伏成秀，李銘剛，吳 翔，付 斌，張 慶，施竹鳳，倪 明，胡萬里，楊明英，朱紅業(yè)，楊佩文*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2. 云南大學(xué)，云南 昆明 650091；3. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】洱海北部地區(qū)農(nóng)田每年因淋溶而流入湖泊的氮磷是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的主要污染源[1]。尋求控源減排兼顧產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益的適宜水肥管理模式是提高土壤生產(chǎn)力，防治土壤氮磷素流失和保護(hù)水質(zhì)的重要研究內(nèi)容[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】相關(guān)研究指出，通過合理施肥，平衡農(nóng)田土壤養(yǎng)分，使輸入與輸出趨于平衡，減少養(yǎng)分累積與流失，是綜合治理農(nóng)業(yè)面源污染的主要技術(shù)措施[3]。國內(nèi)外很多室內(nèi)模擬試驗、田間長期定位試驗和區(qū)域調(diào)查監(jiān)測等碳氮耦合關(guān)系研究結(jié)果表明，合理施肥能夠保持或提高土壤碳氮含量，有機(jī)碳在一定程度上有利于氮積累，而氮輸入可減少有機(jī)碳礦化而促進(jìn)碳累積，二者間存在耦合關(guān)系[4]。雷寶坤等研究結(jié)果表明，土壤“碳匯”可以增強(qiáng)“氮匯”的功能，從而阻止土壤氮素的流失，實現(xiàn)碳素控制農(nóng)田氮素流失的面源污染[5]。張丹等在洱海流域水稻-油菜輪作農(nóng)田設(shè)置長期定位試驗，基于秸稈還田對土壤微生物熵和微生物量碳/氮變化動態(tài)的影響，初步探討了有機(jī)碳源物料輸入降低土壤氮素流失的影響機(jī)制，結(jié)果表明，有機(jī)碳源物料輸入增強(qiáng)了土壤微生物氮素固持能力而有效降低了土壤氮素流失的風(fēng)險，但系統(tǒng)深入的微生物過程有待進(jìn)一步研究[6]?！颈狙芯壳腥朦c】洱海流域地區(qū)是多元少數(shù)民族文化匯集地區(qū)，特殊的地形-氣候-水文特征及人類活動等的耦合，形成了該區(qū)域土壤富含有機(jī)質(zhì)，碳氮庫明顯高于其它地域土壤的特點，但目前對其碳氮共濟(jì)效應(yīng)關(guān)鍵的土壤微生物過程缺乏深入系統(tǒng)的研究，制約了對區(qū)域農(nóng)田優(yōu)化管理的準(zhǔn)確性和全面性[7]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于油菜-水稻輪作種植模式下有機(jī)碳源輸入定位試驗，運用微生物核糖體RNA基因靶向測序技術(shù)和qPCR技術(shù)，分析土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成、豐度以及碳氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度的差異，解析其變化特征；結(jié)合Perason相關(guān)性分析，解析細(xì)菌多樣性和種群結(jié)構(gòu)對有機(jī)碳源物料輸入的響應(yīng)特征。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況和試驗設(shè)計

持續(xù)開展陳安強(qiáng)等的定位試驗[8]，試驗田位于洱海流域洱源縣鳳羽鎮(zhèn)(99°57′E，25°58′N)，海拔2099 m，年平均氣溫13.90 ℃，年降水量745.00 mm，土壤類型為水稻土，典型的北亞熱帶高原季風(fēng)氣候，水稻-油菜水旱輪作種植模式，油菜種植時間為當(dāng)年的11月，收獲時間為次年5月，水稻種植時間為當(dāng)年6月，收獲時間為10月。本研究選取其中5個處理為研究對象，即處理1(CK)，不施用有機(jī)肥和氮磷鉀化肥；處理2，不施用有機(jī)肥，單施用氮磷鉀化肥；處理3，玉米秸稈+化肥；處理4，蠶豆秸稈+化肥；處理5，松針+化肥。各處理的重復(fù)設(shè)置、面積、施肥(品種、用量、時期等)和有機(jī)碳源物料(品種、用量、時期等)等試驗內(nèi)容與陳安強(qiáng)等的設(shè)置相同[8]。

