余 萬,葛玉元,張 勇(南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)外科,南京 210028;通信作者,E-mail:kayaxi@qq.com)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是指頭部突然受到外界暴力而引起的腦部結(jié)構(gòu)破壞或功能紊亂,常由車禍、墜落、礦難等因素所致[1]。TBI由于其高致死率和重殘率,對公眾健康造成了嚴重威脅。

中醫(yī)學認為“血瘀”為腦損傷的基本病機,在《素問·調(diào)經(jīng)論篇》“病在脈、調(diào)之血,病在血、調(diào)之絡(luò)”理論指導(dǎo)下,運用絡(luò)病理論探討TBI損傷機制將顯得尤為重要。

川芎嗪是從川芎根基中提取分離的生物堿單體,可通過抑制血小板凝聚聚集而降低血液黏度,還具有改善微循環(huán)和血管擴張、抗炎和清除自由基等作用,從而發(fā)揮其腦組織保護作用[2-4]?，F(xiàn)階段,對于治療TBI藥物的機制研究,主要著眼點集中于氣、血、水某一方面,而結(jié)合中醫(yī)絡(luò)病學氣血水同治理論,開展治療TBI藥物作用機制的研究較為少見。針對川芎嗪活血化瘀的特點,本研究基于中醫(yī)絡(luò)病學氣血水同治理論,以磺酰脲受體1(SUR1)基因為研究著眼點,探討川芎嗪治療TBI的作用機制,為臨床開發(fā)安全有效的TBI治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

注射用鹽酸川芎嗪(平光制藥股份有限公司,中國);白介素-1β(IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海紀寧實業(yè)有限公司(中國);抗體SUR1、M4型瞬時受體電位通道(TRPM4)、水通道蛋白4(AQP4)、絲裂原激活的蛋白激酶p38(p38 MAPK)和磷酸化p38(p-p38)購自Abcam公司(英國);HRP標記的GAPDH抗體和HRP標記的二抗分別購自數(shù)譜(上海)生物科技有限公司(中國)和Santa Cruz公司(美國);SPF級ICR雄性小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,體質(zhì)量18-22 g。

1.2 方法

1.2.1 TBI小鼠模型制作、分組和給藥 SPF級ICR雄性小鼠60只,隨機分為假手術(shù)組、模型組和川芎嗪低(15 mg/kg)、中(30 mg/kg)、高(60 mg/kg)劑量組,每組12只。

采用水合氯醛(5 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,按文獻[5]方法采用Feeney自由落體撞擊法制作TBI小鼠模型(開顱窗后給予顱腦撞擊)。假手術(shù)組開顱窗后不給予顱腦撞擊。手術(shù)過程中采用小動物監(jiān)護儀檢測小鼠生命體征,使用加熱板將小鼠體溫維持在37 ℃,頭皮縫合后,將動物放回動物房。剔除死亡和未造模成功的小鼠后,將TBI小鼠隨機分成模型組和川芎嗪低(15 mg/kg)、中(30 mg/kg)、高(60 mg/kg)劑量組,每組10只,另外取10只小鼠作為假手術(shù)組(開顱窗后不給予顱腦撞擊)。損傷2 h后給藥組小鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的川芎嗪,每天1次,而假手術(shù)組和模型組小鼠給予等量生理鹽水,連續(xù)給藥7 d。分別對小鼠進行神經(jīng)功能缺損評分、腦組織含水量、炎癥因子和相關(guān)蛋白表達水平進行測定。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評分 按文獻[6]方法采用改良神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)對小鼠進行運動感受及反射功能檢查,最高分為18分,分值越高代表損傷越嚴重,于建模損傷后1,3,7 d進行評分。

