張瓊宇 胡海星 唐云云 羅湘玲 孫遠(yuǎn)東

(1. 永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)部, 永州 425100; 2. 長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境科學(xué)系, 長沙 410004;3. 湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湘潭 411201)

在脊椎動物胚胎發(fā)育過程中, 循環(huán)系統(tǒng)是最早建立并行使功能的器官系統(tǒng)之一。有效的血液循環(huán)為各組織器官提供了必需的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、激素和代謝產(chǎn)物, 是胚胎生長發(fā)育和存活的前提[1]。

ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員都包含一個高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 即ETS結(jié)構(gòu)域。它由約85個氨基酸殘基組成, 能夠特異性識別并結(jié)合含有GGAA/T的DNA核心序列從而調(diào)控基因的表達(dá)[2]。在脊椎動物胚胎發(fā)生過程中, 至少有13個ETS轉(zhuǎn)錄因子在造血或內(nèi)皮細(xì)胞譜系中表達(dá), 它們通過激活或抑制下游基因的表達(dá)在造血和血管發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[3,4]。其中, ETV2(Ets variant 2), 又稱ER71/Etsrp, 是成血液血管干細(xì)胞(Hemangioblast)和內(nèi)皮祖細(xì)胞最早表達(dá)的標(biāo)志物之一[5,6]。etv2基因突變的小鼠(Mus musculus)由于造血和血管生成受阻而死于胚胎發(fā)育的第9.5天[5,7]。在斑馬魚(Danio rerio)胚胎中etv2突變或注射反義嗎啡林寡核苷酸(Morpholino)敲降etv2可抑制所有已知血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá), 在受精后24h(24hpf)之前幾乎沒有血管內(nèi)皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞的分化[6,8,9]。在斑馬魚胚胎中, 過表達(dá)斑馬魚、人(Homo sapiens)源或鼠源etv2均可特異性上調(diào)成血液血管干細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞標(biāo)記基因的表達(dá), 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和髓系細(xì)胞的生成[6,9,10]。此外, 在爪蟾(Xenopus tropicalis)胚胎中過表達(dá)etv2也出現(xiàn)類似結(jié)果[11]。這些研究結(jié)果表明ETV2的功能在不同脊椎動物胚胎中十分保守, 是造血和內(nèi)皮細(xì)胞分化發(fā)育最早階段所必需的轉(zhuǎn)錄因子。

在魚類中, 采用人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育或者雄核發(fā)育可獲得只遺傳母本或者父本基因組的單倍體個體[12]。各種人工誘導(dǎo)的魚類單倍體在胚胎發(fā)育過程中絕大部分都呈現(xiàn)出“單倍體綜合癥”, 水腫、心血管畸形和循環(huán)障礙是其中的主要表現(xiàn)[13—16]。因此, 人工誘導(dǎo)的魚類單倍體為研究脊椎動物循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供了獨特的實驗系統(tǒng)。目前, 有關(guān)魚類單倍體循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育異常的報道主要局限于形態(tài)描述, 尚未對其產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行深入研究。金魚(Carassius auratus)具有由隱性基因編碼的雙尾性狀, 可以通過具有單尾顯性性狀的近緣魚類遺傳失活的精子刺激金魚卵子進(jìn)行雌核發(fā)育, 然后利用金魚雙尾的遺傳性狀在胚胎發(fā)育早期準(zhǔn)確鑒定雌核發(fā)育單倍體胚胎[17,18]。故此, 我們選擇金魚為實驗動物, 探究單倍體胚胎循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育異常的分子機(jī)制。本研究克隆了金魚etv2基因, 分析了其在胚胎和成體組織中的表達(dá)模式以及在雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體早期胚胎發(fā)生中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

金魚紅帽品系和雄性野生鯉(Cyprinus carpioL.)取自湖南省水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐教學(xué)示范中心。分離1齡金魚性腺(卵巢或精巢)、腦、腎臟、肝臟、心臟、脾臟和肌肉等多種組織樣品, 分別在液氮中快速冷凍后, 保存于–80℃冰箱備用。

