李曉霞,張彥坤,安曉穎,郝 蒙,朱桂云,宋會改,徐美麗(河北省胸科醫(yī)院病理科,石家莊 00000;河北省胸科醫(yī)院眼科;河北省胸科醫(yī)院分子生物實驗室;河北省胸科醫(yī)院影像科;河北省胸科醫(yī)院檢驗科;通信作者,E-mail:xxw98@6.com)

肺癌仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的最常見原因,因為肺癌的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率很高,治療策略缺乏重大進(jìn)展[1,2]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌病例總數(shù)的80%-85%,分為腺癌、大細(xì)胞癌和鱗癌[1,3]。雖然近幾十年來在早期發(fā)現(xiàn)、根治性手術(shù)切除和多種治療方面取得了很大進(jìn)展,但NSCLC的5年總生存率一般<15%[4,5]。因此,迫切需要了解非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制,以便更好地個體化治療。

LL-37是Cathelicidin蛋白N端的37個氨基酸,因其開始的氨基酸分別為L-L而得名。它是Cathelicidin家族中唯一存在于人體的抗菌肽。因此其在體內(nèi)的作用受到越來越多的重視。LL-37以無活性的前體形式貯存,主要貯存在中性粒細(xì)胞的胞漿顆粒內(nèi),在白細(xì)胞被激活時釋放出有活性的抗菌肽。其分子量小、熱穩(wěn)定、水溶性好,而且具有廣譜抗菌性。近來研究表明,其在抗感染、免疫調(diào)節(jié)、促血管生成、抑癌等方面均發(fā)揮生物學(xué)作用[6-8]。LL-37已被認(rèn)為是一種既能抑制先天炎癥又能抑制免疫的基本抑制劑。LL-37可抑制多種促炎因子的表達(dá),包括IL-6、IL-1α、IL-1β和TNF-α[9,10]。最近,有報道稱LL-37可以抑制大腸癌、腎癌、肝癌和結(jié)腸癌以及類似疾病的進(jìn)展。其機(jī)制有IL-6/STAT3信號通路抑制、pSmad3C/P21抑瘤信號、β-catenin抑制和CD57NK募集。然而,LL-37在非小細(xì)胞肺癌中是否也有抗腫瘤作用尚不清楚。本研究旨在探討LL-37在NSCLC中的表達(dá)及對A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移和凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本的收集

2018年7月至2019年9月共有40例經(jīng)組織學(xué)證實的非小細(xì)胞肺癌患者入選本研究。入選的所有患者在采集樣本前接受過任何抗癌治療。NSCLC組織學(xué)分型依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn),分期依據(jù)國際癌癥控制聯(lián)盟腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分類(TNM)(第7版)。選擇40名年齡和性別匹配的健康人作為健康對照。采集非小細(xì)胞肺癌患者和健康對照者的空腹外周靜脈血。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗嚴(yán)格按照生產(chǎn)廠家說明書檢測血漿LL-37的表達(dá);每例標(biāo)本包括一對配對的非小細(xì)胞肺癌組織和鄰近的正常肺組織(距腫瘤≥5 cm)。術(shù)后1 h內(nèi)取材。每份標(biāo)本中,一半立即在液氮中閃速冷凍,然后在-80 ℃冷凍,直到進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)提取,其余的用福爾馬林固定進(jìn)行免疫組化。河北省胸科醫(yī)院研究倫理委員會批準(zhǔn)了本研究,并征得所有參與者和健康對照的書面知情同意。

1.2 免疫組化法檢測NSCLC患者組織中LL-37的表達(dá)水平

分析由兩位獨立的病理學(xué)家以盲法進(jìn)行。用Leica DM IRB倒置研究顯微鏡在低倍視野(100倍)篩選組織切片,在高倍視野(400倍)篩選出5個最具代表性的視野。根據(jù)陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度定量LL-37密度。根據(jù)陽性細(xì)胞百分率對染色程度進(jìn)行評分:0分,<5%;1分,5%-25%;2分,25%-50%;3分,>50%。染色強(qiáng)度分為:0分,無染色;1分,弱染色(淺黃色);2分,中度染色(棕色);3分,強(qiáng)染色(黃褐色)。LL-37表達(dá)的最終評分以陽性百分率×染色強(qiáng)度評分計算,0-1分為陰性,+為2-3分,++為4-6分,+為7-9分。當(dāng)兩位病理學(xué)家之間存在差異時,使用平均得分。最終染色評分≥4分的腫瘤為LL-37高表達(dá)組。

1.3 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系保存在我院生物技術(shù)治療中心。A549細(xì)胞系在Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng):營養(yǎng)混合物F-12(DMEM/F-12)中添加1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清,在5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中保持在37 ℃。將LL-37加入A549細(xì)胞培養(yǎng)液中。

