沈銘浩 朱迦玥 吳 濤 任天惠 張哲盼 熊 黎 劉芳玲 鄭善堅(jiān)

(1. 浙江師范大學(xué)生化學(xué)院, 金華 321004; 2. 浙江師范大學(xué)野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 金華 321004)

胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(Insulin like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)是一種功能近似胰島素類似物的單鏈多肽, 其mRNA檢測(cè)結(jié)果表明其在魚類各組織中均有表達(dá), 其中肝臟內(nèi)的表達(dá)尤為顯著。自虹鱒(Oncorhynchus mykiss)鰓軟骨組織的體外研究發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ基因[1], 現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ基因具有調(diào)控細(xì)胞代謝、促進(jìn)細(xì)胞增殖、保護(hù)腸道黏膜屏障、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育等多種生物學(xué)功能[2]。魚類營(yíng)養(yǎng)狀況可影響IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平, 從而影響其氮代謝[3], 尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的IGF-Ⅰ基因表達(dá)與其生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性[4], 外源IGF-Ⅰ蛋白對(duì)半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)幼魚的生長(zhǎng)有積極的促進(jìn)作用[5]。近年來(lái), 魚類IGF-Ⅰ基因的生理功能, 表達(dá)調(diào)控越來(lái)越受關(guān)注。

寬鰭鱲(Zacco platypus)為南方山區(qū)一種溪流性小型魚類, 其肉質(zhì)鮮美, 營(yíng)養(yǎng)豐富, 深受大家喜愛,形成了一定養(yǎng)殖規(guī)模[6]。在養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其在生長(zhǎng)速度上存在明顯的雌雄差異, 雄性成體普遍大于同批孵化的雌性個(gè)體。但目前僅局限于養(yǎng)殖技術(shù)和遺傳多樣性研究[7,8]。本研究首次克隆了寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因, 利用熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescencein situhybridization, FISH)對(duì)寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析, 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Quantitative Real-time PCR, RT-qPCR)探究不同性別寬鰭鱲各時(shí)期不同組織中IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平相對(duì)差異, 探究寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)其性二態(tài)的現(xiàn)象所產(chǎn)生的影響。提高寬鰭鱲繁育效率有著巨大的經(jīng)濟(jì)效益, 分子標(biāo)記技術(shù)是提高遺傳育種效率的有效輔助手段, 本研究旨在為寬鰭鱲的育種和人工繁育提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自浙江省麗水市鋒魚養(yǎng)殖場(chǎng)分別取幼魚期5月齡、7月齡和成魚期12月齡、18月齡的雌雄魚各5尾, 規(guī)格在2—30 g。記錄體質(zhì)量、體長(zhǎng)等指標(biāo)后, 取腦、脾、腎、性腺、肝和心臟組織置于1.5 mL凍存管中經(jīng)液氮速凍后–80℃保存。剪取少量寬鰭鱲尾鰭組織, –20℃無(wú)水乙醇保存。

主要試劑: RNA提取試劑(TaKaRa)、TA克隆載體pMD19-T、SMARTTMRACE試劑盒購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司, DNA提取試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司; PCR反應(yīng)試劑、UltraSYBR Mixture、去基因組cDNA合成試劑盒均購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司, PCR引物的合成及測(cè)序委托上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的克隆

采用傳統(tǒng)酚氯仿抽提法提取寬鰭鱲肝臟總RNA, 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 獲得cDNA一鏈。Blast比對(duì)GenBank中與寬鰭鱲同屬鯉科的草魚(Ctenopharyngodon idella)和鯉(Cyprinus carpio)等近緣物種IGF-Ⅰ基因cDNA序列, 根據(jù)其保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物IGF-Ⅰ-C, 以寬鰭鱲cDNA為模板進(jìn)行同源片段的擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系; 94℃5min; 94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 2min, 30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。得到單一條帶后回收PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行正反向測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果Primer Premier 5設(shè)計(jì)RACE引物, 以寬鰭鱲cDNA為模板, 利用引物IGF-Ⅰ-A-F1/R1, 進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增, 電泳后將得到的單一條帶進(jìn)行切膠回收, 以pMD19-T為載體進(jìn)行TA克隆, 選取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。DNAMAN 6.0軟件拼接得到寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的cDNA全長(zhǎng), 利用ORFfinder查找完整的開放閱讀框(ORF), 根據(jù)拼接的序列設(shè)計(jì)包含起始密碼子的上游引物IGF-Ⅰ-ORF-F和包含終止密碼子的下游引物IGF-Ⅰ-ORFR, 以寬鰭鱲cDNA為模板擴(kuò)增基因的完整開放閱讀框進(jìn)行驗(yàn)證。

