陳祺昌 鄭志琴 劉 丹 王發(fā)艷 晁 燕 章 昭 祁得林

(1. 青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室, 西寧 810016; 2. 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院, 西寧 810016;3. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)系, 西寧 810016)

血紅蛋白(Hemoglobin, Hb)占脊椎動物紅細(xì)胞胞漿總蛋白的98%以上, 是機體內(nèi)運輸氧的特殊蛋白[1]。在大多數(shù)脊椎動物中, 血紅蛋白是由2條α-珠蛋白鏈和2條β-珠蛋白鏈組成的異源四聚體(α2β2),每條多肽鏈均與在氧氣傳輸中起直接作用的血紅素基團(tuán)配位。研究表明, 脊椎動物擁有多個珠蛋白編碼基因, 在個體發(fā)育的不同階段所表達(dá)的珠蛋白編碼基因有所不同[1—3]。

在人類(Homo sapiens)基因組中, 胚胎型(Embryonic)、胎兒型(Fetal)和成年型(Adult)珠蛋白多肽鏈由兩大類基因簇(Gene cluster)指導(dǎo)合成[1,3,4]:一類是位于16號染色體的α珠蛋白基因簇, 編碼胚胎型HBZ、成年型HBA1和HBA2珠蛋白多肽鏈; 另一類是位于11號染色體的β珠蛋白基因簇, 編碼胚胎型HBE1、HBG2和HBG1, 成年型HBD和HBB珠蛋白多肽鏈。在斑馬魚(Danio rerio)基因組中, 胚胎型(Embryonic)、仔魚型(Larval)和成年型(Adult)珠蛋白編碼基因分屬主要(Major globin cluster)和次要珠蛋白(Minor globin cluster)兩大類基因簇, 主要珠蛋白基因簇位于3號染色體, 而次要珠蛋白基因簇位于12號染色體[2,5]。3號染色體的主要基因簇編碼7個珠蛋白多肽鏈, 其中成年型成對珠蛋白基因hbba1/hbaa1和hbba2/hbaa2以頭對頭(3′-5′—5′-3′)的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起共享相同的啟動子和增強子[5—7], 或以尾對尾(5′-3′—3′-5′)的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起分別擁有獨立的啟動子[2], 同時在主要基因簇中還包括一個位點控制域LCR; 胚胎/仔魚型成對珠蛋白基因hbbe1/hbae1以頭對頭的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起共享相同的啟動子和增強子[5]。12號染色體的次要基因簇編碼4個珠蛋白多肽鏈, 均為胚胎/仔魚型, 其中成對珠蛋白基因hbbe2/hbae5以頭對頭的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起, 而hbbe3/hbae4以尾對尾的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起[3]。

隨著個體發(fā)育血紅蛋白的珠蛋白多肽鏈組成會發(fā)生截然不同的變化, 這種特定階段表達(dá)特殊血紅蛋白的現(xiàn)象稱為血紅蛋白的時序轉(zhuǎn)換(Hemoglobin switching)[1—4,8]。血紅蛋白的時序轉(zhuǎn)換表達(dá)是脊椎動物的一個相對保守的過程, 脊椎動物血紅蛋白多肽鏈組分的改變是對機體發(fā)育過程中需氧量變化的響應(yīng)[3,5,8,9]。在人類個體發(fā)生的初始階段, 胚胎型血紅蛋白(HbE)由2條ε-珠蛋白鏈和2條ζ-珠蛋白鏈組成(ε2ζ2), 主要在卵黃囊中的紅系祖細(xì)胞(Red blood cell progenitors)和幼紅細(xì)胞(Erythroblast)中合成[1,3,9,10], 隨后珠蛋白基因簇上的基因表達(dá)發(fā)生兩次重要的轉(zhuǎn)換。第一次由胚胎型到胎兒型的血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受孕后12周, 其顯著特征是胚胎型血紅蛋白HbE的合成急劇下調(diào), 直至由胎兒型血紅蛋白HbF(α2γ2)所取代[3,11]; 第二次由胎兒型到成年型的血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在胎兒出生后6周左右, 其特征是γ-珠蛋白基因表達(dá)下調(diào)并由成年型血紅蛋白HbA(α2β2)所取代[12,13]。斑馬魚在其胚胎發(fā)育過程中, 血紅蛋白也經(jīng)歷了兩次重要的時序轉(zhuǎn)換表達(dá)。第一次由胚胎型到仔魚型血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受精后24—36h, 其顯著特征是hbbe3珠蛋白表達(dá)急劇下降而hbbe2珠蛋白開始表達(dá), 仔魚期hbbe2珠蛋白表達(dá)顯著上升并伴隨hbbe5珠蛋白的表達(dá); 第二次由胚胎/仔魚型到成年型的血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受精后22d, 其顯著特征是胚胎型珠蛋白hbbe1/hbbe3和仔魚型珠蛋白hbbe2表達(dá)持續(xù)下降, 而成年型主要珠蛋白hbaa2和hbba1開始表達(dá), 直到受精后32d完全建立成年型血紅蛋白體系[3]。

