劉 林 何 麗 吳富盛 阮記明 周 穎 隗黎麗

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 南昌 330045)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)承擔(dān)著蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)。在蛋白質(zhì)折疊過程中, 由于各種原因(DNA損傷、化學(xué)誘導(dǎo)和病毒感染等)使得未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白增多[1], 未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)可通過調(diào)整內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白的數(shù)量和加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力, 減少未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的進(jìn)一步產(chǎn)生, 從而減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使細(xì)胞存活[2,3]。其中, 需肌醇酶1(Inositol-requiring enzyme 1,IRE1)是參與UPR的重要分子。當(dāng)未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累時,IRE1可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)特定基因和蛋白的表達(dá)[4]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力過于嚴(yán)重不能被有效清除時,IRE1可引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子紊亂并誘導(dǎo)凋亡相關(guān)信號分子的表達(dá)[5,6], 同時,IRE1自身也能降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤蛋白, 從而釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力[7]。在20世紀(jì)90年代, 哺乳動物的IRE1基因cDNA序列已相繼被克隆[8—10], 而水產(chǎn)動物中IRE1基因的研究較晚, 近幾年才在黃顙魚(Pel-teobagrus fulvidraco)[11]和南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)[12]中克隆并進(jìn)行研究。

草魚(Ctenopharyngodon idella)作為我國四大家魚之一, 養(yǎng)殖面積非常大。近年來, 隨著養(yǎng)殖環(huán)境的惡化, 草魚養(yǎng)殖水體易暴發(fā)藍(lán)藻水華產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物微囊藻毒素(Microcystins, MCs), 微囊藻毒素-LR(Microcysitin-LR, MC-LR)作為MCs家族中的一員, 具有非常強(qiáng)的肝毒性[13]。有報道表明MC-LR可激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路, 活化核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素-α (IFN-α)的表達(dá)而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤[14]。在對MC-LR處理后的草魚肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析的基礎(chǔ)上[15], 篩選得到了草魚IRE1-like基因的EST序列。本研究根據(jù)EST序列進(jìn)一步克隆出草魚IRE1-like基因cDNA全長序列, 分析了基因結(jié)構(gòu)、在不同組織中的表達(dá)模式及不同劑量MC-LR誘導(dǎo)草魚不同時間后的表達(dá)變化, 為進(jìn)一步深入了解IRE1基因在魚類響應(yīng)MC-LR中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚的處理

本實(shí)驗(yàn)所用的草魚(22.13±2.17) g購于江西省南昌神龍漁業(yè)公司, 在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)兩周后, 隨機(jī)取3尾魚用于草魚IRE1-like基因組成型表達(dá)的分析,測定的組織包括頭腎、腎、皮膚、腸、心臟、鰓、脾臟、肌肉及肝臟。隨后, 將剩余的草魚隨機(jī)分組進(jìn)行MC-LR染毒試驗(yàn), 包括對照組和實(shí)驗(yàn)組,每個組設(shè)置三個重復(fù)組。試驗(yàn)前, MC-LR(純度≥95%)粉末用甲醇溶解成1 μg/μL的母液保存于–20℃, 使用前用0.8%生理鹽水稀釋成25 μg MCLR/kg體重(25 μg MC-LR/kg body weight, 25 μg MC-LR/kg BW)和100 μg MC-LR/kg BW兩個劑量。實(shí)驗(yàn)組草魚經(jīng)腹腔注射染毒, 注射量為0.1 mL/尾; 對照組每尾草魚經(jīng)腹腔注射等量的0.8%的生理鹽水。在注射MC-LR 24h和96h后, 分別從實(shí)驗(yàn)組和對照組中各取6尾魚分離肝臟, 置于液氮中保存。為避免應(yīng)激反應(yīng), 在注射以及取樣時, 所有魚均用100 μg/mL的間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)進(jìn)行麻醉。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

