李春杰， 王鑫鵬,2，黃銘慧,2，姜 野,2，王從麗

(1.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

0 引 言

昆蟲病原線蟲作為重要的昆蟲天敵因其無毒高效的特征越來越受關(guān)注，應(yīng)用的生防制劑主要包括異小桿屬(Heterorhabditis)和斯氏線蟲屬(Steinernema)兩個(gè)屬的線蟲[1]。具有廣寄主的昆蟲病原線蟲三齡幼蟲侵染寄主后，釋放線蟲體內(nèi)的共生細(xì)菌，在昆蟲體內(nèi)迅速繁殖，被該類線蟲侵染的昆蟲一般在24～48 h內(nèi)死亡[2-3]。昆蟲病原線蟲廣泛地存在于大自然中，樣品的采集和分類鑒定是有效利用其防治昆蟲的前提條件，因?yàn)椴煌N或品系的昆蟲病原線蟲對(duì)昆蟲的致病力有很大差異。目前已報(bào)道的有100多個(gè)昆蟲病原線蟲種和品系[4]，早期發(fā)表的分類鑒定工作多數(shù)局限于線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定[2,5-6]。但由于有些種的線蟲形態(tài)特征差異不大，很難從形態(tài)上進(jìn)行區(qū)分，因此很多種群未能鑒定到種。

分子鑒定作為輔助手段開始于20世紀(jì)90年代，基于核苷酸序列的分子技術(shù)不僅是線蟲鑒定的強(qiáng)有力工具，而且對(duì)于線蟲的遺傳進(jìn)化研究提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)[7-8]。最常見的是利用種內(nèi)保守和種間變異大的核糖體DNA(rDNA)靶標(biāo)序列進(jìn)行線蟲鑒定，rDNA區(qū)域是多拷貝序列，具有容易被擴(kuò)增的特點(diǎn)。利用rDNA的18S-28S內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)(ITS1-5.8S-ITS2)[9]以及28S D2-D3擴(kuò)展片段(D2A/D3B)[10]進(jìn)行線蟲種類的鑒定。分子鑒定方法速度快，簡(jiǎn)單方便，用量少，單條線蟲就可以用于鑒定。近些年關(guān)于昆蟲病原線蟲的分子生物學(xué)分析法已有報(bào)道[11-18]。我們?cè)陂L(zhǎng)期的研究過程中收集、分離和保存了一些昆蟲病原線蟲[19]，根據(jù)線蟲侵染寄主使大蠟螟死后體表顏色可以初步判斷線蟲是斯氏屬(昆蟲體表不變或變灰黑色)還是異小桿屬(昆蟲體表變紅或紅棕色)。從線蟲形態(tài)學(xué)可以看出有些種的昆蟲病原線蟲大小形態(tài)明顯不同，同一種內(nèi)不同地域的分離品系在形態(tài)學(xué)上一般沒有明顯差異，但對(duì)寄主的識(shí)別能力和毒性存在差異[11,20-22]，說明基因型可能有變異，但是缺少對(duì)這些線蟲的分子鑒定數(shù)據(jù)。因此快速鑒定昆蟲病原線蟲并進(jìn)一步驗(yàn)證這些多年保存的線蟲種或品系，本研究利用18S-28S rDNA的ITS和D2-D3遺傳區(qū)域?qū)Ρ緦?shí)驗(yàn)室收集和保存的昆蟲病原線蟲進(jìn)行了分子鑒定。

1 材料與方法

1.1 昆蟲病原線蟲的來源、分離和培養(yǎng)

供試?yán)ハx病原線蟲共13個(gè)種或品系(表1)，嗜菌異小桿線蟲(H.bacteriphora， Hb)5個(gè)品系：Hb-HBN(哈爾濱)、Hb-ZT(哈爾濱)、Hb-NT-82(內(nèi)蒙)、Hb-CD-11(河北)和Hb-NJ(美國(guó))，前2種是由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存， Hb-NT-82和Hb-CD-11由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳書龍研究員提供，Hb-NJ從美國(guó)引進(jìn)；斯氏屬線蟲包括小卷蛾斯氏線蟲(S.carpocapsae，Sc-All)、格氏斯氏線蟲(S.glaseri,Sg-NC)、海濱斯氏線蟲(S.litorale,Sl-HBN)及芫菁夜蛾斯氏線蟲(S.feltiae)4個(gè)品系(Sf-IGA，Sf-QTH，Sf-MRS，Sf-Gansu和Sf-SN)，其中Sf-IGA、Sf-QTH、Sf-MRS和Sl-HBN采集分別來自黑龍江哈爾濱市、七臺(tái)河市、帽兒山和哈爾濱市，Sf-Gansu由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)劉長(zhǎng)仲教授提供，Sc-All、Sg-NC和Sf-SN引自美國(guó)。參試線蟲在實(shí)驗(yàn)室的保存時(shí)間見表1。線蟲從采集的土壤樣品中用活體大蠟螟(Galleriamellonella)誘集法分離獲得[17]，再用活體大蠟螟純化培養(yǎng)，純化后的線蟲利用潛水層法儲(chǔ)藏在10 ℃冰箱中30 d內(nèi)備用。