根據(jù)測(cè)序所得寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的cDNA序列設(shè)計(jì)8對(duì)特異性引物(表 1), 克隆寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因全序列, PCR反應(yīng)體系為25 μL體系, 最佳退火溫度通過(guò)溫度梯度PCR得出, 延伸時(shí)間根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度變化, 每1000 pb延伸1min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的生物學(xué)分析

DNASTAR 7.0進(jìn)行序列拼接獲得全長(zhǎng); DNA-MAN 6.0軟件翻譯堿基序列得到氨基酸序列; E×PASy在線protparam程序分析氨基酸的有關(guān)物理參數(shù);bioinf程序結(jié)合predictprotein程序分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu); MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 分別用ClustalX和MEGA 6.0進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析,采取鄰位相接法, Boot-strap重復(fù)1000次計(jì)算各分枝的置信度, 構(gòu)建寬鰭鱲與鳙(Aristichthys nobilis)、鳡(Elopichthys bambusa)等17種魚類的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表 1 IGF-Ⅰ基因引物序列Tab. 1 IGF-Ⅰ gene primer sequence

1.4 RT-qPCR分析

用RNAiso Plus(TaKaRa)分別提取寬鰭鱲肝、脾、腎、腦、心臟和性腺組織RNA, 用核酸定量?jī)x和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量和完整性。HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit試劑反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因的開放閱讀框cDNA序列, Primer Premier 5設(shè)計(jì)合成正反向特異熒光定量引物IGF-Ⅰ-Q, 并且以內(nèi)參基因EF1α作為對(duì)照。

RT-qPCR分析用2×UltraSYBR Mixture(High ROX)進(jìn)行。每樣做3個(gè)重復(fù), 采用2–ΔΔCt方法分析所得數(shù)據(jù), 計(jì)算IGF-Ⅰ基因在各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)水平。用SPSS 21軟件進(jìn)行SNK法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn), 以及基因相對(duì)表達(dá)水平與雌雄寬鰭鱲成魚體長(zhǎng)的偏相關(guān)關(guān)系。

1.5 組織切片HE染色

根據(jù)RT-qPCR結(jié)果, 取雌雄寬鰭鱲性腺與肝臟組織, 4%甲醛固定組織, 常規(guī)梯度乙醇脫水, 環(huán)保型生物透明劑透明, 石蠟包埋, 制作連續(xù)切片, 切片厚6—8 μm, HE染色。切片標(biāo)本置OLYMPUS BX51顯微鏡(配冷光源數(shù)碼相機(jī)OLYMPUS DPT0)下觀察、拍照。

1.6 熒光原位雜交

取HE染色相同部位的連續(xù)切片, 二甲苯溶液脫蠟3次, 乙醇按梯度浸洗10次; 加入PBS, 切片置于空氣中。試管中加入40 mL 2×SSC預(yù)熱, 加K酶消化溶液后37℃水浴20min, 2×SSC漂洗3次;乙醇按梯度浸洗10次。載玻片上滴加70 μL雜交液,探針濃度10 μm, 序列為: 5′-CTCTCCCGTTCGCTA AATCTCACTTGGATTGATAGAACATGACCTA CATCCTGC-DIG-3′; 封片, 雜交儀上95℃反應(yīng)5min, 37℃反應(yīng)14h。撕封片膠, 按5×SSC溶液梯度洗片, 加1×PBS后甩干, 滴加封閉液后吸干, 用羅丹明抗—地高辛抗體孵育1h; 1×PBS洗3次; 滴加FITC-TSA試劑, 避光室溫反應(yīng)5min。后TBST洗3次×10min, PBS洗1次5min; 利用DAPI染液進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染色, 避光孵育8min, 沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 IGF-Ⅰ基因的克隆、測(cè)序及鑒定

