羅 梅，陳欣瑜,2，董章勇,2*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物健康創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225)

【研究意義】哈茨木霉(Trichodermaharzianum)是木霉菌的一種，屬半知菌類(Fungi imperfecti)，絲孢綱(Hyphomycetes)，叢梗孢目，叢梗孢科，是一種目前廣泛應(yīng)用的重要生防菌。該屬?gòu)V泛分布于全球，在土壤及有機(jī)質(zhì)上均可發(fā)現(xiàn)[1]。哈茨木霉報(bào)道能夠與長(zhǎng)孺孢屬(Helmisporiumspp.)、核盤菌屬(Sclerotiniaspp.)、輪枝孢屬(Verticilliumspp.)、黑星菌屬(Venturiaspp.)、蜜環(huán)菌屬(Armillariaspp.)、鐮刀菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(Pythiumspp.)、疫霉菌(Phytophthoraspp.)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、炭疽菌(Colletotrichumspp.)等多種植物病原菌競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-4]，且能分泌產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)，具有重寄生作用，并可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[5-7]。因此，其菌劑被廣泛應(yīng)用在植物病害的防治上[6-7]。以色列的哈茨木霉T39和美國(guó)T22 菌株等均已經(jīng)登記使用在多種植物病害的防治上?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】效應(yīng)子(effector)也稱效應(yīng)因子或效應(yīng)蛋白，廣義上是指能夠選擇性地結(jié)合其他目標(biāo)蛋白及調(diào)節(jié)其生物活性的一類小分子蛋白。隨著對(duì)效應(yīng)子的研究，有學(xué)者凝煉出其具體的分析指標(biāo)：①含有N-端信號(hào)肽；②無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域；③定位于細(xì)胞質(zhì)；④序列具有特異性；⑤富含半胱氨酸；⑥重復(fù)元件多；⑦氨基酸殘基數(shù)量大約在50～300 氨基酸[8-9]。哈茨木霉菌株的基因組測(cè)序的完成為高通量篩選效應(yīng)子提供前提。許僖等[10]根據(jù)哈茨木霉T677菌株的基因組預(yù)測(cè)了其分泌蛋白，但并未進(jìn)行效應(yīng)子的分析?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究在已公布的哈茨木霉CBS 226.95菌株全基因組信息的基礎(chǔ)上，根據(jù)效應(yīng)子的典型特征，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其候選效應(yīng)子進(jìn)行了預(yù)測(cè)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究結(jié)果為哈茨木霉效應(yīng)子的進(jìn)一步篩選與驗(yàn)證提供了重要的理論依據(jù)，并為探究效應(yīng)子在生防菌與病原菌互作過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因組信息

哈茨木霉CBS 226.95菌株的蛋白序列從NCBI上下載，具體網(wǎng)址為：ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/003/025/095/GCF_003025095.1_Triha_v1.0/GCF_003025095.1_Triha_v1.0_protein.faa.gz。該基因組共包含了14 065個(gè)蛋白序列(INSDC: MBGI00000000.1)。

1.2 分泌組蛋白預(yù)測(cè)

將14 065個(gè)蛋白序列先經(jīng)過(guò)SignalP v4.1分析；隨后將有信號(hào)肽的蛋白進(jìn)一步用TMHMM v2.0進(jìn)行分析，選取跨膜結(jié)構(gòu)域小于2 的蛋白；進(jìn)一步用TargetP v1.1進(jìn)行分析，篩選定位在胞外的蛋白；然后用ProtComp v9.0進(jìn)行分析亞細(xì)胞定位。

1.3 分泌組蛋白序列分析

將1.2分析結(jié)果進(jìn)行序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 分泌組蛋白的半胱氨酸含量和multiple tandem repeats分析

將1.2分析結(jié)果的蛋白序列進(jìn)行半胱氨酸數(shù)量及multiple tandem repeats分析。半胱氨酸數(shù)量采用perl工具進(jìn)行計(jì)算。將具有高半胱氨酸的 (≥6) 的蛋白序列進(jìn)行multiple tandem repeats分析。multiple tandem repeats采用T-Reks (http://bioinfo.montp.cnrs.fr/?r= t-reks/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5 候選致病相關(guān)效應(yīng)因子的確定

