周 斌,余艷麗,邱 珍,孟慶濤,夏中元(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060;通信作者,E-mail:xia-zhongyuan2005@aliyun.com)

循證醫(yī)學(xué)研究表明,糖尿病患者更易發(fā)生急性心肌梗死,即便恢復(fù)冠脈血流,其發(fā)生缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)的程度更重,預(yù)后更差,死亡率更高[1]。缺血后處理(ischemia post-conditioning,IPO)被證實(shí)為抵抗心肌IRI行之有效的方案[2-4],然而,既往研究顯示糖尿病患者心肌對(duì)IPO的保護(hù)作用失敏感[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者心肌中DJ-1蛋白表達(dá)顯著下降[5],進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬水平下降[6],這可能是糖尿病患者心肌IRI易損性增加且對(duì)IPO保護(hù)作用失敏感的重要原因,但其具體調(diào)控機(jī)制尚未闡明。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路在自噬的調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用[7],此外,亦有研究表明DJ-1對(duì)AMPK具有調(diào)控作用[8]。因此,我們推測(cè),DJ-1可能通過調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)自噬活性。本實(shí)驗(yàn)以糖尿病大鼠為研究對(duì)象,通過建立急性心肌IRI模型,探討過表達(dá)DJ-1是否能恢復(fù)糖尿病心肌對(duì)IPO的敏感性,并試圖闡明AMPK/mTOR信號(hào)及其下游自噬在此過程中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

鏈脲佐菌素、戊巴比妥鈉、伊文思藍(lán)和氯化苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC),AMPK抑制劑復(fù)合物C均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所,AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ(LC3Ⅱ/Ⅰ)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購(gòu)于美國(guó)CST公司,熒光二抗購(gòu)于美國(guó)Millpore公司。ALCV9型動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)于上海奧爾科特公司,Odyssey紅外掃描顯影儀購(gòu)于美國(guó)Li-Cor公司。

1.2 糖尿病模型制備

8周齡雄性SD大鼠,體質(zhì)量210-250 g,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京):2016-2019,批號(hào):43004700023411。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,禁食12 h,參照文獻(xiàn)[3]采用單次腹腔注射1%鏈脲佐菌素-檸檬酸鹽緩沖液(Sigma公司,美國(guó))60 mg/kg的方法制備1型糖尿病模型。造模72 h斷尾取血測(cè)定血糖,以空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L,并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦等癥狀為1型糖尿病模型制備成功。

1.3 動(dòng)物分組

取制備成功的糖尿病模型大鼠60只,隨機(jī)分為5組(n=12):缺血再灌注組(IR)、缺血后處理組(IPO)、心肌DJ-1過表達(dá)+缺血再灌注組(DIR)、心肌DJ-1過表達(dá)+缺血后處理組(DIPO),心肌DJ-1過表達(dá)+缺血后處理+AMPK通路抑制劑復(fù)合物C(DIPOC)。

1.4 重組腺相關(guān)病毒(rAAV)及復(fù)合物C的注射

DIR組和DIPO組糖尿病大鼠飼養(yǎng)5周時(shí),參照文獻(xiàn)[9]將攜帶DJ-1基因的心肌親和腺相關(guān)病毒9型(rAAV9-CMV-DJ-1,漢恒生物)按2×1012vg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射,3周后,腺相關(guān)病毒將達(dá)到表達(dá)高峰。DIPOC組大鼠于缺血前30 min尾靜脈注射AMPK抑制劑復(fù)合物C 5 mg/kg。

1.5 缺血再灌注及缺血后處理模型的建立

糖尿病大鼠病程8周。腹腔注射0.9%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后固定妥當(dāng)，置皮下電極監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。行氣管切開術(shù)，動(dòng)物呼吸機(jī)機(jī)械通氣。IR組和DIR組于左鎖骨中線處切開胸壁，分離冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)并穿線，穩(wěn)定10 min，采用結(jié)扎LAD 30 min，再松開120 min的方法建立心肌IR模型；IPO組和DIPO組于再灌注前行3個(gè)循環(huán)的再灌注10 s/缺血10 s。

1.6 血清CK-MB含量檢測(cè)

再灌注2 h時(shí)，心尖取血，4 ℃離心后取上清液，采用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清CK-MB的水平。

1.7 心肌梗死面積的檢測(cè)