測(cè)序拼接獲得全序列13707 bp, 其堿基組成為:A+T占61.13%, C+G占38.87%。與GenBank中鯉和草魚IGF-Ⅰ基因的DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析, 相似度分別為83%和92%, 因此可認(rèn)為所獲得的序列為寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因序列。將該序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù), 獲得登錄號(hào)MT364420。寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因包含4個(gè)內(nèi)含子、5個(gè)外顯子。5個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為222、160、182、36和829 bp; mRNA序列長(zhǎng)度為2036 bp, 其中ORF區(qū)長(zhǎng)度486 bp, 5′-非翻譯區(qū)250 bp,3′-非翻譯區(qū)1300 bp。寬鰭鱲IGF-Ⅰ蛋白由161個(gè)氨基酸組成。

E×PASy在線protparam程序分析寬鰭鱲IGF-Ⅰ蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為17.93 kD, 理論等電點(diǎn)(Isoelectric point, pI)為9.20, 分子式: C766H1217N237O229S16。其中, 絲氨酸(Ser)含量最高, 為9.9%。帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)12個(gè), 帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys) 22個(gè)。脂肪族氨基酸指數(shù)為57.52。經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)序列分析, 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因氨基酸預(yù)測(cè)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。

寬鰭鱲IGF-Ⅰ前體肽由信號(hào)肽、成熟肽、E肽三部分組成。其中信號(hào)肽44個(gè)氨基酸, 成熟肽70個(gè)氨基酸, E肽47個(gè)氨基酸; 成熟肽由B、C、A和D四個(gè)區(qū)域組成, 氨基酸個(gè)數(shù)分別為29、12、21和8。IGF-Ⅰ蛋白的各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的相似性有較大的差異, 成熟肽中B結(jié)構(gòu)域和A結(jié)構(gòu)域的保守性最高,A結(jié)構(gòu)域完全一致。寬鰭鱲成熟肽存在CysB6、CysB18、CysA6、CysA7、CysA11和CysA20六個(gè)半胱氨酸殘基。其中B結(jié)構(gòu)域與A結(jié)構(gòu)域之間形成2個(gè)二硫鍵, 而A結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部形成1個(gè)二硫鍵。在寬鰭鱲B區(qū)域也含有保守的IGF-Ⅰ受體識(shí)別序列(PheB23-TyrB24-PheB25殘基)。C結(jié)構(gòu)域和D結(jié)構(gòu)域的保守性相對(duì)較差, 但C結(jié)構(gòu)域在列舉的5種鯉科魚類(表 2)中完全一致。E肽的長(zhǎng)度表明寬鰭鱲IGF-Ⅰ屬Ea-2型。

2.2 IGF-Ⅰ基因外顯子及其編碼氨基酸序列的結(jié)構(gòu)比較

Clustal X與Blast結(jié)果顯示, 寬鰭鱲IGF-Ⅰ氨基酸序列與草魚相似度為98%, 與牙鲆(Paralichthys olivaceus)同源性為67.5%, 與彈涂魚(Boleophthalmus pectinirostris)同源性為64.17%, 與尖吻鱸(Lates calcarifer)同源性為66.49%, 與鯉科其他魚類同源性在90%—98%。

將寬鰭鱲和草魚兩種鯉科魚類的IGF-Ⅰ基因和另外3科的3種魚類進(jìn)行比較, 寬鰭鱲和草魚IGF-Ⅰ基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度均為486 bp, 且4個(gè)外顯子中編碼氨基酸的堿基長(zhǎng)度完全相同, 編碼蛋白由161個(gè)氨基酸組成。鯉科和另外3科的IGF-Ⅰ基因差別主要集中在第三外顯子, 其中彈涂魚科、牙鲆科和尖吻鱸科魚類的第三外顯子比鯉科魚類多69—75個(gè)堿基序列, 導(dǎo)致編碼的氨基酸也有所增加。NJ樹顯示寬鰭鱲與鯉科其他魚類聚為一支, 與鯰形目鮰科親緣關(guān)系較近, 與鱸形目尖吻鱸科親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖 1)。