1.2 金魚雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎的獲得

金魚繁殖季節(jié), 用紫外線照射鯉精液, 完全破壞其遺傳物質(zhì), 利用處理后的精子人工誘導(dǎo)金魚成熟卵子的雌核發(fā)育, 得到雌核發(fā)育單倍體胚胎; 自交二倍體金魚胚胎通過人工授精獲得, 具體方法按先前的文獻(xiàn)進(jìn)行[18]。雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體來自同一條雌魚。金魚受精卵于(20±0.5)℃孵育,受精后3—5min用0.25%的胰蛋白酶去膜。由于紅帽金魚具有編碼雙尾的隱性基因, 而鯉具有編碼單尾的顯性基因, 所以金魚和鯉的雜合二倍體胚胎是單尾的, 而金魚雌核發(fā)育單倍體是雙尾的。如果鯉精子遺傳物質(zhì)未被紫外線破壞, 那么利用其使金魚卵子受精所得胚胎為雜合二倍體, 在體節(jié)形成早期具有尾柄細(xì)長的單尾表型, 而不是尾柄短鈍的雙尾表型。根據(jù)這一表型特征, 即可通過體視鏡觀察將少量雜合二倍體胚胎從單倍體胚胎中剔除。所有金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎都在攝食期前死亡。

取不同發(fā)育時期的雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎, 包括32細(xì)胞期、1K細(xì)胞期、尾芽期、6體節(jié)期、14體節(jié)期、20體節(jié)期、25% OVC (Otic vesicle closure, 耳囊閉合期)、35% OVC和96hpf,用于RNA提取或整胚原位雜交。

1.3 RNA提取和cDNA第一條鏈的獲得

利用TRIzol(Invitrogen)分別提取金魚各成體組織以及不同發(fā)育時期雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎材料的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計測定RNA完整性和濃度。采用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)合成cDNA第一條鏈。

1.4 金魚etv2編碼區(qū)片段的克隆和全長cDNA序列的獲得

利用鯉科魚類的同源性, 根據(jù)GenBank中斑馬魚etv2/etsrp基因(DQ021472)編碼區(qū)序列設(shè)計合成引物E-F和E-R(表 1), 以14體節(jié)期金魚自交二倍體胚胎RNA逆轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖 1)。目的片段回收純化后, 進(jìn)行亞克隆和序列測定。使用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中Blast功能對測序結(jié)果進(jìn)行序列分析, 確認(rèn)其是否為金魚etv2基因的cDNA序列。

表 1 本研究所使用的PCR引物Tab. 1 Primers used in this study

根據(jù)已獲得的部分etv2基因cDNA序列設(shè)計合成特異的3′-RACE和5′-RACE引物(表 1), 然后分別利用3′-Full RACE Core Set(TaKaRa)和SMART?RACE cDNA Amplification Kit(Clonetech)試劑盒擴(kuò)增etv2基因的3′和5′序列(圖 1), 具體操作按照說明書進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、克隆和測序, 再與之前已獲得的部分cDNA序列進(jìn)行拼接即得到金魚etv2基因的全長cDNA序列, 將所得序列提交至GenBank。

1.5 生物信息學(xué)分析

運用DNASTAR 7軟件拼接金魚etv2基因cDNA序列、確定開放閱讀框并預(yù)測其編碼氨基酸序列。Protparam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白分子量、等電點和各種氨基酸含量。利用SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域。使用CLUSTAL Omega在線服務(wù)(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)和DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行多序列比對。利用MEGA 7軟件以鄰近法 (Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 RT-PCR和熒光實時定量PCR(qRT-PCR)分析etv2基因的表達(dá)

設(shè)計合成特異引物E-S和E-A(表 1), 利用半定量RT-PCR分析etv2在金魚不同發(fā)育階段以及不同器官組織中的表達(dá)情況。設(shè)計qRT-PCR引物ERS和E-RA(表 1)檢測etv2的相對表達(dá)量。PCR反應(yīng)及檢測在ABI公司的Prism7500 Sequence Detection System上進(jìn)行。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性, 對每一種樣品的分析都重復(fù)4次。反應(yīng)條件為: 50℃ 2min;95℃ 10min; 95℃ 15s, 60℃ 45s, 40個循環(huán)。以金魚β-actin作為內(nèi)參基因,etv2基因的相對表達(dá)量采用Livak和Schmittgen[19]提出的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法2–??Ct,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示。采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析, 多組間兩兩比較采用Tukey’s多重比較檢驗,P<0.05表示存在顯著性差異。