魚類作為連接著脊椎動物和無脊椎動物的典型代表, 在進(jìn)化史中占有重要地位。但是, 以往有關(guān)于魚類胚胎型血紅蛋白的研究主要圍繞模式動物斑馬魚展開。截至目前, 還未見有關(guān)裂腹魚亞科魚類胚胎型血紅蛋白的研究報道。因此, 本文以黃河裸裂尻魚(Schizopygopsis pylzovi)為研究對象, 開展胚胎型血紅蛋白組成、基因結(jié)構(gòu)及其發(fā)育早期的表達(dá)研究, 為深入探討魚類血紅蛋白的時序轉(zhuǎn)換表達(dá)和環(huán)境適應(yīng)機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗中黃河裸裂尻魚及其不同發(fā)育時段胚胎皆采自于青海省循化縣蘇只黃河魚類增殖站, 實驗用黃河裸裂尻魚為人工繁殖個體, 平均體重300 g,體長20—25 cm。

1.2 實驗試劑與儀器

基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司?？俁NA提取試劑(RNAiso Plus), 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR?Premix ExTaqⅡTM等購自TaKaRa生物(大連)有限公司; 整胚原位雜交用主要試劑DIG-Nick-Translation-Mix、NTP-DIG-RNA labeling Polymerase SP6 and T7均購自Roch; 熒光定量PCR儀(Roch LightCycler480Ⅱ)、微量核酸蛋白測定儀(Implen NP80 Mobile)、體式顯微鏡(尼康SMZ18)。

1.3 黃河裸裂尻魚胚胎樣品及組織樣品

在黃河裸裂尻魚人工繁殖過程中, 首先對親魚進(jìn)行稱重, 根據(jù)其體重提前1周注射促黃體素釋放激素(LHRH-A2); 然后雌雄魚分開養(yǎng)殖1周左右以促進(jìn)其性成熟, 按照雌雄比為3﹕1進(jìn)行人工受精。受精后脫粘、清除死卵, 0.5h后將受精卵轉(zhuǎn)移至孵化器進(jìn)行孵化, 受精卵孵化溫度為(13.5±0.5)℃。

采集受精后2 hpf (hours post fertilization, hpf)、4 hpf、6 hpf、8 hpf、10 hpf、12 hpf、18 hpf、24 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf、120 hpf、144 hpf、168 hpf、192 hpf、216 hpf的受精卵, 以及破膜后4h、8h、12h、18h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d(即220 hpf、224 hpf、228 hpf、234 hpf、240 hpf、264 hpf、288 hpf、312 hpf、336 hpf、360 hpf、384 hpf、408 hpf、432 hpf)的胚胎各兩份。用4%的多聚甲醛處理固定其中一份, 備用于原位雜交; 另一份液氮保存?zhèn)溆?。另? 成體黃河裸裂尻魚麻醉后, 采集腎臟組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 胚胎型血紅蛋白基因CDS序列獲取

以NCBI中已公布的斑馬魚胚胎型α珠蛋白基因(hbae1、hbae3、hbae4和hbae5)和β珠蛋白基因(hbbe1、hbbe2和hbbe3)CDS序列為搜索條件(Queries), 通過NCBI-Blast-2.2.28 +軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blastn命令搜索實驗室前期構(gòu)建的黃河裸裂尻魚轉(zhuǎn)錄組本地數(shù)據(jù)庫, 獲取黃河裸裂尻魚相應(yīng)的胚胎型血紅蛋白基因CDS序列。為了提高搜索的嚴(yán)格性和準(zhǔn)確性, 在Blastn搜索中將E值設(shè)置為≤0.001。