2.3 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因表達(dá)分析

RT-qPCR檢測(cè)表明,IGF-Ⅰ基因在寬鰭鱲肝、性腺、心、脾、腦和腎組織中均有表達(dá), 肝中的表達(dá)水平顯著高于其他組織(P＜0.05), 其次為脾、精巢、卵巢、腎、心, 腦的表達(dá)水平最低。肝和脾組織IGF-Ⅰ mRNA在寬鰭鱲整個(gè)發(fā)育時(shí)期始終維持較高表達(dá)水平(圖 2)。處于繁殖期的12月齡成魚性腺中IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)量顯著高于5月齡和7月齡幼魚和18月齡的成魚, 且精巢中IGF-Ⅰ mRNA的表達(dá)水平顯著高于卵巢(P＜0.05, 圖 3A)。繁殖期后雌雄性腺中IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)水平快速回落至低水平。而肝組織IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)水平基本不受繁殖期影響(圖 3B)。

寬鰭鱲的個(gè)體生長(zhǎng)存在雌雄差異, 從幼魚期[5月齡, 雌魚(52.144±0.58) mm, (2.51±0.34) g, 雄魚(68.281±0.82) mm, (5.55±0.45) g]到成魚期[12—18月齡, 雌魚(131.352±0.54) mm, (13.76±0.42) g,雄魚(150.235±0.61) mm, (17.41±0.51) g]時(shí), 雄魚個(gè)體均顯著大于雌魚(P<0.05)。這一現(xiàn)象與寬鰭鱲IGF-Ⅰ mRNA在雄魚中表達(dá)水平顯著高于雌魚呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)性。IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)水平與雌雄寬鰭鱲體長(zhǎng)的偏相關(guān)系數(shù)為0.946(P<0.001)。

2.4 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因組織定位

熒光原位雜交顯示, 寬鰭鱲肝臟IGF-Ⅰ基因融合的綠色熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)中, 與細(xì)胞核的藍(lán)色熒光位置分離, 這表明寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因表達(dá)為胞漿陽(yáng)性, 呈全胞質(zhì)性分布, 少數(shù)為核陽(yáng)性, 即藍(lán)色熒光處基本無(wú)綠色熒光信號(hào)重疊(圖 4)。

HE染色顯示處于繁殖期的性成熟寬鰭鱲精巢,各小葉腔中充滿精子(SP), 精核呈藍(lán)紫色, 直徑約1—2 μm。繁殖期后的性成熟寬鰭鱲精巢處于Ⅵ期性腺, 精巢萎縮, 小葉腔內(nèi)精子已基本排空(圖 5A、5C)。繁殖期的卵巢中主要由第Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞組成, 但仍具有一定數(shù)量的第Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞(圖 5E),第Ⅴ時(shí)相卵母細(xì)胞游離于卵巢腔中, 卵膜外的二層卵泡膜(FT)脫落。繁殖期后的卵巢呈萎癟的囊狀,表面血管充血并能看見未產(chǎn)出的卵粒, 其中有的卵粒的卵黃已經(jīng)被吸收。切片顯示, 卵巢中主要由第Ⅱ、Ⅲ時(shí)相卵母細(xì)胞和空濾泡(EF)組成, 少量未排出卵正被吸收、退化(圖 5G)。

表 2 寬鰭鱲與其他魚類IGF-Ⅰ基因外顯子和內(nèi)含子的比較Tab. 2 The comparison of the exon and intron of IGF-Ⅰ gene among Zacco platypus and other fish species

圖 1 基于IGF-Ⅰ氨基酸序列構(gòu)建的寬鰭鱲及其他魚類系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Zacco platypus and other fish based on IGF-Ⅰ amino acid sequence