1.7 整胚原位雜交和冰凍切片

利用特異性引物E-F1和E-R1(表 1)通過RTPCR擴(kuò)增etv2基因部分cDNA序列。所得DNA片段克隆到pEGM-T載體(Promega)中, 構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)亞克隆測序后用限制性內(nèi)切酶NotⅠ(TaKaRa)進(jìn)行線性化處理, 然后以此為模板利用T7 RNA多聚酶(Roche)合成地高辛標(biāo)記的反義RNA探針。整胚原位雜交方法按照先前的文獻(xiàn)報道進(jìn)行[20]。已完成原位雜交檢測后的胚胎經(jīng)4%多聚甲醛固定后,再用OCT(SAKURA)包埋, 于–21℃下進(jìn)行冰凍切片。

2 結(jié)果

2.1 金魚etv2基因cDNA結(jié)構(gòu)及預(yù)測的氨基酸序列

利用RT-PCR在14體節(jié)期金魚自交二倍體胚胎的RNA中擴(kuò)增出一段長約930 bp的DNA片段。測序后BLAST分析結(jié)果顯示該片段與斑馬魚etv2 cDNA序列高度相似, 故可以確定其為金魚etv2部分cDNA序列。隨后根據(jù)該序列設(shè)計特異性嵌套引物, 通過5′-RACE和3′-RACE獲得了金魚etv2基因的5′和3′端cDNA序列(圖 1), 拼接后即得全長cDNA序列。金魚etv2基因cDNA全長1531 bp, 包括5′非編碼區(qū)64 bp, 3′非編碼區(qū)351 bp, 其開放閱讀框(ORF)為1116 bp, 編碼371個氨基酸, 其中第244到327位氨基酸為ETS轉(zhuǎn)錄因子家族所特有的ETS結(jié)構(gòu)域。預(yù)測的ETV2蛋白分子量約為41592.92 Da, 等電點為5.68, 氨基酸組成中絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)含量最多。所得的金魚etv2基因全長cDNA序列Gen-Bank登錄號為MK766456。

2.2 同源性分析和分子進(jìn)化樹的構(gòu)建

圖 1 金魚etv2全長cDNA克隆所用引物擴(kuò)增范圍示意圖Fig. 1 Primer positions for cloning the full length etv2 cDNA of goldfish

對比金魚、斑馬魚、熱帶爪蟾、鼠、牛(Bos taurus)和人等6種脊椎動物的ETV2氨基酸序列發(fā)現(xiàn), 金魚ETV2與斑馬魚ETV2的相似性最高, 達(dá)86.9%, ETS結(jié)構(gòu)域的相似性為100%; 金魚ETV2與熱帶爪蟾ETV2的相似性為31.6%, ETS結(jié)構(gòu)域的相似性為83.3%; 金魚ETV2與鼠、牛和人等哺乳類ETV2的相似性分別為25.2%、25.5%和25.5%,ETS結(jié)構(gòu)域的相似性均為60.7%?？梢? 除了C端的ETS結(jié)構(gòu)域之外, ETV2蛋白的其余部分在不同物種之間相似性較低, 具有較大差異。鄰近法構(gòu)建金魚ETV2與斑馬魚、熱帶爪蟾、鼠、牛和人中同系物的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖 2)。進(jìn)化樹顯示ETV2進(jìn)化關(guān)系與ETS1和ETS2分開。金魚和斑馬魚ETV2親緣關(guān)系最近, 首先聚類為一支, 進(jìn)而與脊椎動物其他物種的ETV2聚類形成一個大的分支。