每組隨機(jī)選擇6只大鼠，原位結(jié)扎LAD，經(jīng)股靜脈注射0.3%的伊文思藍(lán)將心肌藍(lán)染后，立即取心-20 ℃冷凍1 h，沿垂直于心臟長(zhǎng)軸的方向?qū)⑵淝袨? mm的薄片，置于1% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液中，37 ℃避光孵育20 min，中性甲醛固定20 min后掃描。采用Image-ProPlus 6.0軟件測(cè)定心梗面積，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)，磚紅色區(qū)域?yàn)槿毖ｋU(xiǎn)區(qū)，以梗死區(qū)/缺血危險(xiǎn)區(qū)面積的百分比表示心肌梗死范圍(%)。

1.8 心肌DJ-1蛋白含量、AMPK/m TOR信號(hào)通路活性及自噬水平的檢測(cè)

各組取6只大鼠心臟，進(jìn)行常規(guī)的蛋白抽提、定量和變性，行SDS-PAGE電泳，蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，于兔抗鼠DJ-1、p-AMPK、p-mTOR、LC3Ⅱ/Ⅰ和GAPDH抗體(稀釋度1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，于羊抗兔熒光二抗(稀釋度1 ∶15 000)室溫孵育1 h；使用Odyssey紅外掃描顯影儀掃描并分析測(cè)定灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比例表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心梗面積與血清CK-MB水平

與IR組比較,IPO組心梗面積[(52.57±5.00)%vs(50.38±6.14)%]和血清CK-MB水平[(1 683.02±258.12)U/Lvs(1 574.12±264.19)U/L]變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),而DIPO組心梗面積[(32.92±6.09)%]和CK-MB水平[(879.60±195.70)U/L]顯著下降(均P<0.05)。IR組與DIR組間比較,上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05,見圖1)。

與IR組比較,*P<0.05圖1 各組再灌注后心梗面積和血清CK-MB含量比較 (n=6)Figure 1 Comparison of myocardial infarct size and serum CK-MB release among five groups (n=6)

2.2 心肌DJ-1表達(dá),AMPK/mTOR信號(hào)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值

IR組與IPO組之間比較,心肌DJ-1(1.00±0.00vs1.08±0.19)、p-AMPK(1.00±0.00vs1.08±0.19)、p-mTOR水平(1.00±0.00vs0.96±0.14)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值(1.00±0.00vs0.98±0.17)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)DJ-1后,心肌DJ-1含量增加約3倍。與IR組比較,DIPO組心肌DJ-1(3.17±0.36),p-AMPK表達(dá)(2.19±0.37)及LC3Ⅱ/Ⅰ比值(1.26±0.20)顯著增加,p-mTOR(0.56±0.10)顯著下降(均P<0.05);IR組與DIR組比較,上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05,見圖2-5)。

與IR組比較,*P<0.05圖2 各組心肌DJ-1表達(dá)情況 (n=6)Figure 2 Comparison of DJ-1 in myocardium among all five groups (n=6)

與IR組比較,*P<0.05;與DIPO組比較,#P<0.05圖3 各組心肌p-AMPK表達(dá)情況 (n=6)Figure 3 Comparison of p-AMPK expression in myocardium among five groups (n=6)

與IR組比較,*P<0.05;與DIPO組比較,#P<0.05圖4 各組心肌p-mTOR表達(dá)情況 (n=6)Figure 4 Comparison of p-mTOR expression in myocardium among five groups (n=6)

3 討論

本研究參照文獻(xiàn)[10]的方法建立1型糖尿病大鼠模型和心肌缺血再灌注模型,結(jié)果顯示糖尿病大鼠血糖均高于16.7 mmol/L,且出現(xiàn)多食、多飲、多尿、體型消瘦等典型的糖尿病癥狀;大鼠心肌IRI后,其心梗面積和血清CK-MB水平顯著增加,提示急性心梗模型建立成功。既往研究證實(shí)IPO能有效減輕非糖尿病大鼠的心肌IRI[2,3],然而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示,糖尿病心肌對(duì)IPO的保護(hù)作用失敏感,這與前期的研究結(jié)果相一致[3]。

與IR組比較,*P<0.05;與DIPO組比較,#P<0.05圖5 各組心肌LC3Ⅱ/Ⅰ比值 (n=6)Figure 5 Comparison of LC3Ⅱ/Ⅰ ratio in myocardium among five groups (n=6)

