劉夢潔,王文娟,姜麗麗(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,西安 710061;通信作者,E-mail:lingyinnancy@163.com)

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在男性中位于第三,在女性中位于第二[1]。盡管近年來靶向治療在結(jié)腸癌中得到了長足的進(jìn)展,但手術(shù)結(jié)合術(shù)后輔助化療仍為結(jié)腸癌的主要治療方式。

順鉑是一種常見的化療藥物,用于多種腫瘤的治療[2,3],它也是除5-氟尿嘧啶外另一種治療結(jié)腸癌的常用化療藥物。順鉑具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可抑制腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制過程,并破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),有較強(qiáng)的廣譜抗癌作用。但是順鉑具有一定的毒副作用,對于身體虛弱者也會產(chǎn)生較大損傷,比如引發(fā)患者惡性嘔吐、腎功能衰竭、手足抽搐等不良反應(yīng)[4,5],制約了順鉑在臨床上的應(yīng)用[6]。因此,尋找增加腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性、降低順鉑對機(jī)體的毒性作用的方法十分重要。

目前關(guān)于化療藥物毒副作用的研究受到了廣大學(xué)者的關(guān)注,相應(yīng)地也提出了不少針對性的化療保護(hù)劑,比如谷胱甘肽、硫代硫酸鈉、右丙亞胺、氨磷汀等[2]。谷胱甘肽是一種天然的含疏基三肽,對于人體全身解毒和避免氧化劑損傷有著較強(qiáng)的作用,可以有效減輕順鉑導(dǎo)致的腎功能異常和神經(jīng)毒性[3]。硫代硫酸鈉主要解除患者局部使用大劑量順鉑時引發(fā)的毒副作用。右丙亞胺則主要針對化療藥阿霉素引起的心臟毒性進(jìn)行防護(hù),且不影響其抗腫瘤作用。氨磷汀又稱阿米福汀,是一種半胱氨酸衍生的廣譜細(xì)胞保護(hù)藥物。由于在腫瘤患者接受化療的過程中,正常組織細(xì)胞也會遭受到活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起的損傷,而氨磷汀幾乎可以選擇性保護(hù)所有正常組織免受放化療損害,特別是烷化劑、鉑類藥物帶來的不良反應(yīng)[7]。近期的研究顯示,氨磷汀在盆腔腫瘤患者的放療過程中發(fā)揮著保護(hù)腸道和膀胱黏膜的作用[8],可以提高食管癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[9]。但其對結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)揮的作用尚不明確。

因此,本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建,旨在探討氨磷汀對順鉑的增敏作用及腎臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)選用4周齡的雄性BALB/c裸鼠,共48只,均購買自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CMT93和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.3 主要試劑及儀器 恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Themo Fisher Scientific公司);超凈工作臺(美國Themo Fisher Scientific公司);多功能酶標(biāo)儀(德國BMG LABTECH公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(以色列Biological Industries公司);胰酶干粉(美國SIGMA公司);CCK-8試劑盒(美國Solarbio公司);肌酐試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司);尿素氮試劑盒(上海景源醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究所用的CMT93細(xì)胞和SW620細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),2-3 d傳代一次。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性 收集對數(shù)生長期的CMT93細(xì)胞和SW620細(xì)胞,以5 000個/孔的密度接種于96孔板中,待細(xì)胞貼壁后,用0,0.02,0.04,0.08,0.16 mg/L的順鉑分別與0,100,200,800 mg/L的氨磷汀聯(lián)合處理CMT93細(xì)胞和SW620細(xì)胞,于培養(yǎng)24 h時在每孔加入15 μl的CCK-8試劑,再放入培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h,取出96孔板,在450 nm波長處測定吸光度。通過Bliss法,結(jié)合各組細(xì)胞的OD值,計(jì)算氨磷汀與順鉑在體外的聯(lián)合指數(shù)。