1.5 內(nèi)含子確定及擴(kuò)增

根據(jù)已獲得的胚胎型α和β珠蛋白基因序列與斑馬魚基因組序列比對, 初步確定黃河裸裂尻魚血紅蛋白基因內(nèi)含子和外顯子組成。然后在第1外顯子和第3外顯子區(qū)域分別設(shè)計各基因的內(nèi)含子擴(kuò)增引物(表 1), 以黃河裸裂尻魚腎組織基因組DNA為模板克隆內(nèi)含子序列。PCR擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性3min; 95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸1min,循環(huán)35 次; 72℃續(xù)延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后, 進(jìn)行回收純化, 然后連接轉(zhuǎn)化以進(jìn)行測序。

1.6 胚胎型血紅蛋白基因串聯(lián)方式及間隔序列確定

參照斑馬魚基因組序列中hbbe1/hbae1和hbbe3/hbae4“頭對頭”或“尾對尾”的串聯(lián)特點, 在黃河裸裂尻魚成對基因近端外顯子序列設(shè)計組合引物, 以基因組DNA 為模板, PCR擴(kuò)增和測序間隔序列, PCR擴(kuò)增程序和測序方法同上。獲得序列經(jīng)Blast比對驗證, 最終確定黃河裸裂尻魚胚胎型α和β珠蛋白基因的串聯(lián)方式(表 1)。

1.7 胚胎型血紅蛋白基因生物信息學(xué)分析

利用Lasergene7.0軟件, 對基因序列進(jìn)行閱讀框分析及氨基酸序列推定; Blastx程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行蛋白相似性搜索; 利用DNA MAN 6.0進(jìn)行氨基酸序列同源性的比較, 利用利用MEGA6.0軟件構(gòu)建鄰接(Neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.8 RNA探針制備及整胚原位雜交

通過對已獲得的4個胚胎型血紅蛋白基因序列設(shè)計特異性探針引物(表 1), 并對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增, 將目的片段插入pGEM-T Easy 載體, 陽性克隆送生工生物測序。測序完成后, 堿裂解法提取質(zhì)粒,提取的質(zhì)?？偤恳_保達(dá)到10 μg。對測序結(jié)果進(jìn)行比對, 根據(jù)比對結(jié)果中正向引物的連接方向選擇相應(yīng)的內(nèi)切酶(單酶切)。若正向引物在T7端, 則用SacⅡ進(jìn)行酶切; 若正向引物在SP6端, 則用SpeⅠ進(jìn)行酶切。DNA preparation反應(yīng)體系如下:質(zhì)粒DNA10 μg、10×Buffer Trager(add BSA)10 μL、Enzyme(SpeⅠ orSacⅡ)5 μL, 最后用RNase-free H2O 補充至100 μL。37℃孵育2h, 酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后測定濃度以用于RNA探針制備。RNA 探針合成: Digested DNA 1 μg, 10×Transcription buffer 2, NTP-DIG-RNA labeling 2 μL,RNase inhibitor 1 μL, Polymerase SP6 or T7 2 μL,ddH2O 10.5 μL。離心5—10s, 封口膜封口37℃水浴3h之后, 加入2 μL DNaseⅠ(RNase-free), 混勻后37℃孵育15min。加入5 μL 4 mol/L LiCl (RNasefree)和37 μL 100%的無水乙醇(RNase-free), –20℃沉淀過夜。4℃, 12000 r/min, 離心30min, 棄上清。加入70%的乙醇(RNase-free)1 mL洗滌沉淀, 來回顛倒EP 管使沉淀懸浮, 4℃, 12000 r/min, 離心10min,風(fēng)干沉淀。用50 μL提前預(yù)熱至55℃的DEPC H2O溶解沉淀,即為標(biāo)記好的RNA探針, 紫外分光光度計測定濃度, 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA探針的質(zhì)量, 分裝并于–80℃保存。