MS-222為Sigma公司產(chǎn)品, RNA提取試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品, 檢測表達(dá)分析的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit以及熒光定量PCR的SYBR Green Real-time PCR Master Mix均為Promega公司產(chǎn)品, 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠純化回收試劑盒、Taq酶及Maker等購自TaKaRa公司。其他試劑如氯仿、無水乙醇和異丙醇等為中國國藥分析純產(chǎn)品。

1.3 核酸的提取及cDNA的合成

取出保存在液氮中的樣品, 采用Trizol試劑盒提取總RNA, 具體提取方法參考試劑盒的說明書進(jìn)行。用于檢測不同組織表達(dá)以及MC-LR誘導(dǎo)表達(dá)的第一鏈cDNA用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成, 用于RACE擴(kuò)增的cDNA按照Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit操作手冊的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 分別合成3′RACE-Ready cDNA和5′ RACE-Ready cDNA。

1.4 草魚IRE1-like基因cDNA全長的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲得的草魚IRE1-like序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物如表 1, 由上海生工生物工程股份有限公司合成, 以草魚肝臟cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 并對所獲得片段進(jìn)行膠回收和測序,比對分析確定獲得的序列為草魚IRE1-like基因中間序列。再根據(jù)這一序列設(shè)計(jì)上游和下游的特異性嵌套引物(表 1), 按照SMARTTMcDNA Amplification Kit (Clontech)說明書推薦的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行3′ RACE和5′RACE擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序及條件等參照實(shí)驗(yàn)室發(fā)表文獻(xiàn)設(shè)置[16], 分別獲得3′-和5′-末端序列, 再與中間序列拼接得到全長cDNA序列。

表 1 本文所用引物序列Tab. 1 Primers used in the study

1.5 草魚IRE1-like基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用生物信息學(xué)在線工具對草魚IRE1-like基因進(jìn)行分析, 所用分析在線軟件及其網(wǎng)址見表 2。系統(tǒng)發(fā)育樹則采用Mega7.0軟件中的NJ法進(jìn)行構(gòu)建, 在建樹前氨基酸序列的比對用ClustalW1.81軟件分析。

1.6 草魚IRE1-like基因組織分布特征分析

根據(jù)獲得的草魚IRE1-like基因設(shè)計(jì)熒光定量引物IRE1-like-QF/R (表 1), 用于檢測草魚IRE1-like基因的組織分布。按照前述選擇的3尾草魚, 取頭腎、腎、皮膚、腸、心臟、鰓、脾臟、肌肉及肝臟提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板, 使用Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)方法檢測草魚IRE1-like基因的表達(dá)水平。qRT-PCR采用CFX96 Touch?Real-Time PCR Detection System, 20 μL反應(yīng)體系包括: 10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix,5.0 μL cDNA模板(50倍稀釋的cDNA), 上下游引物各0.5 μL (20 μmol/L)和4.0 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃變性5min; 95℃ 10s, 58℃ 15s, 72℃ 20s,40個循環(huán)后, 72℃延伸5min。以草魚β-actin基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正, 采用2–ΔΔCt法計(jì)算IRE1-like基因的相對表達(dá)量。

表 2 生物信息學(xué)分析所用軟件及網(wǎng)址Tab. 2 Software and websites used for bioinformatics analysis

1.7 微囊藻毒素-LR誘導(dǎo)草魚IRE1-like基因的表達(dá)分析

分別提取25和100 μg/kg BW 劑量MC-LR誘導(dǎo)草魚24h和96h后的RNA樣品, 按前述方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行qRT-PCR, 檢測MC-LR誘導(dǎo)草魚肝臟IRE1-like基因在不同時間點(diǎn)的表達(dá)情況。反應(yīng)體系、反應(yīng)程序及數(shù)據(jù)分析如1.6所述。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 其中, 草魚IRE1-like基因在不同組織中的相對表達(dá)量采用One-way ANOVA (SPSS 16.0)分析, MC-LR對草魚IRE1-like基因表達(dá)的影響采用多因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(SPSS 16.0), 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平設(shè)定P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 草魚IRE1-like基因全長cDNA序列特征分析