一般的效應(yīng)子都是小分子蛋白，因此，將1.4獲得的蛋白序列去除大于300個(gè)氨基酸的蛋白序列，剩余的為候選效應(yīng)子。將獲得的蛋白序列和PHI數(shù)據(jù)庫(kù)(Pathogen-Host Interaction database，http://www.Phi-bas e.org/downloadLink.htm)進(jìn)行比對(duì)分析，分析其可能的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌組蛋白預(yù)測(cè)

將14 065個(gè)哈茨木霉蛋白序列用SignalP v4.1進(jìn)行分析，共獲得1288個(gè)蛋白具有信號(hào)肽；隨后進(jìn)一步用TMHMM v2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，跨膜結(jié)構(gòu)域小于2的共有1186個(gè)蛋白；將這1186個(gè)蛋白用TargetP v1.1進(jìn)行定位分析，共得到1138個(gè)蛋白在胞外表達(dá)；再進(jìn)一步用ProtComp v9.0進(jìn)行分析，得到709個(gè)蛋白。這709個(gè)蛋白為哈茨木霉CBS226.95菌株的分泌蛋白，占總蛋白的5.04 %。

2.2 分泌組蛋白序列分析

將709個(gè)蛋白氨基酸殘基序列特征進(jìn)行分析，獲得序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(perl程序)。小于200個(gè)氨基酸的有199個(gè)，占28 %；201～400個(gè)氨基酸的有275個(gè)序列，占39 %；401～600個(gè)氨基酸的有149個(gè)序列，占21 %；601～800個(gè)氨基酸的有57個(gè)序列，占8 %；801～1000個(gè)氨基酸的有23個(gè)序列，占3 %；大于1000個(gè)氨基酸殘基的有6個(gè)序列，占1 %；沒(méi)有大于2000個(gè)氨基酸殘基的序列(圖1)。

圖1 709個(gè)哈茨木霉分泌蛋白的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)分析Fig.1 Sequence length statistics of 709 Trichoderma harzianum secretome genes

2.3 分泌組蛋白的cysteine含量和multiple tandem repeats分析

將709個(gè)蛋白序列進(jìn)行cysteine含量及multiple tandem repeats分析。Cysteine含量采用perl工具進(jìn)行計(jì)算。得到396個(gè)具有高cysteine含量的 (≥6) 的蛋白。其中6個(gè)半胱氨酸的有93個(gè)序列，占23.5 %，其次為8個(gè)半胱氨酸，有72個(gè)序列，占18.2 %；再次為7、10個(gè)，分別為45和47個(gè)，占11.4 %和11.9 %；其中1個(gè)序列(XP_024772708.1)擁有98個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)(圖2)。

圖2 396個(gè)哈茨木霉分泌蛋白的半胱氨酸殘基數(shù)量分布Fig.2 Number of cysteine residues of the 396 Trichoderma harzianum secretome genes

將396個(gè)具有高cysteine含量的 (≥6) 的蛋白序列進(jìn)行multiple tandem repeats分析。multiple tandem repeats采用T-Reks (http://bioinfo.montp.cnrs.fr/?r=t-reks/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。得到86個(gè)蛋白具有multiple tandem repeats (≥9)。

2.4 候選致病相關(guān)效應(yīng)因子的確定

一般效應(yīng)因子都是小分子蛋白，因此，將上述獲得的86個(gè)基因序列進(jìn)行長(zhǎng)度篩選，去除大于300個(gè)氨基酸的蛋白序列。剩余24個(gè)基因序列，被認(rèn)為是候選致病相關(guān)效應(yīng)因子(表1)。其中有3個(gè)是碳水化合物結(jié)合模塊家族蛋白(carbohydrate-binding module family protein)，其余21個(gè)為假定蛋白。在PHI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示，其中9個(gè)蛋白可能跟真菌的毒力相關(guān)(reduced virulence)，3個(gè)為效應(yīng)子(effector)，2個(gè)蛋白是致死蛋白(lethal)，6個(gè)為非致病相關(guān)(Unaffected pathogenicity)，1個(gè)蛋白為功能未知，1個(gè)蛋白為混合型(可能為非致病相關(guān)或引起毒力減弱)。