整胚原位雜交步驟詳見文獻(xiàn)[15, 16], 采用顯色液(NBT/BCIP、10×Staining buffer)進(jìn)行染色, 顯色完成后, 終止液(25% tween-20、0.5 mol/L EDTA、pH 5.5 PBS)和PBST各洗滌3次終止染色, 然后用70%甘油進(jìn)行透化置于體式顯微鏡下觀察拍照。

表 1 引物序列Tab. 1 Primer information in this study

1.9 Real-time PCR法檢測胚胎期的相對表達(dá)量

用Trizol研磨法提取不同發(fā)育階段的黃河裸裂尻魚胚胎總RNA, 用DNase Ⅰ(RNase-free)酶解可能殘余的基因組DNA, 用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取RNA的完整性, 紫外分光光度法測定RNA樣品的濃度和純度。以不同發(fā)育階段的胚胎總RNA為模板, 利用 PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time)合成第一鏈模板cDNA, 根據(jù)各基因內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)特征, 通過已獲得cDNA序列跨第一內(nèi)含子設(shè)計特異性引物, 并進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)體系10 μL: TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL, 上下游引物(10 μmol/μL)各0.3 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3.4 μL。胚胎型血紅蛋白基因qRT-PCR反應(yīng)條件均為: 95℃ 30s; 60℃ 30s; 72℃1min。β-actin基因qRT-PCR反應(yīng)條件為: 95℃ 30s;60℃ 30s; 72℃ 1min。實驗結(jié)果采用2–??Ct法分析[17],引物見表 1。

2 結(jié)果

2.1 黃河裸裂尻魚胚胎型血紅蛋白基因CDS序列特點

通過本地數(shù)據(jù)庫搜索, 共鑒定到黃河裸裂尻4個胚胎型血紅蛋白基因, 分別為2個α珠蛋白基因(hbae1和hbae4)和2個β珠蛋白基因(hbbe1和hbbe3)。hbae1、hbbe1、hbae4和hbbe3 四個基因均獲得CDS全長序列, 長度分別為432、444、426和441 bp, 分別編碼143、147、141、146個氨基酸(圖 1A和1B)。搜索結(jié)果顯示, 黃河裸裂尻魚轉(zhuǎn)錄組中沒有發(fā)現(xiàn)與斑馬魚hbae3、hbae5和hbbe2基因同源的序列。通過對黃河裸裂尻魚同斑馬魚胚胎型血紅蛋白基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹及氨基酸序列同源性分析, 結(jié)果顯示: α珠蛋白基因Sphbae1/Drhbae1和Sphbae4/Drhbae4分別匯聚在第一和第三支上, 且對應(yīng)的氨基酸序列同源性為88.11%、75.59%(圖 1A);β珠蛋白基因Sphbbe1/Drhbbe1和Sphbbe3/Drhbbe3分別匯聚在第一和第三支上, 且對應(yīng)的氨基酸序列同源性分別為82.99%和86.01%(圖 1B)。另外, 通過cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)黃河裸裂尻魚4個胚胎型血紅蛋白基因hbae1與hbbe1、hbbe3和hbae4核酸序列相似性為50%、45.7%和53.94%;hbbe1與hbbe3和hbae4核酸序列相似性為62.44%和43.43%;hbbe3與hbae4核酸序列相似性位為44.59%。

2.2 黃河裸裂尻魚胚胎型血紅蛋白基因結(jié)構(gòu)特點

黃河裸裂尻魚hbae1、hbbe1、hbae4和hbbe3基因序列長度分別為613、649、830和670 bp, 均由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成。hbae1、hbbe1、hbae4和hbbe3基因第1個外顯子長度均為90 bp, 第2長度分別為211、224、205和220 bp第3個外顯子序列長度分別為131、130、131和134 bp。胚胎型hbbe1和hbae1基因以頭對頭(3′-5′—5′-3′)的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起, 中間間隔序列長度為1411 bp; 而胚胎型hbbe3和hbae4基因則以尾對尾(5′-3′—3′-5′)的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起, 中間間隔序列長度為1396 bp(圖 1C)。