2.3 金魚胚胎中etv2基因的時空表達(dá)模式

為了了解金魚自交二倍體胚胎正常發(fā)育過程中etv2基因的時空表達(dá)模式, 利用半定量RT-PCR檢測了金魚未受精卵以及自交二倍體胚胎32細(xì)胞期、1K細(xì)胞期、尾芽期、6體節(jié)期、14體節(jié)期、20體節(jié)期和25% OVC等不同發(fā)育階段的etv2表達(dá)情況(圖 3a)。結(jié)果顯示, 在未受精卵、32細(xì)胞期和1K細(xì)胞期沒有檢測到etv2表達(dá); 從尾芽期開始,etv2有微量表達(dá); 在6體節(jié)期、14體節(jié)期、20體節(jié)期和25% OVC,etv2表達(dá)水平較高。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,etv2基因在尾芽期表達(dá)水平最低, 在之后的發(fā)育時期表達(dá)水平逐漸升高, 20體節(jié)期達(dá)到最高水平, 25% OVC的表達(dá)水平低于20體節(jié)期(圖 3b)。

在體節(jié)產(chǎn)生之前, 整胚原位雜交沒有檢測到明顯的etv2表達(dá)信號(數(shù)據(jù)未顯示)。在體節(jié)形成后,可以看到etv2特異性表達(dá)于前側(cè)板中胚層(Anterior lateral plate mesoderm, ALPM)和后側(cè)板中胚層(Posterior lateral plate mesoderm, PLPM)中, 胚胎前端的etv2表達(dá)信號在索前板處匯合(圖 4a)。隨著胚胎的發(fā)育,胚胎后部的etv2表達(dá)信號進(jìn)一步向尾部延伸。14體節(jié)期,etv2在胚胎的前部、軀干和后部兩側(cè)的成血管細(xì)胞中表達(dá)十分明顯(圖 4b—d); 在PLPM區(qū)域可以看到一部分胚胎軀干和尾部表達(dá)etv2的成血管細(xì)胞由體節(jié)之間從胚胎兩側(cè)向中線遷移(圖 4c黑色箭頭所示), 而ALPM 區(qū)域的成血管細(xì)胞保持兩側(cè)定位不會向中線遷移(圖 4e); 胚胎頭部前端的表達(dá)信號逐漸消失(圖 4d), 但在胚胎尾部腹側(cè)出現(xiàn)表達(dá)信號(圖 4d白色箭頭所示)。20體節(jié)期, 在前側(cè)板中胚層、預(yù)定前主靜脈和總主靜脈以及尾芽旁的成血管細(xì)胞中有很強的etv2表達(dá)(圖 4f); 背主動脈中也可見明顯的etv2表達(dá)信號(圖 4g)。在25% OVC, 軸向血管、頭部雙側(cè)原始靜脈(Primordial hindbrain channel, PHBC)以及尾部靜脈叢可見etv2的表達(dá)(圖 4h)。在35% OVC, 大部分軸向血管中的etv2表達(dá)信號消失, 僅部分頭部血管和后主靜脈有微弱表達(dá), 但尾部靜脈叢及部分尾部體節(jié)間血管仍清晰可見(圖 4i)。在96hpf, 未見明顯的etv2表達(dá)信號(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.4 金魚etv2 mRNA在成體組織中的分布

以未受精卵為陰性對照、14體節(jié)期為陽性對照, 利用半定量RT-PCR方法檢測etv2基因在腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肌肉、卵巢和精巢等8種組織中的表達(dá)(圖 3c)。結(jié)果表明, 在金魚的肝臟、心臟、肌肉和腎臟中可以檢測到etv2大量表達(dá), 在精巢、腦和脾臟中可以檢測到etv2少量表達(dá), 在卵巢中沒有檢測到etv2表達(dá)。

2.5 金魚etv2在雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中的表達(dá)存在明顯差異

圖 2 金魚ETV2及斑馬魚、熱帶爪蟾、鼠、牛和人中同源物的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of goldfish ETV2 and its closest zebrafish, frog, mouse, cattle and human homologs