1.4 主要儀器和試劑

Leica DM IRB倒置研究顯微鏡(德國Leica Microsystems);10%胎牛血清(美國Life Technologies);LL-37(美國明尼阿波利斯R&D系統(tǒng)公司);A549人肺癌細(xì)胞系和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)均取自美國典型培養(yǎng)庫(美國ATCC細(xì)胞庫);DMEM(上海GIBCO公司);cDNA開放閱讀框(Origene Technologies,中國,北京);Transwell系統(tǒng)(美國康寧);Matrigel膠水(R&D系統(tǒng));1%結(jié)晶紫(中國北京,Solarbio生命科學(xué));裂解緩沖液(上海Beyotime Biotechnology);BCA分析試劑盒(Beyotime Biotechnology);聚偏氟乙烯膜(Solarbio Life Sciences);抗體(英國Abcam);G辣根過氧化物酶(Beyotime Biotechnology);電化學(xué)發(fā)光流體(Solarbio Life Sciences);Gel Dox XR系統(tǒng)(上?？逻_(dá));TRIzol試劑(中國大連塔卡拉);GeneAmp PCR系統(tǒng)9700(美國ABI);RT試劑盒(日本Takara);SYBRGreen PCR試劑盒(美國Invitrogen)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.6 劃痕愈合實驗檢測A549細(xì)胞的遷移

轉(zhuǎn)染48 h后,將PC細(xì)胞接種于6孔板中,每孔1×106個細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到95%左右時,用20 μl的微吸管尖端在6孔板上進(jìn)行垂直劃痕。剩余細(xì)胞經(jīng)D-Hanks液洗滌后,用無血清培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)。分別于劃痕后0 h和24 h取材,在相差顯微鏡下隨機(jī)選擇3個視野(×100),比較各組間細(xì)胞遷移的差異。

1.7 Transwell檢測A549細(xì)胞的侵襲

用Transwell系統(tǒng)測定A549細(xì)胞的侵襲能力。將Matrigel膠水稀釋并加入到Transwell上部腔室中。將細(xì)胞重新懸浮在無血清培養(yǎng)基中,然后在上部小室中進(jìn)行培養(yǎng)。完整的培養(yǎng)基覆蓋了底部的腔室。在37 ℃孵育24 h后,膜上的細(xì)胞被清除。將遷移到膜底部的橫穿細(xì)胞固定,用1%結(jié)晶紫染色3 min。在×200倍顯微鏡下計數(shù)穿過基質(zhì)層的細(xì)胞,取隨機(jī)視野的平均數(shù)。

1.8 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液裂解培養(yǎng)細(xì)胞的總蛋白。使用BCA分析試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離等量的蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上,然后與抗Caspase-3(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl2(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶2 000)的抗體反應(yīng)。然后用三緩沖液+吐溫20洗滌蛋白質(zhì),并與山羊抗兔免疫球蛋白G辣根過氧化物酶孵育30 min。使用電化學(xué)發(fā)光流體對條帶進(jìn)行可視化。照片由Gel Dox XR系統(tǒng)拍攝。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附法檢測LL-37在NSCLC患者血漿中的表達(dá)

用TRIzol試劑從A549細(xì)胞中提取總RNA。根據(jù)說明書和GeneAmp PCR系統(tǒng)9700使用RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。使用白金SYBRGreen PCR試劑盒(Invitrogen,Carlsad,CA,USA)進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增。使用7500快速實時PCR系統(tǒng)(美國加州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng))制備定量PCR(QPCR)。PCR產(chǎn)物經(jīng)熔融曲線分析驗證。用2-ΔΔCt法計算靶基因的相對信使核糖核酸水平。

1.10 統(tǒng)計方法

使用SPSS版本17.0(SPSS Inc.,伊利諾伊州芝加哥,美國)、GraphPad Prism軟件(加利福尼亞州La Jolla)、Adobe Photoshop CS4(加利福尼亞州圣何塞)和Image J軟件(NIH)執(zhí)行所有統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間的比較采用t檢驗進(jìn)行分析。多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌患者血漿和組織中LL-37表達(dá)降低及其與病情進(jìn)展的關(guān)系

數(shù)據(jù)顯示非小細(xì)胞肺癌患者血漿LL-37表達(dá)較健康對照組降低(P<0.05,見圖1A)。另外,采用免疫組化法檢測NSCLC組織中LL-37的表達(dá),結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,NSCLC組織中的LL-37的表達(dá)下調(diào)(見圖1B)。進(jìn)一步分析非小細(xì)胞肺癌患者血漿LL-37表達(dá)與臨床特征的關(guān)系,LL-37低表達(dá)與晚期TNM分期顯著相關(guān)(P=0.034,見表1)。