2.3 黃河裸裂尻胚胎期胚胎型血紅蛋白基因表達(dá)特點

熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測利用qRTPCR檢測了胚胎發(fā)育過程中胚胎型血紅蛋白基因的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示,hbae1和hbbe1基因的表達(dá)量都是從胚胎發(fā)育第5天(120 hpf)開始明顯上升(圖 2),其中從胚胎發(fā)育第5天(120 hpf)至破膜后第9天(432 hpf)期間持續(xù)高水平表達(dá), 但是從破膜后第4天(312 hpf)開始表達(dá)量逐步下降(圖 2A);hbae4基因的表達(dá)量也是從胚胎發(fā)育第5天開上有上調(diào)趨勢, 而破膜后(220 hpf)開始表達(dá)量下降甚至不表達(dá), 總體而言hbae4基因在整個胚胎發(fā)育期維持較低的表達(dá)量;hbbe3基因從胚胎發(fā)育第5天(120 hpf)至破膜后第6天(360 hpf)均有表達(dá), 而從破膜后第7天(384 hpf)開始其表達(dá)量下降甚至不表達(dá)。

整胚原位雜交檢測制備得到hbae1、hbbe1、hbbe3和hbae4 RNA探針核酸序列長度分別為:304、246、207和238 bp,hbae1與hbbe1、hbbe3和hbae4核酸序列相似性為35.2%、32.7%和30.79%;hbbe1與hbbe3和hbae4核酸序列相似性為34.38%和38.08%;hbbe3與hbae4核酸序列相似性為35.29%。整胚原位雜交檢測發(fā)現(xiàn), 在黃河裸裂尻魚胚胎發(fā)育早期階段胚胎型血紅蛋白基因的表達(dá)主要以hbae1和hbbe1為主,hbbe3次之, 而hbae4的表達(dá)極其微弱。hbae1、hbbe1、hbae4和hbbe3基因都是從胚胎發(fā)育第5天(120 hpf)開始出現(xiàn)明顯的雜交信號, 其中hbae1和hbbe1基因從胚胎發(fā)育第5天(120 hpf)至破膜后第9天(432 hpf)(持續(xù)存在較強的雜交信號, 而在胚胎發(fā)育第5天(120 hpf)至破膜后第3天(288 hpf)期間雜交信號最為強烈, 從破膜后第4天(312 hpf)開始信號逐漸變?nèi)?hbae4基因在胚胎發(fā)育的整個階段表現(xiàn)出較弱的雜交信號, 特別是破膜后基本觀察不到雜交信號; 而hbbe3基因從胚胎發(fā)育第5天(120 hpf)至破膜后第6天(360 hpf)都能觀察到雜交信號, 其中從胚胎發(fā)育第5天至破膜后第2天(264 hpf)期間信號最為強烈, 而從破膜后第3天(288 hpf)開始信號逐漸變?nèi)? 從破膜后第7天(384 hpf)開始基本觀察不到雜交信號(圖 3)。

3 討論

3.1 黃河裸裂尻魚胚胎型血紅蛋白基因的組成及結(jié)構(gòu)特征

已有研究表明, 斑馬魚基因組擁有7個胚胎型或仔魚型血紅蛋白基因, 分別為4個α珠蛋白基因(hbae1、hbae3、hbae4和hbae5)和3個β珠蛋白基因(hbbe1、hbbe2和hbbe3)[5]。本研究通過本地數(shù)據(jù)庫搜索, 在黃河裸裂尻魚轉(zhuǎn)錄組中只發(fā)現(xiàn)4個胚胎型血紅蛋白基因(hbae1、hbae4、hbbe1和hbbe3), 與斑馬魚基因組相比, 黃河裸裂尻魚缺少3個胚胎型血紅蛋白基因(hbae3、hbae5和hbbe2), 那么黃河裸裂尻魚基因組中是否缺失這3個基因？針對這一問題, 我們根據(jù)斑馬魚的hbae3、hbae5和hbbe2基因序列設(shè)計了特異性引物, 以黃河裸裂尻魚基因組DNA為模板進(jìn)行了目標(biāo)基因擴(kuò)增, 均沒有獲得特異性條帶。為了進(jìn)一步證實這一現(xiàn)象, 我們以斑馬魚hbae3、hbae5和hbbe2基因序列為搜索條件, 在NCBI數(shù)據(jù)庫中利用Blast掃描了已公布的黃河裸裂尻魚近源種-尖裸鯉(Oxygymnocypris stewartii)的基因組, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)尖裸鯉基因組中也不存在這3個基因。