圖 2 雌雄寬鰭鱲全時(shí)期IGF-Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)水平比較Fig. 2 Relative expression of IGF-Ⅰ gene in male and female Zacco platypus

寬鰭鱲精巢組織中IGF-Ⅰ基因表達(dá)主要集中在精母細(xì)胞(SC), 間質(zhì)細(xì)胞和精子中沒有檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào), 卵巢組織中IGF-Ⅰ基因表達(dá)主要集中在卵泡膜和卵泡液(FF)中(圖 5E、5F), 繁殖期后精巢和卵巢IGF-Ⅰ基因陽(yáng)性信號(hào)減弱(圖 5B、5D), 肝臟胞漿中IGF-Ⅰ基因表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)比性腺更為強(qiáng)烈(圖 4和圖 5), 與RT-qPCR的結(jié)果相符。

3 討論

3.1 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因序列分析

本研究克隆得到的寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因全序列為13707 bp, 包含4個(gè)外顯子, 5個(gè)內(nèi)含子, 其編碼蛋白由161個(gè)氨基酸組成, 與鯉科魚類草魚[9]、翹嘴鲌(Culter alburnus)[10]等同源性在90%—98%。

3.2 寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因在繁殖期前后的表達(dá)

已有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ在肝臟組織的表達(dá)水平最高, 本研究的結(jié)果也佐證了肝臟是魚類IGF-Ⅰ蛋白的主要分泌部位[11—16]。在其他魚類的IGF-Ⅰ基因研究中,IGF-Ⅰ在性腺中表達(dá)水平較其他組織均比較低[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)12月齡恰好經(jīng)歷性成熟[17]的寬鰭鱲性腺中IGF-Ⅰ表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他月齡。為了探究影響IGF-Ⅰ表達(dá)變化的因素,本研究分別在繁殖前期(5月齡和7月齡)、繁殖期(12月齡)、繁殖后(18月齡)不同組織中IGF-Ⅰ表達(dá)水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。結(jié)果顯示處于繁殖期的性成熟寬鰭鱲性腺中IGF-Ⅰ表達(dá)水平顯著上升, 繁殖期過(guò)后回落至最低值。肝組織IGF-Ⅰ的表達(dá)水平隨著月齡增長(zhǎng)的波動(dòng)變化不大, 總體處于較高的水平。

熒光原位雜交和HE切片顯示, 寬鰭鱲肝組織中IGF-Ⅰ基因雜交信號(hào)顯示多為胞漿陽(yáng)性, 呈全胞質(zhì)性分布, 少數(shù)為核陽(yáng)性。在精巢組織中, 精母細(xì)胞存在IGF-Ⅰ基因信號(hào), 卵巢組織中IGF-Ⅰ基因表達(dá)主要集中在卵泡膜和卵泡液中。處于繁殖期的寬鰭鱲性腺處于Ⅴ期, 繁殖期后的性腺有明顯的萎縮現(xiàn)象, 為Ⅵ期。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)魚類IGF-Ⅰ基因能調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的增殖活性及其分化[13]并促進(jìn)精子發(fā)生[18—20], 調(diào)節(jié)類固醇的新陳代謝, 產(chǎn)生或活化生殖相關(guān)激素[21,22]。

3.3 魚類生長(zhǎng)激素(GH)與性激素的協(xié)同作用

圖 3 IGF-Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression level of IGF-Ⅰ gene

IGF-Ⅰ主要來(lái)源于肝臟, 其合成依賴于垂體GH的分泌和營(yíng)養(yǎng)狀況。GH是腦垂體前葉分泌的單一肽鏈蛋白質(zhì)激素, 具有廣泛的生理功能, 能影響幾乎所有類型的組織和細(xì)胞。GH的大部分生物效應(yīng)都是由肝臟、腎臟等組織依賴GH產(chǎn)生的IGF-Ⅰ所介導(dǎo)的。此外, 許多肝外組織IGF-Ⅰ的合成也受GH和其他組織特異性激素及營(yíng)養(yǎng)因子的影響。GH、IGF-Ⅰ等基因組成的GH/IGF軸在魚類個(gè)體生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵的作用[23]。