表1 哈茨木霉候選效應(yīng)因子

續(xù)表1 Continued table 1

3 結(jié)論與討論

分泌的胞外蛋白除了作為效應(yīng)子參與侵染寄主過(guò)程外，還可以作為毒力因子或者毒素改變寄主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或者功能，或者作為無(wú)毒因子或者激發(fā)子引發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)[11-12]。本研究通過(guò)對(duì)哈茨木霉CBS 226.95菌株的14 065個(gè)蛋白進(jìn)行分析，共分析得到709個(gè)分泌蛋白，占總蛋白的5.04 %。而許僖等[10]根據(jù)哈茨木霉T677菌株基因組的11 498個(gè)蛋白中共分析得到分泌蛋白503個(gè)，占總蛋白的4.37 %。不同的植物真菌所含分泌蛋白占的比列不同，多數(shù)半活體營(yíng)養(yǎng)型和死體營(yíng)養(yǎng)型真菌編碼的分泌蛋白占總基因的比例高于活體營(yíng)養(yǎng)型真菌[13]。本研究分析到的分泌蛋白的比例比許僖等[10]分析的略高，可能2個(gè)菌株來(lái)源不一樣的差異引起的。

本研究基于哈茨木霉CBS 226.95菌株基因組共篩選獲得24個(gè)效應(yīng)子，其中有3個(gè)是碳水化合物結(jié)合模塊家族蛋白(carbohydrate-binding module family protein，CBM)，其余21個(gè)為假定蛋白。雖然通過(guò)PHI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其功能進(jìn)行了初步的注釋，但是相應(yīng)蛋白在哈茨木霉的具體功能還需要進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)。3個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊家族蛋白中有1個(gè)是CBM50 亞家族，2個(gè)是CBM1亞家族。CBM作為碳水化合物酶類的一大類，在真菌的作用機(jī)制上發(fā)揮了重要作用。其中CBM50亞家族屬于CBM的一個(gè)亞家族，通常結(jié)合糖基水解酶家族(glycoside hydrolases，GH)發(fā)揮降解幾丁質(zhì)或者肽聚糖的作用(http://www.cazy.org/CBM50.html)。柳少燕等[14]分析表明拮抗菌中的CBM50相比病原菌來(lái)說(shuō)可能發(fā)生了顯著的擴(kuò)增，且有部分拮抗菌中的CBM50蛋白單獨(dú)聚為一支。本研究所分析獲得的CBM50亞家族基因具有1個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域。LysM結(jié)構(gòu)域最早是在芽孢桿菌噬菌體溶菌酶中被發(fā)現(xiàn)其通過(guò)降解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的糖苷鍵來(lái)降解細(xì)胞壁[15]。LysM結(jié)構(gòu)域偏好出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的N端和C端，在中心位置出現(xiàn)較少[16]。本研究所分析的CBM50蛋白的LysM結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在C端。由于拮抗菌與病原菌的細(xì)胞組分相似，拮抗菌需要解決如何識(shí)別“自我”與“非我”并避免自身受到影響的關(guān)鍵問(wèn)題。LysM結(jié)構(gòu)域作為一類古老而又普遍存在的結(jié)構(gòu)域，對(duì)該類結(jié)構(gòu)域的研究有助于揭示拮抗真菌、病原真菌及植物防御之間的復(fù)雜聯(lián)系。Chen等[25]報(bào)道效應(yīng)子LysM幫助逃避昆蟲的免疫防御而致病昆蟲。

隨著基因組學(xué)以及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，大數(shù)據(jù)分析成為現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要研究手段之一[10, 17-19]。通過(guò)高通量的方法進(jìn)行效應(yīng)子的篩選，雖然可能不完全，但可以大大的縮小研究范圍，找到研究的切入口。而本研究篩選到的潛在的效應(yīng)子在哈茨木霉的拮抗作用以及在植物環(huán)境中的作用還需要進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究才能得以驗(yàn)證。