脊椎動物α- /β-珠蛋白基因家族是由祖先珠蛋白基因經(jīng)過串聯(lián)復(fù)制而來, 復(fù)制事件發(fā)生在450—500(Million years ago, MYA)[18]。大約在320—400MYA,硬骨魚類經(jīng)歷了第三輪基因組復(fù)制, 這次硬骨魚類特異性基因組復(fù)制(Teleost-specific genome duplication, TGD)事件對硬骨魚類生理、形態(tài)和行為多樣性的形成產(chǎn)生了深刻影響, 同時對硬骨魚類血紅蛋白基因賦予了多樣性[19]。在硬骨魚中, 血紅蛋白基因分為兩大基因簇, 分別位于不同的染色體, 而且胚胎型血紅蛋白編碼基因的種類和數(shù)量在種間存在較大差異, 這種差異是在硬骨魚快速進(jìn)化過程中基因的復(fù)制或丟失事件所造成的[19,20]。因此, 本研究初步判斷hbae3、hbae5和hbbe2基因在裂腹魚亞科魚類進(jìn)化過程中可能發(fā)生了丟失。

圖 1 黃河裸裂尻魚胚胎型血紅蛋白基因氨基酸序列和基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Amino acid sequences and gene structure analysis of embryonic hemoglobin of S. pylzovi

黃河裸裂尻魚的4個胚胎型血紅蛋白基因與其他硬骨魚類一樣具有相對保守的結(jié)構(gòu), 均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成, 但是在外顯子和內(nèi)含子長度上表現(xiàn)出其特異性[2,5,21]。如, 大黃魚(Pseudos-ciaena crocea)等硬骨魚類中的研究表明血紅蛋白基因的第一內(nèi)含子序列長度明顯小于第二內(nèi)含子, 在黃河裸裂尻魚中研究發(fā)現(xiàn)hbae1、hbbe1和hbbe3基因符合這一特征, 但有趣的是hbae4基因的第二內(nèi)含子序列長度明顯小于第一內(nèi)含子[21]。研究表明,哺乳動物α-/β-珠蛋白分別由位于不同染色體的基因所編碼, 而在魚類中成對α-/β-珠蛋白基因以頭對頭(3′-5′—5′-3′)或以尾對尾(5′-3′—3′-5′)的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在一起[2]。如, 在斑馬魚中,hbbe1和hbae1基因以頭對頭的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在3號染色體上, 而hbbe2和hbae5基因以頭對頭、hbbe3和hbae4基因則以尾對尾的轉(zhuǎn)錄方式串聯(lián)在12號染色體[5,22,23]; 在青鳉(Oryzias latipes)中,hbae1和hbbe1、hbae2和hbbe2、hbae3和hbbe3三對基因都以頭對頭的方式串聯(lián)在8號染色體上[24—26]。本研究中,hbbe1和hbae1、hbbe3和hbae4基因的串聯(lián)轉(zhuǎn)錄方式與斑馬魚相同, 同時也表明近源種間胚胎型α-/β-珠蛋白基因具有相似或相近的表達(dá)調(diào)控方式。

圖 2 黃河裸裂尻魚胚胎發(fā)育過程中胚胎型血紅蛋白基因的相對表達(dá)量Fig. 2 Relative mRNA levels of embryonic hemoglobin genes during embryonic development of S. pylzovi

圖 3 整胚原位雜交檢測胚胎型血紅蛋白在黃河裸裂尻魚胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)Fig. 3 The expression patterns of embryonic hemoglobin genes by whole mount in situ hybridization during embryonic development of S.pylzovi