1.2 線蟲DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

線蟲DNA提取和PCR擴(kuò)增按照李春杰等[23]的方法略有改動(dòng)。挑取每個(gè)儲(chǔ)存樣品的活體線蟲3～5條，放入帶有10 μl裂解液(同等體積混合的10x PCR 緩沖液和20 mg·ml-1蛋白酶K)的載玻片上。于顯微鏡下利用眼科手術(shù)刀將蟲體盡可能的切碎，然后將約8 μl的蟲體懸液轉(zhuǎn)移至PCR管中。隨后把PCR管放入-80 ℃冰箱冷凍處理30 min，取出樣品放入PCR儀中在65 ℃反應(yīng)90 min，樣品再95 ℃處理10 min，以使蛋白酶K失活，然后在室溫下12 000 rpm離心5 min，上清液作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)檢測(cè)線蟲的通用引物ITS和D2-D3對(duì)線蟲rDNA所在區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。ITS的引物序列[9]：18S-F 5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′；26S-R 5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′，28S-rDNA-D2D3的引物序列[10]：D2A-F 5′ -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′；D3B-R 5′-TCGGAAGGAACCAGCTACT A-3′。PCR反應(yīng)總體系是50 μl，包括8 μl DNA模板，5 μl 10x PCR 緩沖液，1 μl 10nM dNTPs，上游和下游引物各1 μl，加水至50 μl。PCR擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，預(yù)變性94 ℃ 4 min，每個(gè)循環(huán)變性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 50 s，40個(gè)循環(huán)后延伸72 ℃ 10 min。然后取5 μl PCR產(chǎn)物在1X TAE緩沖液，1%瓊脂糖凝膠上電泳驗(yàn)證，電壓85 V。擴(kuò)增產(chǎn)物大小根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)大小100 bp分子標(biāo)記驗(yàn)證后，剩余的PCR產(chǎn)物送到公司測(cè)序。

表1 線蟲樣品來源、序列長(zhǎng)度和堿基GC含量及線蟲序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 1 The sources of collected nematodes,the sequence length and GC content,and the comparison with NCBI databank

1.3 遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建

所測(cè)的序列利用BIOEDIT v7.2.5軟件進(jìn)行序列編輯，GC含量的計(jì)算方法是(G+C)/(A+T+C+G)*100。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)檢測(cè)線蟲序列，每個(gè)比對(duì)序列選取相似度列在前1-3位的同源序列，然后下載這些rDNA序列，和所測(cè)序列一起利用MEGA X軟件[24]中的ClustalW程序。首先對(duì)這些序列進(jìn)行多重比較，利用MEGA X進(jìn)行進(jìn)化樹分析[24]，用UPGMA方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[25]。從1000個(gè)重復(fù)中推斷出的bootstrap consensus tree被用來代表所分析的分類單元的進(jìn)化歷史[26]。進(jìn)化距離用Maximum Composite Likelihood method方法[27]計(jì)算，單位是每個(gè)位點(diǎn)的堿基代換數(shù)，分析消除所有包含缺口和缺失數(shù)據(jù)的位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列長(zhǎng)度和GC含量

對(duì)12個(gè)線蟲樣品28S rDAN的D2-D3區(qū)域測(cè)序和序列編輯，除了Sf-QTH (614 bp)例外，其它每個(gè)樣品的序列長(zhǎng)度在833 bp～858 bp內(nèi)(表1)，堿基GC含量是47.1%～52.7%；每個(gè)種之間的GC含量是穩(wěn)定的。對(duì)6個(gè)斯氏屬Steinernema的種和品系的ITS測(cè)序得到了412 bp～427 bp的長(zhǎng)度，S.carpocapsae的堿基GC含量是40.0%，S.glaseri的GC含量是49.2%，S.litorale和S.feltiae的GC含量非常接近，大約在43.2%左右(表1)。這些序列已被征訂到GenBank，每個(gè)線蟲樣品擴(kuò)增的rDNA序列在NCBI 基因庫(kù)中的登錄號(hào)為MT367338-MT367355，表1中已列出。

2.2 線蟲序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)