1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的構(gòu)建及體內(nèi)驗(yàn)證 為了明確氨磷汀聯(lián)合順鉑在體內(nèi)的作用,本研究將48只裸鼠隨機(jī)分為兩組,分別構(gòu)建CMT93細(xì)胞皮下移植瘤模型和SW620細(xì)胞皮下移植瘤模型,每種模型24只;每種模型隨機(jī)分為4組,分別為對照組、順鉑組、氨磷汀組、氨磷汀+順鉑組,每組6只。收集對數(shù)生長期的CMT93細(xì)胞或SW620細(xì)胞1×106個,用100 μl無血清DMEM培養(yǎng)基混勻,注射于裸鼠右側(cè)臀部皮下。接種后第4天開始給予不同的處理:對照組腹腔注射250 μl的生理鹽水;順鉑組腹腔注射4 mg/kg順鉑;氨磷汀組腹腔注射200 mg/kg氨磷汀;聯(lián)合組腹腔注射200 mg/kg氨磷汀+4 mg/kg順鉑。四組均于第1,8,15,22天時分別進(jìn)行上述處理,于第28天脫頸法處死小鼠。從接種開始檢測移植瘤體積,繪制生長曲線,直至處理完畢處死小鼠,收集皮下移植瘤,稱取移植瘤和裸鼠的質(zhì)量;收集裸鼠腎臟并稱取質(zhì)量,計(jì)算腎臟指數(shù)(腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量/裸鼠質(zhì)量×100%);收集外周血,檢測血清中的肌酐及尿素氮。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究在SPSS22.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組數(shù)據(jù)差異性比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。將P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氨磷汀在體外協(xié)同增強(qiáng)順鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用

CCK-8檢測各組細(xì)胞活性,結(jié)果顯示:隨著順鉑和氨磷汀單藥濃度的增加,CMT93細(xì)胞和SW620細(xì)胞的活性逐漸降低,呈劑量依賴性;對于單藥處理組,兩藥聯(lián)合處理組CMT93細(xì)胞和SW620細(xì)胞的增殖抑制作用更加強(qiáng)烈(見圖1)。通過Bliss方法計(jì)算得到兩藥聯(lián)合指數(shù)分別為25.698(SW620細(xì)胞)和27.65(CMT93細(xì)胞),結(jié)果如圖2所示:順鉑聯(lián)合氨磷汀可以在體外協(xié)同抑制CMT93細(xì)胞和SW620細(xì)胞的增殖。

2.2 氨磷汀聯(lián)合順鉑有效地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長

繪制各組小鼠移植瘤生長曲線,結(jié)果顯示,順鉑組和聯(lián)合組移植瘤生長較對照組受到了顯著抑制;聯(lián)合組移植瘤生長顯著慢于順鉑組(見圖3,4)。順鉑組和聯(lián)合組移植瘤體積顯著小于對照組(P<0.001);聯(lián)合組移植瘤體積顯著小于順鉑組(P<0.01,見圖5);氨磷汀組移植瘤體積稍小于對照組,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。順鉑組和聯(lián)合組移植瘤質(zhì)量顯著小于對照組(P<0.001);聯(lián)合組移植瘤質(zhì)量顯著小于順鉑組(P<0.001,見圖6);氨磷汀組移植瘤質(zhì)量稍小于對照組,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A.SW620細(xì)胞皮下移植瘤大體標(biāo)本B.CMT93細(xì)胞皮下移植瘤大體標(biāo)本圖3 各組皮下移植瘤大體標(biāo)本Figure 3 The gross specimen of subcutaneou transplantation tumors in each group

與空白對照組相比,aP<0.01,bP<0.001;與順鉑組相比,cP<0.01,dP<0.001圖4 各組皮下移植瘤生長曲線Figure 4 The growth curve of subcutaneou transplantation tumors in each group

與空白對照組相比,***P<0.001;與順鉑組相比,##P<0.01圖5 各組皮下移植瘤體積Figure 5 The volume of subcutaneou transplantation tumors in each group

