 μg/ml時(shí)可明顯抑制細(xì)胞增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見(jiàn)圖3)。

2.3 GO對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度納米GO懸液作用于SH-SY5Y細(xì)胞24 h,40 μg劑量組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量與正常組無(wú)明顯區(qū)別;120 μg/ml劑量組多數(shù)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化,細(xì)胞密度稍有減少,生長(zhǎng)略受抑制;200,280,360 μg/ml組的SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,可見(jiàn)細(xì)胞變圓,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞間隙增大,且隨著GO濃度增大,效果愈漸明顯(見(jiàn)圖4)。共孵育48 h,隨著納米GO濃度的增加,SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)越受抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞邊緣逐漸模糊不規(guī)則,間隙增加及數(shù)量減少(見(jiàn)圖4)。

A.GO與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育24 h后細(xì)胞存活率變化 B.GO與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育48 h細(xì)胞存活率變化與0 μg/ml相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖3 不同濃度GO共孵育不同時(shí)間后對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率影響Figure 3 The cell viability of SH-SY5Y cells coincubated with different concentrations of GO for 24 h and 48 h

2.4 Western blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,隨著GO的濃度增加,細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白上調(diào),Bcl-2蛋白下調(diào)(見(jiàn)圖5)。共孵育24 hBcl-2/Bax值分別為1.85±0.11,1.78±0.08,0.96±0.07,0.87±0.02,0.53±0.03,0.29±0.04;孵育48 h分別為1.24±0.09,0.98±0.11,0.68±0.07,0.52±0.04,0.18±0.02,0.07±0.01。120 μg/ml組Bcl-2/Bax值與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見(jiàn)圖5),表明大于120 μg/ml的GO與細(xì)胞共孵育后會(huì)使SH-SY5Y細(xì)胞凋亡水平顯著增加。

2.5 RT-PCR檢測(cè)caspase-3,Bax和Bcl-2基因表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示,共孵育24 h后GO各濃度組(40,120,200,280,360 μg/ml)和正常對(duì)照組中caspase-3的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.13,1.21±0.11,2.06±0.30,2.43±0.30,3.13±0.31;同樣實(shí)驗(yàn)分組共孵育48 h caspase-3的相對(duì)表達(dá)量分別為0.94±0.13,1.69±0.26,2.52±0.42,3.19±0.54,3.29±0.58。不同干預(yù)時(shí)間中caspase-3的相對(duì)表達(dá)量均在120 μg/ml時(shí)與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);360 μg/ml組的表達(dá)量均約為正常組的3倍。Bax與Bcl-2基因相對(duì)表達(dá)量基本與Western blot結(jié)果一致,24 h和48 h共孵育后均Bax基因下調(diào),Bcl-2基因上調(diào),200 μg/ml組與同時(shí)間的正常組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Bcl-2/Bax比值也呈下降趨勢(shì),分別于24 h時(shí)200 μg/ml,48 h時(shí)120 μg/ml差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖6)。

A.GO與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育24 h B.GO與SH-SY5Y細(xì)胞共孵育48 h與0 μg/ml相比,aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001圖6 GO與SH-SY5Y細(xì)胞共孵不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響Figure 6 The effect of GO and SH-SY5Y cells incubated for different times on apoptosis-related genes

3 討論

氧化石墨烯作為一種新型的納米材料,由于其優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì),引起了人們的極大關(guān)注。近年來(lái),氧化石墨烯作為新型給藥載體靶向治療癌癥研究頗多,研究者將已修飾或功能化氧化石墨烯負(fù)載藥物發(fā)揮抗癌療效[14-16]。氧化石墨烯逐漸在生物科研領(lǐng)域應(yīng)用的同時(shí),隨之而來(lái)的就是生物安全性的問(wèn)題。已有研究報(bào)道GO對(duì)人纖維細(xì)胞有劑量依賴(lài)性毒性[17];經(jīng)鼻吸入可沉積在肺部引起急性肺損傷及肺水腫[18]。本文通過(guò)GO納米粒子與人神經(jīng)細(xì)胞共孵育發(fā)現(xiàn)其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞也呈劑量依賴(lài)性毒性。

細(xì)胞凋亡又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡,是機(jī)體內(nèi)為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),細(xì)胞自主發(fā)生的死亡[19]。線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心,在受到刺激后,會(huì)釋放出一系列凋亡相關(guān)蛋白,主要包括caspase、抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax。caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白,是凋亡過(guò)程中的執(zhí)行因子,降解各種細(xì)胞底物,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。在凋亡信號(hào)刺激下,Bax構(gòu)象發(fā)生變化,允許更多凋亡因子從線粒體釋放,Bcl-2低表達(dá)能夠增加線粒體膜通透性,總體來(lái)講,Bax的激活和Bcl-2的抗凋亡是線粒體途徑的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[21]。本研究中,通過(guò)Western blot和RT-PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)氧化石墨烯濃度大于120 μg/ml時(shí),Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)的比值較正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相應(yīng)的也上調(diào)了caspase-3的基因。提示氧化石墨烯納米粒子穿過(guò)血腦屏障或者是通過(guò)嗅球-大腦轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入到腦組織中,累積過(guò)量時(shí),會(huì)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng),打破大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),加重神經(jīng)中樞系統(tǒng)負(fù)擔(dān)的同時(shí),還可能誘導(dǎo)加速帕金森、阿爾茨海默等中樞神經(jīng)退行性疾病發(fā)生與發(fā)展。所以本研究建議在研究應(yīng)用氧化石墨烯的診斷或治療疾病效應(yīng)的同時(shí),也應(yīng)關(guān)注其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)潛在毒性。

綜上所述,氧化石墨烯納米粒子穩(wěn)定性良好,低濃度時(shí)無(wú)神經(jīng)細(xì)胞毒性甚至表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖現(xiàn)象,但當(dāng)濃度達(dá)到120 μg/ml時(shí)開(kāi)始抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡,其機(jī)制可能與激活線粒體的Bax和caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān),具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為氧化石墨烯納米粒載藥應(yīng)用提供安全濃度范圍,在不損傷腦神經(jīng)細(xì)胞的同時(shí)更好地發(fā)揮治療效果。