圖1 LL-37在非小細(xì)胞肺癌患者組織和血漿中的表達(dá)Figure 1 Expression of LL-37 in tissue and plasma of patients with non-small cell lung cancer

表1 非小細(xì)胞肺癌患者血漿LL-37表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.2 LL-37劑量依賴性地抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移

為證實LL-37在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的作用,檢測了不同濃度的LL-37對人NSCLC A549細(xì)胞的侵襲和遷移作用。LL-37對A549細(xì)胞的遷移具有劑量依賴性抑制作用(見圖2),500 ng/ml時抑制效率為(10±1)%,對照組為(50±5)%。LL-37對A549細(xì)胞侵襲的抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05,見圖3),500 ng/ml時抑制效率為(50±5)%,對照組為(100±10)%。

2.3 LL-37以劑量依賴方式促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡

Western blot檢測不同LL-37濃度下Bax、Bcl-2和caspase-3的表達(dá),結(jié)果顯示,LL-37對A549細(xì)胞的凋亡具有劑量依賴性促進(jìn)作用,隨著LL-37濃度的上調(diào),Bax和caspase-3的表達(dá)顯著上調(diào),而Bcl-2的水平顯著下調(diào)(P<0.01-0.001,見圖4)。

圖2 LL-37對非小細(xì)胞肺癌遷移的抑制作用 (×100)Figure 2 The inhibitory effect of LL-37 on A549 cell migration in non-small cell lung cancer (×100)

圖3 LL-37對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)侵襲的抑制作用 (×100)Figure 3 Inhibitory effect of LL-37 on A549 cell invasion in non-small cell lung cancer (×100)

與0 ng/ml比較,**P<0.01,***P<0.001圖4 不同濃度的LL-37對A549細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白水平的影響Figure 4 Effects of different concentrations of LL-37 on the level of apoptosis-related proteins in A549 cells

3 討論

LL-37已被確認(rèn)為先天炎癥和免疫反應(yīng)的天然抑制因子[11]。它在炎癥組織中高表達(dá),抑制過度的炎癥反應(yīng)。最近的研究表明,LL-37在小鼠纖維肉瘤、人肝癌和宮頸癌的腫瘤進(jìn)展中起到保護(hù)作用[12-14]。然而,目前還沒有關(guān)于LL-37是否影響NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的報道。本研究首先探討了LL-37蛋白在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)模式及其臨床意義。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)LL-37在非腫瘤組織中表達(dá),而在肺癌組織中表達(dá)下調(diào)。Zhao等[13]研究報道,LL-37在HCC中的表達(dá)水平與腫瘤大小呈顯著負(fù)相關(guān),提示LL-37可能在腫瘤微環(huán)境中抑制腫瘤生長。越來越多的證據(jù)表明,LL-37具有很強(qiáng)的抗炎和抗免疫作用。最近的研究表明,LL-37在多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起保護(hù)作用[15-18]。然而,關(guān)于血漿LL-37的表達(dá)是否影響非小細(xì)胞肺癌患者的臨床特征以及其對人NSCLC A549細(xì)胞的抗侵襲和抗轉(zhuǎn)移作用機(jī)制的研究很少。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比,非小細(xì)胞肺癌患者血漿LL-37的表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步分析表明,LL-37在NSCLC患者血漿內(nèi)的低表達(dá)與TNM分期有關(guān),提示LL-37可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)LL-37抑制A549細(xì)胞的侵襲和遷移,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,且呈劑量依賴性。然而,與我們的發(fā)現(xiàn)相反,有報道稱,宮頸癌細(xì)胞系過表達(dá)LL-37抑制細(xì)胞增殖和侵襲[14]。由于宮頸癌與人乳頭瘤病毒(HPV)感染和機(jī)體慢性炎癥有關(guān)[19,20],而慢性炎癥與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[21],提示LL-37在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。

綜上所述,我們確定LL-37在NSCLC患者血漿中下調(diào),并與腫瘤TNM分期呈負(fù)相關(guān)。LL-37能夠抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。之前的研究顯示,LL-37可能通過抑制IL-6的表達(dá),抑制NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移或部分抑制STAT3的活化,降低EMT的表達(dá)[22]。因此,LL-37不僅可以作為天然免疫和炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)抑制劑發(fā)揮作用,而且可以作為一種潛在的新的腫瘤抑制因子在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮作用。然而,LL-37在非小細(xì)胞肺癌中的機(jī)制需要進(jìn)一步實驗去探討。