每個(gè)樣品的D2-D3區(qū)域序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果(表1)，其相似度達(dá)到99%～100%，表明這些分子鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果基本一致。ITS分子鑒定結(jié)果表明所測(cè)序列主要包括18S-ITS1-5.8S，所測(cè)S.litorale和S.feltiae的序列與基因庫(kù)中的相似度達(dá)到98%～100%，Sc-All和Sg-NC分別和所屬種的序列達(dá)到99%以上。表1中列出了與每個(gè)序列最為相近的前1～2個(gè)GenBank的登錄號(hào)，并列出了比對(duì)的長(zhǎng)度和相似度、堿基缺失和比對(duì)樣品的來源。這些比對(duì)的序列與所測(cè)線蟲一起進(jìn)行了進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2.3 基于D2-D3-rDNA和ITS-rDNA遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建和種內(nèi)序列的比較

利用MEGA X構(gòu)建D2-D3和ITS1遺傳進(jìn)化樹如圖1和圖2所示。D2-D3進(jìn)化樹很清晰地表明形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定的結(jié)果一致(圖1)，而且能夠顯示出這些線蟲種或品系間的差異，從Hb-CD-11、Hb-NT-82、Hb-HBN、Hb-ZT、Hb-NJ可以看出同種不同品系之間在遺傳上也存在距離的差異。序列比對(duì)結(jié)果表明，Hb-CD-11與Hb-HBN的相似度是99.3%，與Hb-NJ和Hb-ZT的相似度是99.6%，與Hb-NT-82的相似度是99.8%，共有5個(gè)堿基序列的差異(圖3)。其它同種不同分離地的品系有一定的距離，例如，Sf-MRS與其它S.feltiae(Sf-IGA，Sf-SN，Sf-NC，Sf-Gansu)相比距離不同，進(jìn)一步比對(duì)種內(nèi)D2-D3序列，結(jié)果顯示比對(duì)區(qū)間Sf-MRS與其它三個(gè)序列相似度達(dá)到99.7%～99.8%，僅有2個(gè)堿基不同(112C/T，390C/T)(圖3)。ITS1進(jìn)化樹明確地區(qū)分了Sg-NC和Sc-All，但對(duì)S.litorale和S.feltiae兩個(gè)種交叉在一起，難以區(qū)分(圖2)，Sl-HBN與Sf-Gansu和Sf-IGA的相似度分別達(dá)到99.8%和99.5%，而Sf-MRS與這三個(gè)序列相似度大約是98.1%，共有8個(gè)堿基序列與Sl-HBN、Sf-Gansu和Sf-IGA不同(圖3)。通過比對(duì)基因庫(kù)中報(bào)道的這兩個(gè)ITS序列發(fā)現(xiàn)，S.litorale和S.feltiae的18S-ITS1-5.8S序列同源性高達(dá)97.3～100%，而ITS2區(qū)域的同源性只有88%左右，因此ITS2區(qū)域能夠靈敏區(qū)分這兩個(gè)相近的種。

3 討 論

該研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室所收集和保存5～15年的昆蟲病原線蟲進(jìn)行了分子鑒定，結(jié)果表明線蟲28S rDNA的D2-D3擴(kuò)增片段能夠有效的區(qū)分不同種的線蟲，而且序列很清晰地區(qū)分Steinernemaspp.和Heterorhabditissp.兩個(gè)屬為不同的分類群(圖1)。ITS1 rDNA序列能夠有效的區(qū)分S.glaseri和S.carpocapsae，但是不能有效的區(qū)分S.litorale和S.feltiae，因?yàn)楸驹囼?yàn)得到的數(shù)據(jù)只是ITS1序列，長(zhǎng)度僅為412 bp～427 bp，包括18S-ITS1-5.8S，而不包括ITS2。根據(jù)GenBank中比對(duì)的同源序列發(fā)現(xiàn)，S.litoraleITS的序列長(zhǎng)度大約是1 000 bp(AB243441.1)，ITS1序列在S.litorale和S.feltiae中同源性很高，而ITS2的序列同源性只有88%左右，因此如果區(qū)分這兩個(gè)種，需要測(cè)序ITS2能夠區(qū)分這兩個(gè)相近種。本研究也發(fā)現(xiàn)了同種不同分離地的品系有一定的遺傳距離，距離不同是由于個(gè)別堿基序列不同而形成的。本研究利用了常見ITS和28S rDNA引物(D2-D3)，rDNA區(qū)域被利用分類的其它引物也有報(bào)道[28-32]，另外，線粒體基因編碼的細(xì)胞色素氧化酶I亞基(COI)也被用于線蟲鑒定[33]。