1.2 土壤樣品采集、處理

2019年于油菜和水稻收獲期按照常規(guī)取樣法分別取0～20 cm土層土樣，每個小區(qū)對角線5點取樣，然后混合均勻為1個樣，挑除根系等雜質(zhì)后，一部分土樣過1 mm 篩后迅速放入做好標(biāo)記的自封袋中，置于低溫保溫箱中，帶回實驗室后分成2份，一份于-80 ℃冰柜中預(yù)冷凍1 h后再進(jìn)行冷凍干燥，待充分干燥后置于-80 ℃冰柜妥善保藏，以備后續(xù)DNA提取用。另一份進(jìn)行自然風(fēng)干，待充分干燥后置于室溫妥善保藏，用于后續(xù)理化性質(zhì)分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤養(yǎng)分指標(biāo)測定 土壤全氮(TN)含量采用凱氏定氮法測定，有機(jī)質(zhì)(OM)含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定，土壤pH采用pH 儀進(jìn)行測定[9]。

1.3.2 土壤DNA 提取、細(xì)菌16S rRNA基因的高通量測序 土壤微生物總DNA用OMEGA 土壤總DNA提取試劑盒按操作說明書進(jìn)行提取，DNA提取質(zhì)量通過0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA定量采用紫外分光光度計定量。合格DNA 送至上海派森諾生物股份有限公司進(jìn)行高通過測序。分別對細(xì)菌16S rRNA的單V區(qū)(V4)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，細(xì)菌16Sr RNA V4區(qū)PCR擴(kuò)增引物為520F(5′AYTGGGYDTAAAGN3′)和802R(5′TACNVGGGTATCTAATCC3′)。以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行Illumina MiSeq測序文庫制備，并進(jìn)行Illumina MiSeq系統(tǒng)測序。

1.3.3 土壤微生物高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)疑問序列識別、檢查并剔除嵌合體序列，獲得樣本的有效序列[10]。以每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，基于97 %的序列相似度進(jìn)行OTU歸并和劃分，構(gòu)建各樣本中OTU豐度矩陣。根據(jù)OTU豐度矩陣結(jié)果，計算每個樣本中共有的OTU數(shù)量；以Chao1豐富度指數(shù)和ACE指數(shù)評價微生物群落豐富度；以Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)評價微生物群落的均勻度。利用每個OTU的代表序列，進(jìn)行對應(yīng)數(shù)據(jù)庫的模板序列比對，細(xì)菌16S rRNA基因模板序列基因庫選用Greengenes數(shù)據(jù)庫(Release 13.8，http://greengenes. secondgenome.com/)[11]。通過OTU分類地位鑒定，獲得每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息，統(tǒng)計每個樣本在各分類水平組成。

1.3.4 土壤碳氮轉(zhuǎn)化功能微生物qPCR定量檢測分析 土壤DNA 提取方法、質(zhì)量和濃度及純度檢測同上。選取碳固定cbbL-R基因、氮固定的nifH基因和硝化作用的amoA、amoB基因為標(biāo)記基因，各功能基因擴(kuò)增所用引物序列及定量PCR擴(kuò)增程序參照顧卿等[12]。以土壤DNA為模板，進(jìn)行各個功能基因的PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行目的片段回收純化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(pMD18-T-158)、計算質(zhì)粒濃度和拷貝數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過PCR擴(kuò)增獲得檢測樣品的Ct 值，并計算特異性基因片段拷貝數(shù)。具體操作方法參照Walker等反應(yīng)體系及方法[13]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

測試數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel軟件整理；用DPS 7.05 Duncan多重比較法檢驗處理間差異性；用SPSS 18.0 的Perason雙變量相關(guān)分析法分析不同因子間相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤碳、氮素含量及pH

如圖1所示，化肥處理的土壤有機(jī)質(zhì)、碳氮比和pH等3個理化指標(biāo)均低于處理1(CK)，全氮含量則高于處理1(CK)，差異性顯著(P<0.05)；而有機(jī)碳源物料配施化肥各處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量和碳氮比等3個指標(biāo)數(shù)值則均有顯著提升，差異性顯著(P<0.05)。與油菜種植季相比，水稻種植季后土壤的有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量和碳氮比等3個指標(biāo)數(shù)值均呈降低趨勢。

圖2 土壤樣本細(xì)菌Clean tags、OTUs豐度及α多樣性指數(shù)Fig.2 Soil clean tags, OTUs abundance and diversity index of each soil samples

2.2 土壤細(xì)菌種群多樣性

如圖2所示，各處理的細(xì)菌Clean tags和OTUs差異性不顯著(P≥5)；豐富度指數(shù)Chao1和ACE以及均勻度指數(shù)Shannon和Simpson等4個多樣性指數(shù)差異性均不顯著(P≥5)；在不同的種植季，土壤細(xì)菌Clean tags數(shù)、OTUs豐度及α多樣性指數(shù)等的差異性均不顯著(P≥5)。