已有研究表明,etv2是血管發(fā)生的主調(diào)控基因[21],對脊椎動物脈管系統(tǒng)和血液循環(huán)的建成具有非冗余和不可替代的功能[22,23]。因此, 比較分析金魚etv2在雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎發(fā)育早期的表達(dá)情況對探討雌核發(fā)育單倍體循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育異常的分子機(jī)制具有重要意義。然而, 一旦循環(huán)系統(tǒng)建成后,etv2的表達(dá)就將下調(diào)[5,24], 于是我們主要比較了14體節(jié)和20體節(jié)期雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中etv2的表達(dá)差異。整胚原位雜交結(jié)果顯示, 在14體節(jié)期(圖 5a和圖 5b), 與自交二倍體胚胎相比,etv2的表達(dá)在單倍體胚體中線或/和軀干兩側(cè)部分區(qū)域缺失(85%,n=40); 在20體節(jié)期(圖 5c和圖 5d), 與自交二倍體胚胎相比, 單倍體胚胎中etv2的表達(dá)出現(xiàn)不同程度減弱或/和在軀干及尾部的部分區(qū)域表達(dá)缺失(72.5%,n=40)。qRT-PCR結(jié)果顯示, 14體節(jié)期和20體節(jié)期, 金魚單倍體胚胎中etv2的表達(dá)均顯著低于自交二倍體(圖 5e和圖 5f)。對14體節(jié)期已完成etv2反義RNA整胚原位雜交檢測的金魚胚胎進(jìn)行冰凍切片, 觀察胚胎橫截面發(fā)現(xiàn),在自交二倍體胚胎中etv2表達(dá)信號所標(biāo)示的部分成血管細(xì)胞已經(jīng)從胚體兩側(cè)遷移到了脊索下方(圖 5g,箭頭所示), 而單倍體胚胎中成血管細(xì)胞雖已分為內(nèi)側(cè)(圖 5h黑色箭頭)和外側(cè)(圖 5h白色箭頭)兩個亞群, 但仍保持胚體兩側(cè)定位, 不能遷移到胚體中線。這些結(jié)果表明金魚胚胎早期發(fā)育的血管發(fā)生階段, 雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體中etv2的表達(dá)存在明顯差異。

3 討論

3.1 金魚etv2序列分析

圖 3 etv2在金魚中的表達(dá)分析Fig. 3 The expression of etv2 in goldfish

本研究利用RT-PCR結(jié)合RACE-PCR方法克隆了金魚etv2基因的cDNA全長序列, 并根據(jù)其ORF序列預(yù)測了ETV2蛋白的氨基酸序列。利用生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)金魚ETV2蛋白僅在其C端含有一個ETS結(jié)構(gòu)域, 除此之外, 沒有其他明顯可識別的結(jié)構(gòu)域, 這與其他脊椎動物ETV2蛋白類似[9]。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn), 金魚與斑馬魚的ETV2氨基酸序列存在較高的相似性, 尤其是兩者的ETS結(jié)構(gòu)域氨基酸序列完全相同。由于ETS結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合核心序列GGAA/T廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞譜系特異性表達(dá)基因的啟動子和增強子中[25], 而不同物種ETV2蛋白的功能十分保守[9], 并且金魚etv2基因也特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞及其前體中(圖 4),因此可以推測其在早期血管發(fā)生過程中也扮演重要角色。

3.2 金魚etv2表達(dá)模式分析

在斑馬魚中, 除了cloche/npas4l,etv2比任何已知造血和內(nèi)皮細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子都要更早表達(dá)[26,27]。RT-PCR結(jié)果顯示金魚etv2從尾芽期開始表達(dá), 但是整胚原位雜交只能在體節(jié)形成后才能檢測到其表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示在20體節(jié)期前etv2的表達(dá)逐漸升高, 而25% OVC時期明顯下降(圖 3b); 整胚原位雜交也顯示etv2在胚胎出現(xiàn)血液循環(huán)以后表達(dá)下調(diào)(圖 4i), 胚胎發(fā)育至96hpf幾乎無法檢測到。這與其他脊椎動物胚胎中觀察到的etv2表達(dá)模式類似[5,6,8,24,28], 說明胚胎發(fā)育時期,etv2在內(nèi)皮細(xì)胞譜系中瞬時表達(dá), 提示etv2對脈管系統(tǒng)的發(fā)育形成具有重要作用, 但對維持其正常生理功能并不重要。

ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員往往可以在多種成體組織中檢測到表達(dá)[29], 但在小鼠和人成體中, Northern blot檢測到etv2/ER71僅在睪丸中特異性表達(dá)[30,31]。與之不同, 我們利用RT-PCR方法在除了卵巢以外的多個金魚成體器官組織中都檢測到了etv2的表達(dá)(圖 3c), 這可能與檢測方法不同有關(guān)?？紤]到etv2在胚胎發(fā)育過程中具有瞬時表達(dá)的特性, 可以推測etv2可能僅在某些成體組織的一小部分細(xì)胞中被瞬時激活表達(dá), 由于其mRNA豐度極低,所以Northern blot方法檢測不到。確實也有報道發(fā)現(xiàn), 小鼠成體骨髓組織中etv2表達(dá)水平很低, 但其中分離的Lin-Sca1+c-Kit+(LSK)細(xì)胞中etv2表達(dá)水平較高[32]。

3.3 etv2異常表達(dá)可能是導(dǎo)致金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎血管發(fā)生異常的原因之一

脊椎動物的血管發(fā)育包括血管發(fā)生(Vasculogenesis)以及血管重塑(Angiogenesis)兩個過程[33,34]。血管發(fā)生是指不依賴于已有的血管, 從無到有產(chǎn)生血管的過程。在斑馬魚中, 血管發(fā)生始于12hpf(4體節(jié)期), 此時側(cè)板中胚層中首先特化產(chǎn)生成血管細(xì)胞, 并形成內(nèi)側(cè)和外側(cè)兩個成血管細(xì)胞亞群。隨后它們大約在14hpf(約10體節(jié)期)和16hpf(約15體節(jié)期)分兩批向胚胎中線遷移, 在內(nèi)胚層上方和脊索下方聚集融合形成沿胚軸排列的血管索, 之后發(fā)育為主要軸向血管。其中, 內(nèi)側(cè)成血管細(xì)胞分化產(chǎn)生背主動脈, 而外側(cè)成血管細(xì)胞則分化產(chǎn)生后主靜脈[35,36]。etv2的表達(dá)對成血管細(xì)胞的分化、遷移以及融合形成功能性血管都十分重要[6,8,35]。在金魚胚胎14—20體節(jié)期, 可以觀察到雌核發(fā)育單倍體中etv2的表達(dá)在某些軀干部位表達(dá)缺失, 尤其是中線表達(dá)缺失(圖5b、5d和5h), 這說明雌核發(fā)育單倍體中成血管細(xì)胞數(shù)量減少, 向中線遷移存在障礙, 軸向血管形成異常。在斑馬魚中用morpholino敲降etv2, 可導(dǎo)致成血管細(xì)胞不能遷移,etv2在胚胎中線的表達(dá)缺失[6], 說明ETV2蛋白的劑量本身可影響etv2基因的表達(dá)模式。我們發(fā)現(xiàn)金魚etv2在單倍體胚胎14—20體節(jié)時期的表達(dá)水平較低(圖 5e和圖 5f),這可能是金魚雌核發(fā)育單倍體中etv2表達(dá)部分缺失、成血管細(xì)胞減少和不能遷移的原因之一。先前研究發(fā)現(xiàn), 由于存在母源甲基化現(xiàn)象, 調(diào)控中胚層特化及向中線匯聚所必需的ntl基因在金魚雌核發(fā)育單倍體胚胎早期發(fā)育中的表達(dá)受到抑制[37]; 而成血管細(xì)胞起源于中胚層細(xì)胞, 所以可以推測ntl基因的異常表達(dá)可能間接影響了etv2的表達(dá)模式。此外, 單倍體胚盤中存在廣泛的非特異性細(xì)胞死亡和細(xì)胞排列紊亂[13], 這也可能是導(dǎo)致成血管細(xì)胞減少和向胚胎中線遷移受阻的重要原因。

圖 4 金魚etv2在早期胚胎發(fā)育中的時空表達(dá)模式Fig. 4 Spatial and temporal expression pattern of goldfish etv2 during early embryogenesis

圖 5 14體節(jié)和20體節(jié)期金魚雌核發(fā)育單倍體與自交二倍體胚胎中etv2的差異表達(dá)Fig. 5 Differential expression of etv2 in gynogenetic haploid and inbred diploid goldfish embryos at 14-somite stage and 20-smoite stage

總之, 在本研究中, 我們克隆了金魚etv2/ER71/Etsrp基因的全長cDNA, 并證明其表達(dá)模式在雌核發(fā)育單倍體和自交二倍體胚胎中存在差異, 為進(jìn)一步揭示單倍體循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育缺陷的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。