根據(jù)草魚轉(zhuǎn)錄組測序得到一段長約3000 bpIRE1-like基因的序列, 設(shè)計(jì)引物對該段序列進(jìn)行驗(yàn)證并在NCBI上進(jìn)行BLAST分析, 進(jìn)一步確定為草魚IRE1-like基因cDNA的中間序列, 隨后通過RACE法擴(kuò)增草魚IRE1-like基因的5′和3′末端序列,分別獲得了長度為309和549 bp大小的產(chǎn)物。經(jīng)序列拼接獲得草魚IRE1-like基因cDNA全長序列, 其在NCBI的GenBank登錄號為MG797683。草魚IRE1-like基因全長3595 bp, 包括5′非編碼區(qū)和3′非編碼區(qū), 分別為111和391 bp, 開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)為3093 bp。對其編碼氨基酸序列預(yù)測分析, 發(fā)現(xiàn)草魚IRE1-like編碼1030個氨基酸, 分子量為116.24 kD, 理論等電點(diǎn)為6.26。采用SignalP4.1在線分析表明草魚IRE1-like蛋白存在信號肽, 最可能的切割位點(diǎn)在17和18氨基酸殘基(ITA-II)之間。采用Phyer2跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)草魚IRE1-like蛋白在第755和第770之間的氨基酸存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。在InterPro上分析序列發(fā)現(xiàn), 草魚IRE1-like蛋白包含三個超家族, 分別為WD40/YVTN repeat-like-containing domain superfamily (9—314 aa)、Quinoprotein alcohol dehydrogenase-like superfamily (26—236 aa)、Protein kinase-like domain superfamily (572—854 aa)和KEN domain superfamily(836—976 aa), 此外, 還發(fā)現(xiàn)草魚IRE1-like蛋白有5個Pyrrolo-quinoline quinone beta-propeller重復(fù)結(jié)構(gòu)(34—66、117—149、155—187、199—230和286—317 aa)。在NCBI數(shù)據(jù)庫中, 草魚IRE1-like蛋白序列同源搜索的結(jié)果顯示, 39—307、569—834、837—915的氨基酸殘基位置上分別存在管腔結(jié)構(gòu)域(Luminal)、絲/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域(STKc)及核糖核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域(RNase)三個保守結(jié)構(gòu)域。通過NetOGlyc4.0分析(分值大于0.5的預(yù)測為糖基化位點(diǎn)), 發(fā)現(xiàn)草魚IRE1-like蛋白存在共56個糖基化位點(diǎn), 35個為絲氨酸殘基, 21是蘇氨酸殘基; 利用NetPhos 3.1對草魚IRE1-like蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測分析, 發(fā)現(xiàn)120個磷酸化位點(diǎn), 其中絲氨酸殘基72個, 蘇氨酸殘基42個, 酪氨酸殘基6個。

2.2 草魚IRE1-like氨基酸同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

草魚IRE1-like氨基酸與斑馬魚(Danio rerio)IRE1-α、金線鲃(Sinocyclocheilus grahami) IRE1-like和鯽(Carassius auratus) IRE1-like的相似性和一致性非常高, 分別達(dá)到了95%—90%和97%—92%,與其他物種的相似性和一致性分別為86%—74%和91%—83%, 而與人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)IRE1-β的相似性則較低, 僅為48%—49%。應(yīng)用MEGA7.0軟件Neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明人和小鼠的IRE1-β單獨(dú)聚為一支,人和小鼠以及爬行類和鳥類的IRE1聚為一支, 魚類的IRE1及IRE1-like聚為一支, 其中草魚IRE1-like與斑馬魚的IRE1-α親緣關(guān)系最近(圖 1)。

2.3 草魚IRE1-like基因組織分布特征分析

對草魚頭腎、腎、皮膚、腸、心臟、鰓、脾臟、肌肉及肝臟9種組織中草魚IRE1-like基因的表達(dá)進(jìn)行了qRT-PCR研究, 發(fā)現(xiàn)草魚IRE1-like基因在所有檢測的組織中均有表達(dá), 其中在肝臟中的表達(dá)量最為豐富, 其次為肌肉、脾臟、鰓和心臟等, 在頭腎中表達(dá)量相對較低(圖 2)。以相對表達(dá)量最低的頭腎作為參照進(jìn)行One-way ANOVA分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝臟、肌肉、脾臟、鰓、心臟及腸道中草魚IRE1-like的表達(dá)量顯著高于頭腎中的表達(dá)量(P<0.05)。