2.3 土壤細(xì)菌種群組成

如表1所示，根據(jù)物種注釋結(jié)果，在細(xì)菌門的分類水平上檢測到的前5個優(yōu)勢細(xì)菌種群，其相對豐度從大到小依次為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，5個優(yōu)勢細(xì)菌種群占總原核微生物群落豐度的91 %以上。在不同的種植季，細(xì)菌門分類上的種群結(jié)構(gòu)組成相似，平均相對豐度所占比例略有差異，但差異性未達(dá)顯著水平(P≥5)，兩季呈相似變化趨勢。

2.4 土壤環(huán)境因子與細(xì)菌種群間的相關(guān)分析

如表2所示，細(xì)菌種群中的Proteobacteria和Acidobacteria種群相對豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量和全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，Chloroflexi和Actinobacteria種群相對豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量和全氮含量間則呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。不同種植季土壤碳氮素與細(xì)菌種群相對豐度的關(guān)系呈相似趨勢。

2.5 土壤碳氮功能基因qPCR定量檢測統(tǒng)計結(jié)果

以單位土壤質(zhì)量DNA提取基因的拷貝數(shù)表征基因豐度，如表3所示，cbbL-R基因拷貝數(shù)各處理間差異性不顯著(P≥5)。處理1(CK)與處理2間nifH拷貝數(shù)差異性不顯著(P≥5)，而有機(jī)碳源物料配施化肥各處理的基因拷貝數(shù)則顯著增加(P<0.05)。單施化肥處理和有機(jī)碳源物料配施化肥處理均能顯著提高amoB的拷貝數(shù)；所有處理間amoA拷貝數(shù)差異性則不顯著(P≥5)。碳氮轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)呈amoB>nifH>amoA>cbbL-R的趨勢，相對于nifH拷貝數(shù)和amoA拷貝數(shù)，cbbL-R拷貝數(shù)少一個數(shù)量級；相對于nifH拷貝數(shù)和amoA拷貝數(shù)，amoB的拷貝數(shù)則高一個數(shù)量級。水稻種植季后各處理nifH拷貝數(shù)明顯增加，其它基因拷貝數(shù)與油菜種植季呈相似變化趨勢。

表4 土壤碳氮功能微生物種群與土壤環(huán)境因子相關(guān)性的Pearson分析

如表4所示，Perason分析結(jié)果表明，nifH拷貝數(shù)與土壤有機(jī)質(zhì)含量和全氮含量間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；其它功能基因拷貝數(shù)與土壤環(huán)境因子間呈正相關(guān)關(guān)系或負(fù)相關(guān)關(guān)系，但差異未達(dá)顯著性水平(P≥5)。油菜-水稻種植季土壤碳氮素對碳氮轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)的影響呈相似趨勢。

3 討 論

3.1 油菜-水稻輪作模式下土壤細(xì)菌種群變化特征

從試驗區(qū)土壤碳、氮素變化情況來看，在油菜-水稻輪作種植式下，單施化肥降低土壤有機(jī)質(zhì)和碳/氮比，而有機(jī)碳源物料配施化肥均提高土壤有機(jī)質(zhì)和碳/氮比，與油菜種植季相比，水稻種植季后土壤有機(jī)質(zhì)、全氮和碳/氮比均呈下降趨勢，這可能是水稻種植季部分碳氮素溶于水而淋失有關(guān)。但從總體趨勢來看，土壤碳/氮比與有機(jī)質(zhì)和全氮間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明可以通過增加土壤有機(jī)質(zhì)含量提高土壤氮固存，從而減少氮流失的策略的可行性。從土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)組成變化特征分析結(jié)果看，油菜-水稻水旱輪作模式和不同施肥處理未對其產(chǎn)生顯著影響，可能與其土壤較高的碳氮素含量有關(guān)。相關(guān)研究也表明，土壤中碳氮素的有效性是決定土壤微生物多樣性和功能多樣性的重要因素，微生物群落能夠通過調(diào)節(jié)自身的養(yǎng)分利用效率而適應(yīng)資源的不平衡[14-15]。仇存璞等在研究2種典型水稻土秸稈碳轉(zhuǎn)化的微生物過程發(fā)現(xiàn)，稻田土壤有機(jī)質(zhì)的含量和成份組成是影響微生物生物量和群落組成的核心因素，外源有機(jī)碳源物料添加主要導(dǎo)致了有機(jī)質(zhì)降解功能微生物種群結(jié)構(gòu)的變化，但土壤原有的有機(jī)質(zhì)含量和成份組成是導(dǎo)致這種變化的重要因素[16]。