DJ-1是一種高表達(dá)于心肌的多功能蛋白,對(duì)維持心臟的正常生理活動(dòng)具備重要意義[11]。前期研究證實(shí),糖尿病心肌中DJ-1表達(dá)下調(diào),并抑制其下游PTEN/PI3K/eNOS通路,這可能是糖尿病心肌氧化應(yīng)激加重、IRI易損性增加且對(duì)IPO失敏感的重要原因[2],但具體調(diào)控機(jī)制仍未明確。此外,一項(xiàng)在H9c2細(xì)胞株上的研究發(fā)現(xiàn),在高糖環(huán)境下,H9c2細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷顯著增加,且對(duì)缺氧后處理的保護(hù)作用失敏感,進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn),這與H9c2細(xì)胞中DJ-1低表達(dá),繼而細(xì)胞自噬抑制密切相關(guān);而過表達(dá)DJ-1能顯著提高細(xì)胞自噬,恢復(fù)缺氧后處理對(duì)H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用。然而此過程中,DJ-1是通過何種機(jī)制調(diào)控自噬的尚未明確。

AMPK是一種高度保守的蛋白激酶,在調(diào)控機(jī)體能量代謝和對(duì)抗有害刺激等方面扮演了十分重要的角色[12]。研究證實(shí)AMPK調(diào)控的mTOR通路在自噬的調(diào)控中發(fā)揮了十分重要的作用。Guo等[13]的研究證實(shí)糖尿病心肌AMPK磷酸化水平顯著下調(diào),心肌自噬水平降低,這可能是糖尿病心肌病的重要機(jī)制。此外,亦有研究證實(shí)AMPK/mTOR調(diào)控的自噬在心肌缺血再灌注方面具有重要意義[14],值得關(guān)注的是,DJ-1被證實(shí)為AMPK的上游調(diào)控因子,尤其是在缺氧環(huán)境下[15]。在體敲除DJ-1后,AMPK/mTOR通路失活,其下游的自噬水平降低,從而加重高糖刺激引起的細(xì)胞凋亡和損傷[8]?；诖?我們推測(cè),在糖尿病心肌中,DJ-1低表達(dá)降低AMPK/mTOR通路活性,繼而抑制細(xì)胞自噬是糖尿病心肌對(duì)IPO的保護(hù)作用失敏感的重要原因。

在本研究中,我們利用基因干預(yù)技術(shù),通過對(duì)糖尿病大鼠注射攜帶DJ-1基因的AAV9,實(shí)現(xiàn)糖尿病心肌DJ-1蛋白的過表達(dá)。AAV9介導(dǎo)的基因干預(yù)在心肌病的防治方面取得了良好的研究結(jié)果,具備廣泛的研究前景[16]。AAV在注射后第3周達(dá)表達(dá)峰值,因本研究選取糖尿病病程8周的大鼠作為研究對(duì)象,故我們?cè)谔悄虿∧Ｐ驼T導(dǎo)成功后的第5周進(jìn)行AAV注射,待其病程至第8周時(shí),AAV表達(dá)已進(jìn)入表達(dá)高峰。我們前期研究證實(shí)，AAV注射組糖尿病大鼠心肌DJ-1蛋白表達(dá)為非注射組對(duì)照組的3倍，證實(shí)AAV9介導(dǎo)的DJ-1過表達(dá)成功,并且DJ-1過表達(dá)能有效恢復(fù)糖尿病心肌對(duì)IPO的敏感性,在此過程中,p-AMPK水平增加、p-mTOR水平下降,說明AMPK/mTOR通路顯著激活,且自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比例明顯上調(diào),說明自噬水平增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),復(fù)合應(yīng)用AMPK抑制劑復(fù)合物C可顯著抑制AMPK/mTOR信號(hào)活性,抑制細(xì)胞自噬,逆轉(zhuǎn)DJ-1過表達(dá)聯(lián)合IPO對(duì)糖尿病IRI心肌的保護(hù)作用,這強(qiáng)烈提示,心肌過表達(dá)DJ-1通過激活A(yù)MPK/mTOR通路上調(diào)細(xì)胞自噬水平,從而恢復(fù)糖尿病心肌對(duì)IPO的敏感性。

綜上所述,糖尿病狀態(tài)下,DJ-1下調(diào)導(dǎo)致的自噬抑制是糖尿病心肌對(duì)IPO失敏感的重要原因,心肌過表達(dá)DJ-1可恢復(fù)其對(duì)IPO的敏感性,其機(jī)制可能與激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路,進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞自噬水平有關(guān)。