2.4 微囊藻毒素-LR對草魚肝臟IRE1-like基因水平的影響

圖 1 草魚及其他脊椎動物IRE1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of IRE1 of grass carp and other species

圖 2 草魚IRE1-like基因的組織特異性表達(dá)分析Fig. 2 Tissue-specific expression of IRE1-like in grass carp

如圖 3所示, 在25 μg/kg BW MC-LR誘導(dǎo)后, 草魚肝臟IRE1-like基因相對表達(dá)量在24h后顯著升高(P<0.05), 而在96h表達(dá)上調(diào)但與對照組差異不顯著(P>0.05); 100 μg/kg BW MC-LR誘導(dǎo)草魚24h后,IRE1-like基因相對表達(dá)量升高(P>0.05), 而隨著時間的延長, 草魚肝臟中IRE1-like的表達(dá)量較對照組顯著上升(P<0.05)。

3 討論

3.1 IRE1-like基因cDNA全長的克隆及生物信息學(xué)分析

本研究克隆了草魚IRE1-like基因的cDNA全長序列, 編碼區(qū)為3093 bp, 共編碼1030個氨基酸, 含有Luminal、STKc和RNase三個保守結(jié)構(gòu)域, 這與黃顙魚[11]IRE1和團(tuán)頭魴[12]IRE1的結(jié)構(gòu)域相同。在之前對人類和哺乳動物的研究發(fā)現(xiàn),IRE1是雙官能團(tuán)單跨膜蛋白, 包括Luminal、STKc及核糖核酸內(nèi)切酶區(qū)RNase, 每個區(qū)域都有重要作用。其中, Luminal結(jié)構(gòu)域的低聚化被認(rèn)為是啟動信號在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上傳播的關(guān)鍵事件, 它可以使IRE1的胞質(zhì)激酶和RNase模塊協(xié)同組裝成一個有序的具有明確三維結(jié)構(gòu)的低聚體[17]。在Ali等[18]的研究中發(fā)現(xiàn), IRE1-like蛋白通過其N端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Luminal結(jié)構(gòu)域的聯(lián)合激活, 促進(jìn)其胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的自磷酸化, 從而激活C端的核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域可剪接Xbp1 mRNA, 生成一個活躍的Xbp1s轉(zhuǎn)錄激活因子。而STKc和RNase結(jié)構(gòu)域是哺乳動物IRE1蛋白的主要效應(yīng)區(qū), 蛋白激酶活性結(jié)構(gòu)域自身磷酸化, 將核糖核酸酶活性結(jié)構(gòu)域激活并發(fā)揮其生理功能[8,19,20]。草魚IRE1-like蛋白的三個保守結(jié)構(gòu)域是否涉及這些生理功能有待研究。

圖 3 MC-LR對草魚肝臟IRE1-like 基因表達(dá)的影響Fig. 3 The effects of MC-LR on the expression of IRE1-like in liver of grass carp (P <0.05)

通過氨基酸同源性比對分析, 草魚IRE1-like 氨基酸序列與已報道的物種的氨基酸具有較高的相似性和一致性, 其中與斑馬魚IRE1-α的相似性非常高, 達(dá)到了95%。而與人和小鼠IRE1-β的相似性較低, 且進(jìn)化樹分析顯示草魚IRE1-like與IRE1-β也沒有聚為一支。已有的研究表明, 人和哺乳動物IRE1包括兩種類型, 即IRE1-α和IRE1-β[8,9], 但在魚類中沒有IRE1-β的相關(guān)報道, 本研究的結(jié)果也表明草魚IRE1-like不屬于IRE1-β類型。因此, 從草魚IRE1-like蛋白序列等分析來看, 草魚IRE1-like與哺乳動物和其他魚類的IRE1-α或IRE1-like類似, 這預(yù)示著IRE1-like在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮著同樣重要的作用。