3.2 油菜-水稻輪作模式下土壤碳氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度變化特征

微生物是土壤碳氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵過程的驅(qū)動者與調(diào)節(jié)者，微生物通過酶的催化作用介導(dǎo)代謝過程，而酶活性受相應(yīng)功能基因調(diào)控。其中，碳固定cbbL-R基因，甲烷代謝mcrA基因，纖維素降解CBH基因，氮固定的nifH基因，硝化作用的amoA基因，反硝化作用的nirK和nirS基因等均廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究，基因拷貝數(shù)可以指示碳氮轉(zhuǎn)化功能微生物的豐度[17]。本研究結(jié)果表明，各處理間固碳基因cbbL-R豐度差異性不顯著，化肥施用或有機(jī)碳源物料配施化肥對基因豐度的影響均不顯著，可能與試驗區(qū)土壤本底較高碳氮素含量有關(guān)。單施化肥處理顯著提高amoB基因豐度，而對amoA基因豐度影響不顯著，表明在該試驗區(qū)域土壤TN含量對amoB基因豐度的影響大于amoA基因豐度。相關(guān)研究也表明[18]，參與氮硝化作用的氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOB)具有完全不同的生態(tài)位，土壤氮素含量是決定其豐度的重要因素，高氮土壤環(huán)境是AOB驅(qū)動氮硝化作用的功能微生物，而低氮土壤環(huán)境是AOA驅(qū)動氮硝化作用的功能微生物，土壤環(huán)境條件主導(dǎo)AOB和AOA的生理生態(tài)功能，進(jìn)而對硝化作用過程產(chǎn)生影響。有機(jī)物料配施化肥顯著提高nifH基因和amoB基因豐度，表明化肥施用以及有機(jī)物料通過礦化和降解釋放氮補(bǔ)充土壤氮庫，促進(jìn)了固氮細(xì)菌的生長繁殖，顯著提高固氮微生物種群的豐度；同時避免了固氮微生物與作物競爭氮素，促進(jìn)作物生長，提高土壤自身固氮能力，與劉驍蒨等的試驗結(jié)果相同[19]。從不同種植季碳氮功能基因豐度變化來看，水旱輪作種植模式對固碳基因cbbL-R和硝化作用amoA、amoB基因的豐度影響不顯著，但水稻種植季顯著提高了氮固定的nifH基因的豐度，水稻種植促進(jìn)了固氮微生物種群豐度和活性，對固碳功能微生物種群和氮硝化功能微生物種群豐度和活性的影響較小。研究結(jié)果中碳氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度的變化情況直接反映了較高碳氮素含量土壤背景下，碳氮轉(zhuǎn)化功能微生物種群豐度對油菜和水稻輪作種植模式對的響應(yīng)情況。

4 結(jié) 論

在洱海流域油菜-水稻水旱輪作農(nóng)田，土壤有機(jī)質(zhì)(OM)和全氮(TN)與細(xì)菌種群中的變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的種群相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與綠彎菌門(Chloroflexi)和放線菌門(Actinobacteria)的種群相對豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系；其中，土壤OM對微生物種群豐度的影響解釋度最高。在油菜和水稻種植季，不同處理間Clean tags數(shù)量、OTUs豐度及α多樣性指數(shù)差異性不顯著(P≥5)，門分類水平上的優(yōu)勢細(xì)菌種群相對豐度差異性不顯著(P≥5)。

處理間固碳基因cbbL-R和氨氧化基因amoA的拷貝數(shù)差異性不顯著(P≥5)，有機(jī)碳源物料配施化肥顯著提高固氮基因nifH和氨氧化基因amoA拷貝數(shù)(P<0.05)；土壤全氮(TN)對土壤碳氮轉(zhuǎn)化功能基因拷貝數(shù)影響的解釋度最高。在油菜和水稻種植季，油菜和水稻種植季土壤碳氮轉(zhuǎn)化功能基因豐度呈相似變化趨勢。

在洱海流域油菜-水稻水旱輪作農(nóng)田，水旱輪作對土壤細(xì)菌種群多樣性的影響不顯著(P≥5)，其群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性穩(wěn)定性可能與土壤本底較高的碳氮素含量有關(guān)。