3.2 黃河裸裂尻魚胚胎型血紅蛋白的時空表達(dá)特征

脊椎動物擁有多個血紅蛋白編碼基因, 在個體發(fā)育的不同階段所表達(dá)的血紅蛋白基因有所不同,從而實現(xiàn)血紅蛋白的轉(zhuǎn)換表達(dá)(Hemoglobin switching)。脊椎動物血紅蛋白基因的多樣性保證了個體發(fā)育不同階段產(chǎn)生不同氧親和力的血紅蛋白, 從而滿足生物體應(yīng)對氧環(huán)境的改變[1,2,4]。比如, 斑馬魚基因組擁有7個胚胎型或仔魚型血紅蛋白基因, 在個體發(fā)生的16體節(jié)階段開始就能檢測到hbbe1和hbbe3基因表達(dá), 但是胚胎期主要以hbbe3的高表達(dá)為特征; 仔魚期hbbe2基因表達(dá)顯著上升并伴隨hbae5基因的表達(dá), 同時hbbe3基因表達(dá)急劇下降,這種由胚胎型到仔魚型血紅蛋白轉(zhuǎn)換表達(dá)充分滿足了斑馬魚胚胎發(fā)育過程中對氧環(huán)境的適應(yīng)[3,5]。另外, 青鳉基因組擁有包括兩個假基因在內(nèi)的11個胚胎型或仔魚型血紅蛋白基因, 在胚胎期主要以hbae2、hbae3、hbbe3、hbae4和hbbe4的表達(dá)為主要特征; 在仔魚期以hbae0、hbae1、hbae2和hbbe1基因的表達(dá)為主要特征[24]。在本研究中, 黃河裸裂尻魚只有4個胚胎型或仔魚型血紅蛋白基因, 而且結(jié)合qRT-RCR和整胚原位雜交結(jié)果分析表明4個基因的表達(dá)量都是從受精后第5天(120 hpf)開始明顯上升, 但是hbae4和hbbe3基因的高表達(dá)只維持在受精后第5天(120 hpf)至破膜期(216 hpf), 隨后急劇下降, 從破膜(216 hpf)開始hbae1和hbbe1基因表達(dá)急劇上升。由此可以看出, 黃河裸裂尻魚從胚胎型到仔魚型血紅蛋白轉(zhuǎn)換發(fā)生在受精后216h(即破膜期), 其顯著特征是hbae4和hbbe3基因表達(dá)下降伴隨hbae1和hbbe1基因表達(dá)急劇上升, 這與斑馬魚中以hbbe3表達(dá)下調(diào)并伴隨著hbbe2上調(diào)為標(biāo)志的從胚胎型向仔魚型血紅蛋白的轉(zhuǎn)換表達(dá)特征截然不同[5]。在黃河裸裂尻魚胚胎發(fā)育過程中,hbae1和hbbe1基因表達(dá)具有相似的特征, 這與這2個基因以頭對頭串聯(lián)表達(dá), 共享啟動子和增強子引起的協(xié)同表達(dá)機制有關(guān)[24,26]。而hbbe3和hbae4基因雖然也串聯(lián)在一起, 但是以尾對尾的串聯(lián)方式使得2個基因分別具有不同的啟動子和增強子, 從而使2個基因的表達(dá)各具特點, 這與斑馬魚中的研究一致[6]。

斑馬魚胚胎發(fā)育至16體節(jié)時, 可以檢測到hbae1、hbae3、hbbe1和hbbe3基因表達(dá), 發(fā)育至24h時, 原始前紅細(xì)胞(Primitive proerythroblasts)進(jìn)入血液循環(huán)[27], 但是, 在受精后24—48h內(nèi), 胚胎型血紅蛋白的表達(dá)持續(xù)發(fā)生變化, 如hbae3基因的表達(dá)下降, 而hbbe2的表達(dá)上升, 這種變化與紅髓系祖細(xì)胞(Erythromyeloid progenitor)的出現(xiàn)相一致[28]。黃河裸裂尻魚在受精后第5天(120 hpf)左右胚胎達(dá)到相當(dāng)于斑馬魚的16體節(jié)期, 發(fā)育至第8天(192 hfp)左右能夠觀察到明顯的血液循環(huán)和心跳, 期間胚胎型血紅蛋白的表達(dá)具有明顯的改變, 這種特征與斑馬魚中的研究相似, 但是黃河裸裂尻魚胚胎發(fā)育期發(fā)生表達(dá)變化的基因類型與斑馬魚完全不同[5], 這可能與黃河裸裂尻魚特殊的進(jìn)化歷程和高原環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。