與空白對照組相比,***P<0.001;與順鉑組相比,###P<0.001圖6 各組皮下移植瘤質(zhì)量Figure 6 The weight of subcutaneou transplantation tumors in each group

2.3 氨磷汀減輕順鉑對裸鼠的腎損傷

采用腎臟指數(shù)和外周血尿素氮、肌酐水平評估氨磷汀對順鉑誘導(dǎo)小鼠腫瘤模型腎損傷的作用。結(jié)果顯示,順鉑組小鼠腎臟指數(shù)較對照組顯著增加(P<0.001);氨磷汀組小鼠腎臟指數(shù)與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;聯(lián)合組小鼠腎臟指數(shù)較順鉑組顯著下降(P<0.001,見表1)。順鉑組小鼠血肌酐和尿素氮的水平較對照組顯著上升(P<0.001);氨磷汀組小鼠血肌酐和尿素氮的水平較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;聯(lián)合組小鼠血肌酐和尿素氮的水平較順鉑組顯著下降(P<0.001,見表2)。

表1 氨磷汀對小鼠腎臟指數(shù)的影響

表2 氨磷汀對小鼠外周血肌酐及尿素氮的影響 (mmol/L)

3 討論

順鉑是臨床上常用的非特異性抗腫瘤化學(xué)藥物,使用的劑量越大,對腫瘤細(xì)胞的殺傷力越強(qiáng),但因此而產(chǎn)生的毒性也越大。當(dāng)順鉑進(jìn)行人體后會由于腎臟器官的存儲功能滯留造成腎毒性,所以常因發(fā)生急性腎損傷或腎衰竭而限制其臨床應(yīng)用。因此,如何在保證順鉑發(fā)揮正常療效的同時并減緩乃至防止其誘發(fā)腎毒性是當(dāng)前臨床非常關(guān)注的問題[10]。

本研究首先在體外實(shí)驗(yàn)中選擇了小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CMT93和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620,運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)評估了氨磷汀能否在細(xì)胞學(xué)水平上增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤效果,結(jié)果顯示氨磷汀與順鉑兩藥體外的聯(lián)合指數(shù)分別為25.689(SW620細(xì)胞)和27.650(CMT93細(xì)胞),提示兩藥協(xié)同抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。這說明,在達(dá)到同樣抑制率的前提下,氨磷汀的使用可以減少順鉑的用量。

接著,本研究通過腎功能指標(biāo)尿素氮、肌酐、腎臟指數(shù)來評估氨磷汀在順鉑對小鼠腫瘤模型腎損傷中的作用,結(jié)果顯示順鉑組的尿素氮、肌酐、腎臟指數(shù)顯著高于對照組(P<0.001),氨磷汀組尿素氮、肌酐、腎臟臟指數(shù)與對照組無顯著性差異(P>0.05),氨磷汀聯(lián)合順鉑組尿素氮、肌酐、腎臟指數(shù)顯著小于順鉑組(P<0.001),這表明氨磷汀單獨(dú)作用不會影響小鼠腫瘤模型腎臟功能,在與順鉑聯(lián)合用藥時可以有效改善順鉑引發(fā)的腎功能損傷,保護(hù)腎臟細(xì)胞的正常功能。

綜上所述,本研究從動物水平和細(xì)胞學(xué)水平上分析了氨磷汀在小鼠結(jié)腸癌化療中順鉑誘發(fā)腎損傷的保護(hù)作用及抗腫瘤效應(yīng)。但是本研究還存在一些不足之處,所選取的小鼠樣本量偏少,仍需要后續(xù)研究的驗(yàn)證。總而言之,化療保護(hù)劑氨磷汀能夠有效改善順鉑引發(fā)的腎功能損傷,提高正常細(xì)胞的存活率,并且能夠協(xié)同增強(qiáng)順鉑在結(jié)腸癌細(xì)胞中的抗腫瘤效果。