注:Hb代表Heterorhabditis bacteriphora;H.sp.代表Heterorhabditis sp.;Sf代表Steinernema feltiae;Sk代表S.kraussei,Sc代表S.carpocapsae;Sg代表S.glaseri。Note:Hb:Heterorhabditis bacteriphora;H.sp.:Heterorhabditis sp.;Sf:Steinernema feltiae;Sk:S.kraussei;Sc:S.carpocapsae;Sg:S.glaseri.圖1. 12種昆蟲病原線蟲28S rDNA的D2-D3區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of D2-D3 region of 28S rDNA among 12 entomopathogenic nematodes

昆蟲病原線蟲一些種類GC含量有明顯不同，例如，線蟲S.glaseri的28S rDNA D2-D3序列的GC含量無論是ITS還是D2-D3區(qū)域明顯高于其它斯氏屬線蟲，而S.carpocapsae的GC含量明顯低于其它斯氏屬線蟲。有趣的是，S.glaseri的體長(zhǎng)明顯大于其它Steinernemaspp.，S.carpocapsae的體長(zhǎng)明顯小于其它幾個(gè)斯氏線蟲，S.litorale和S.feltiae的體長(zhǎng)非常相近[34]，難以區(qū)分，而GC含量也非常接近，可以看出分子手段和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果有很好的一致性。形態(tài)學(xué)的鑒定非常重要，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，該研究表明分子方法可以初步快速確定未知線蟲的屬或種，結(jié)合形態(tài)學(xué)方法更準(zhǔn)確地鑒定到種和品系，也可以用分子方法快速驗(yàn)證已知線蟲的屬或種。另外，我們利用PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，沒有克隆ITS和D2-D3的完整序列，但這些數(shù)據(jù)足以準(zhǔn)確鑒定昆蟲病原線蟲到種，且根據(jù)序列堿基差異還能表明同種不同品系間存在DNA差異。而克隆這些基因從時(shí)間上要求更長(zhǎng)，技術(shù)和成本上都要求很高，因此利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序是非常經(jīng)濟(jì)有效的。

注：Hb代表Heterorhabditis bacteriphora;Sl代表Steinernema.Litorale;Sf代表S.feltiae;Sc代表S.carpocapsae;Sg代表S.glaseri。Note:Hb:Heterorhabditis bacteriphora;Sl:Steinernema.Litorale;Sf:S.feltiae;Sc:S.carpocapsae;Sg:S.glaseri.圖2 6種昆蟲病原線蟲18S-28S核糖體rDNA的ITS區(qū)域系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of ITS region of 18-28S rDNA among 6 entomopathogenic nematodes

注：序列左右兩端數(shù)字顯示兩端堿基在所測(cè)序列中的位置。Note：The numbers in the two ends of each sequence indicate the positions of the two bases in each sequence of the sample.圖3 H.bacteriophoris(Hb)、S.feltiae(Sf)和S.litorale(Sl)D2-D3和ITS rDNA區(qū)域變異序列比對(duì)Fig.3 The alignment of the sequence variation of D2-D3 and ITSrDNA region of Heterorhabditis bacteriophoris (Hb),Steinernema feltiae(Sf) and S.litorale (Sl)

目前，我們?cè)诤邶埥?nèi)分離到的線蟲多數(shù)是S.feltiae，檢出率明顯高于其它種，這個(gè)線蟲比較耐低溫，在俄羅斯、加拿大、芬蘭、瑞典、北愛爾蘭等多國(guó)寒冷地區(qū)均有分布[35]，該線蟲發(fā)生在我國(guó)東北，與前人報(bào)道的寒冷氣候比較相符。分離本地昆蟲病原線蟲資源，對(duì)于控制本地害蟲非常重要。對(duì)于分布在寒帶和溫帶的昆蟲病原線蟲，只有安全越冬，其種群才能得以存活和繁衍。由于本土線蟲群體對(duì)本土適應(yīng)性強(qiáng)，有利于線蟲在土壤中定居、種群建立以及發(fā)揮持效性，所以篩選本土昆蟲病原線蟲是提高其防治效果的最佳途徑。因此，線蟲S.feltiae將對(duì)低溫土壤害蟲的生物防治應(yīng)用提供很好的材料。因種內(nèi)不同分離地的品系形態(tài)上沒有差異，但對(duì)寄主和寄主棲境的識(shí)別能力有差異，對(duì)寄主的侵染能力也有差異[20-22]，本研究所檢測(cè)到種內(nèi)rDNA的序列差異與它們對(duì)寄主毒力的不同可能有一定關(guān)系，但相關(guān)性還需要進(jìn)一步研究，種內(nèi)堿基變異將為線蟲的進(jìn)化提供理論依據(jù)。