3.2 IRE1-like基因在草魚不同組織中的表達(dá)分析

研究表明,IRE1-α基因在人體內(nèi)廣泛表達(dá), 而IRE1-β基因主要在胃、腸道和呼吸道上皮細(xì)胞中表達(dá)[2]。在水產(chǎn)動物中,IRE1基因的組織分布表達(dá)研究較少, 僅在黃顙魚和南美白對蝦中有報道[11,12]。IRE1-α基因在黃顙魚廣泛表達(dá), 其中在肝臟中表達(dá)最高, 其次為心臟、脾臟、中腸、腦、頭腎和精巢,在骨骼肌和鰓中的表達(dá)最低[11]。南美白對蝦中IRE1基因在所檢測的組織(鰓、胃、心臟、血液、表皮、腸道、幽門盲囊、肌肉、神經(jīng)、肝胰腺和眼柄)中也呈現(xiàn)組成型表達(dá), 其中在血液中表達(dá)最高[12]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)草魚IRE1-like基因也可在所檢測的不同組織中表達(dá), 其中肝臟中的表達(dá)量相對最高, 這與IRE1-α基因在黃顙魚中的表達(dá)比較相似[11]。研究基因的組織分布表達(dá)模式有助于了解該基因的生理功能,IRE1基因在水產(chǎn)動物各組織中的廣泛表達(dá)說明它在水產(chǎn)動物中具有非常重要的作用, 可在不同組織中參與各種生理功能。

3.3 不同劑量MC-LR對草魚肝臟IRE1-like基因的影響

IRE1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的感受蛋白, 被認(rèn)為在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起著非常重要的作用[11], 已有研究報道表明MC-LR可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[22—24], 而過度或長時間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會激活I(lǐng)RE1, 進(jìn)而激活JNK,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25]。UPR的激活可降低蛋白質(zhì)的翻譯, 從而增加蛋白質(zhì)的折疊能力, 然而如果這種初始反應(yīng)不能緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激, 則UPR信號網(wǎng)絡(luò)的長期激活會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[26]。本研究檢測了不同劑量MC-LR誘導(dǎo)后草魚肝臟中IRE1-like基因的表達(dá),在25 μg/kg BW組誘導(dǎo)24h后, 表達(dá)顯著升高, 而100 μg/kg BW劑量組草魚IRE1-like基因的表達(dá)在誘導(dǎo)96h后顯著升高。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)已發(fā)表的文獻(xiàn)可知草魚注射25和100 μg/kg BW MC-LR 24h和96 h后均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 尤其在100 μg/kg BW MCLR組中草魚肝細(xì)胞凋亡更嚴(yán)重[16], 因此, 我們推測MC-LR可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激, 隨后激活了草魚IRE1-like基因并進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡。盡管25 μg/kg BW組草魚肝臟IRE1-like基因在96h的表達(dá)相對于對照組表達(dá)升高了但差異不顯著, 并呈現(xiàn)下降趨勢,這可能與25 μg/kg BW MC-LR的劑量較低, 不會對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生持續(xù)的應(yīng)激有關(guān), 也可能與IRE1自身能降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤蛋白, 從而釋放內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)荷有關(guān)[7], 具體原因還有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述, 本研究通過RACE技術(shù)克隆得到了草魚IRE1-like基因cDNA的全長序列, 并對其編碼的1030個氨基酸進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析, 研究了草魚IRE1-like基因的組織表達(dá)分布模式及草魚肝臟中IRE1-like基因?qū)Σ煌瑒┝縈C-LR的響應(yīng),發(fā)現(xiàn)IRE1-like基因在不同組織的表達(dá)為組成型表達(dá), 另外, MC-LR可促進(jìn)草魚肝臟中IRE1-like基因表達(dá)上調(diào)。后續(xù)有望通過RNAi等方法對草魚IRE1-like基因的生物學(xué)功能包括在響應(yīng)MC-LR中所起的作用進(jìn)行更加深入的探索。