有研究表明IGF-Ⅰ基因表達(dá)水平與GH和性激素濃度之間存在高度相關(guān)性[24]。馬蘇大馬哈魚(Chum salmon)[25]在洄游時(shí)血液中的IGF-Ⅰ的含量呈上升趨勢(shì), 此時(shí)它同腦垂體性腺機(jī)制協(xié)同作用,促進(jìn)了性腺的成熟, 從而促使其洄游到淡水中產(chǎn)卵,隨后, 血液中的IGF-Ⅰ含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)直到下一次洄游周期的開始。條紋鱸(Morone chrysops×Morone saxatile)[26]的性腺在每年的3月成熟, 同時(shí)血液中雌性激素和雄性激素達(dá)到一年中最高水平,GH和IGF-Ⅰ具有同樣的變化。

3.4 寬鰭鱲性二態(tài)現(xiàn)象

雄性寬鰭鱲由于在繁殖期具有鮮艷的體色而被作為一種觀賞魚。性成熟的雄性個(gè)體臀鰭鰭條尤為發(fā)達(dá); 尾鰭叉形, 下葉稍長(zhǎng); 體色鮮艷, 背部灰黑, 腹部銀白, 體側(cè)有10—13條藍(lán)色的垂直條紋。處于繁殖期的雄性個(gè)體吻部、鰓蓋骨、臀鰭鰭條上會(huì)出現(xiàn)錐狀珠星[27]。因此, 寬鰭鱲繁殖期性腺組織中IGF-Ⅰ基因增量表達(dá), 可能有調(diào)節(jié)生殖相關(guān)激素分泌和促進(jìn)雄性體色和珠星等第二性征顯現(xiàn)的作用, 以達(dá)到完成生殖行為, 適應(yīng)種群繁衍的需要。

結(jié)合所測(cè)量形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù), 我們推測(cè)雄性寬鰭鱲性腺中IGF-Ⅰ在其發(fā)育過(guò)程中的高表達(dá)是雄性成體大于雌性成體的原因之一。同屬溪流性魚類的馬口魚也存在雄性成體大于雌性成體的性二態(tài)現(xiàn)象[28], 造成這種現(xiàn)象的原因可能是溪流性魚類所屬棲息環(huán)境的特殊性。雄大于雌有利于雄性在湍急的水流中追逐配偶, 提高受精和繁殖的成功率關(guān),較大的雄性魚存在明顯的爭(zhēng)斗優(yōu)勢(shì), 因而獲得較多的繁殖后代的機(jī)會(huì)及提供給后代較好的保護(hù)[29—31]。

圖 4 寬鰭鱲肝臟IGF-Ⅰ基因熒光原位雜交及DAPI核染色Fig. 4 Distribution of Zacco platypus IGF-Ⅰ gene in liver tissue and nuclear DAPI stain

圖 5 寬鰭鱲性腺繁殖期前后對(duì)比Fig. 5 Comparison of Zacco platypus gonad before and after breeding

4 結(jié)論

綜上所述, 本研究克隆了寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因全序列, 發(fā)現(xiàn)其在肝臟中高表達(dá), 同時(shí)發(fā)現(xiàn)繁殖期性腺中IGF-Ⅰ基因的高表達(dá)現(xiàn)象。熒光原位雜交技術(shù)定位顯示IGF-Ⅰ基因在肝組織中呈全胞質(zhì)性分布, 在性腺組織的精母細(xì)胞、卵泡膜及卵泡液中陽(yáng)性表達(dá)。寬鰭鱲IGF-Ⅰ基因表達(dá)模式具有性別差異性, 推測(cè)精巢中IGF-Ⅰ在繁殖期的高表達(dá)是寬鰭鱲雄性成體大于雌性成體的原因之一, 為寬鰭鱲的性二態(tài)和人工繁育的研究提供參考資料。