1.2.3 腦組織含水量測定 采用干濕重法測腦組織含水量,腦含水量=(腦組織濕重-干重)/腦組織濕重×100%。

1.2.4 腦組織炎癥因子水平的測定 第7天進行mNSS評分后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,取出腦組織后按照試劑盒說明書測定IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.2.5 腦組織SUR1、TRPM4、AQP4、p38、p-p38蛋白表達水平的測定 取損傷周圍的腦組織,加入RIPA裂解液提取總蛋白,按照文獻[6]方法,采用Western blot方法測定腦組織SUR1、TRPM4、AQP4、p38、p-p38和GAPDH蛋白的含量,蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜,然后在5%脫脂奶粉中封閉2 h,分別加入一抗SUR1(1 ∶2 000)、TRPM4(1 ∶2 000)、AQP4(1 ∶2 000)、p38(1 ∶2 000)、p-p38(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜。PVDF膜經(jīng)0.5% TBS-T溶液洗膜后再與HRP標記的二抗(1 ∶5 000)進行反應(yīng)。洗膜后加入發(fā)光液后進行發(fā)光顯色并進行灰度值分析,計算目的蛋白與GAPDH的灰度比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對TBI小鼠mNSS的影響

與假手術(shù)組相比,第1,3,7天模型組小鼠mNSS顯著升高(P<0.001),表明TBI模型建立成功;與模型組相比,損傷后第1天川芎嗪中、高劑量組小鼠的mNSS均顯著降低(P<0.05),損傷后第3天,川芎嗪低、中、高劑量組小鼠的mNSS均顯著降低(P<0.05-0.01),而損傷后第7天,川芎嗪低、中、高劑量組小鼠的mNSS也均顯著降低(P<0.05-0.001),且各時間點中川芎嗪低、中、高劑量組mNSS逐漸降低,兩兩比較的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),具有劑量依賴性(見圖1)。

2.2 川芎嗪對TBI小鼠腦組織含水量的影響

與假手術(shù)組相比,模型組小鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.05),而與模型組相比,川芎嗪中、高劑量組小鼠腦組織含水量顯著降低(P<0.05,見圖2)。

與假手術(shù)組比較,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖1 不同時間點川芎嗪對TBI小鼠mNSS的影響Figure 1 Effect of tetramethylpyrazine on mNSS of TBI mice at different time points

與假手術(shù)組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖2 川芎嗪對TBI小鼠腦組織含水量的影響Figure 2 Effect of tetramethylpyrazine on brain water content in TBI mice

2.3 川芎嗪對TBI小鼠腦組織炎癥因子含量的影響

與假手術(shù)組相比,模型組腦組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著提高(P<0.01),而與模型組相比,川芎嗪中、高劑量組TBI小鼠炎癥因子的含量顯著降低(P<0.05-0.01),且川芎嗪中高劑量組炎癥因子逐漸降低,兩兩比較的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),具有劑量依賴性(見圖3)。

與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 川芎嗪對TBI小鼠腦組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響Figure 3 Effect of tetramethylpyrazine on the contents of IL-1 β, IL-6 and TNF-α in brain tissue of TBI mice

2.4 川芎嗪對TBI小鼠腦組織SUR1及其下游靶蛋白表達的影響

與正常組相比,模型組小鼠腦組織SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表達顯著上升(P<0.01),而川芎嗪中、高劑量可以顯著降低TBI小鼠腦組織SUR1及其下游靶蛋白-TRPM4、AQP4和p-p38的表達(P<0.05-0.01),且川芎嗪中高劑量組相關(guān)蛋白表達逐漸降低,兩兩比較的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),具有劑量依賴性(見圖4)。

與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 川芎嗪對TBI小鼠腦組織SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表達的影響Figure 4 Effect of tetramethylpyrazine on the expression of SUR1, TRPM4, AQP4 and p-p38 proteins in brain tissue of TBI mice

3 討論

現(xiàn)代研究證實,TBI后可引起腦微血管微循環(huán)障礙[7],改變了血液的密度和流動,而呈現(xiàn)血瘀的病理表現(xiàn)[8];同時,TBI早期就存在腦微血管內(nèi)皮細胞功能和結(jié)構(gòu)的改變[9],顱腦損傷時,受損區(qū)域VEGF表達增高[10],血管活性物質(zhì)作用在酪氨酸激酶VEGFR1和VEGFR的作用下[11],使得血管內(nèi)皮通透性提高,導(dǎo)致血管源性腦水腫的發(fā)生[12],造成“水積”,即血瘀兼“水積”象,這與中醫(yī)的“津血同源”“汗血同源”“精血同源”觀點不謀而合,而腦水腫是TBI后病情惡化和導(dǎo)致死亡的重要原因之一[13],有效控制和減輕TBI后腦水腫的發(fā)展對于提高TBI的救治水平有著舉足輕重的意義;而炎癥在TBI的病理過程中促進繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展,導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)功能的缺失,這與中醫(yī)的“氣”具有高度相關(guān)性[14]。因此,絡(luò)病是指以人體絡(luò)脈系統(tǒng)為基礎(chǔ)的網(wǎng)絡(luò)病變的概括,涉及人體多因素、多機制、多環(huán)節(jié)后導(dǎo)致人體多部位損傷而出現(xiàn)的病理或異常功能狀態(tài),而氣血水同治是治療腦絡(luò)損傷的基本法則。

SUR1是一種由ABCC8編碼的磺酰脲類受體和跨膜蛋白,在損傷的腦組織中表達升高[15],其基因的多態(tài)性對TBI引起的腦水腫的發(fā)生發(fā)展起到至關(guān)重要的作用[16]。在大鼠局灶性腦缺血模型中,發(fā)現(xiàn)SUR1和TRPM4形成SUR1-TRPM4通道,活性增強,引起了大鼠腦微血管微循環(huán)障礙,并呈現(xiàn)出“血瘀”的發(fā)現(xiàn),而加入SUR1抑制劑后,可顯著改善損傷的腦微血管微循環(huán)障礙[17],而近年來研究證實,保護微血管是防治心腦血管病的重要靶點[18]。AQPs是一組與水通透有關(guān)的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白,在腦組織中,AQP4參與腦內(nèi)水平衡的調(diào)節(jié),功能最重要,與外傷性腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)[19],而最新研究結(jié)果表明,在顱腦損傷引起的星形膠質(zhì)細胞腫脹和腦水腫中,AQP4與SUR1-TRPM4形成復(fù)合物,從而加速腦水腫的進程,如果抑制SUR1的表達,可以顯著改善星形膠質(zhì)細胞腫脹和腦水腫的發(fā)生發(fā)展[20]。在腦神經(jīng)系統(tǒng)體外研究中發(fā)現(xiàn),SUR1激活p38/MAPK通路,可以激活炎癥的釋放,從而影響腦神經(jīng)的修復(fù)和再生[21]。因此,SUR1基因可從氣、血、水三個方面影響顱腦損傷的發(fā)生發(fā)展,契合中醫(yī)絡(luò)病學氣血水同治理論,本研究中發(fā)現(xiàn)TBI小鼠腦組織SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表達顯著上升,提示其可能是治療TBI的重要核心靶點。

研究發(fā)現(xiàn),在TBI中,川芎嗪可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路,從而降低小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞炎癥因子的表達[22],同時川芎嗪注射液對顱腦損傷模型興奮性氨基酸谷氨酸、天門冬氨酸含量有降低作用,對腦損傷的治療具有一定的作用[23]。而在中風患者腦損傷中,川芎嗪作為活血化瘀藥可以促進損傷的腦神經(jīng)進行修復(fù),有助于腦功能的恢復(fù)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以顯著降低TBI小鼠的mNSS評分、腦組織含水量和腦組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,表明川芎嗪對TBI具有比較好的治療效果。同時研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以降低TBI小鼠腦組織SUR1、TRPM4、AQP4和p-p38蛋白表達水平,提示川芎嗪可能通過調(diào)控SUR1,從而調(diào)控其下游靶蛋白-TRPM4、AQP4和p38,進而從氣、血、水三個方面同時改善TBI。

現(xiàn)階段,對于治療TBI藥物的機制研究,主要著眼點集中于氣、血、水某一方面,而結(jié)合中醫(yī)絡(luò)病學氣血水同治理論,開展治療TBI藥物作用機制的研究較為少見。本研究以SUR1基因為研究著眼點,探討川芎嗪治療TBI的作用機制,為臨床開發(fā)安全有效的TBI治療藥物和中藥現(xiàn)代化奠定了理論基礎(chǔ)。