張曼 王振光 高峰 胡珅華 武琳 程光平 陳秀荔

摘要：【目的】明確巴馬擬纓魚暴發(fā)性死亡的原因，為該病的臨床診斷和科學(xué)防治提供參考依據(jù)，進(jìn)而為巴馬擬纓魚健康養(yǎng)殖提供保障?！痉椒ā繌牟≡吹夭杉疾“婉R擬纓魚樣本，采用常規(guī)的細(xì)菌分離純化方法從心臟、肝臟和脾臟等組織病料中分離優(yōu)勢菌株，經(jīng)形態(tài)特征觀察、API 20NE生理生化鑒定及16S rRNA序列和gyrB基因PCR擴(kuò)增分析后，進(jìn)行人工感染試驗(yàn)及毒力基因檢測以確定其致病力，最后采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法檢測其藥敏性?！窘Y(jié)果】從患病巴馬擬纓魚的心臟、肝臟和脾臟等組織中分離獲得1株優(yōu)勢菌株（命名為BM178），綜合其形態(tài)特征、API 20NE生理生化鑒定譜及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可確定為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。經(jīng)腹腔注射感染BM178菌株后，巴馬擬纓魚的胸鰭、腹鰭和臀鰭基部不同程度出血，肛門紅腫，剖檢可觀察到內(nèi)臟團(tuán)有點(diǎn)狀出血、肝臟充血、脾臟腫大和腸道充血等癥狀，與自然發(fā)病巴馬擬纓魚的癥狀基本一致;BM178菌株對健康巴馬擬纓魚的半數(shù)致死劑量（LD50）為1.26×102 CFU/g。在BM178菌株中6種常見毒力基因（hly、aer、act、alt、ahp和ahal）的檢出率為100.0%，即毒力基因型為hly+aer+act+alt+ahp+ahal+。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，BM178菌株對頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑和氟苯尼考等7種抗菌藥物高度敏感，而對青霉素G已產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。【結(jié)論】嗜水氣單胞菌是引起巴馬擬纓魚暴發(fā)性死亡的主要病原菌，具有較強(qiáng)的致病性，實(shí)際生產(chǎn)中可選用多西環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑或氟苯尼考進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞： 巴馬擬纓魚;嗜水氣單胞菌;致病力;毒力基因;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號： S941.42? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）09-2051-10

Isolation， identification and pathogenicity analysis of Aeromonas hydrophila from Pseudocrossocheilus bamaensis

ZHANG Man1，2， WANG Zhen-guang1， GAO Feng1， HU Shen-hua1，3， WU Lin1，

CHENG Guang-ping1， CHEN Xiu-li3*

（1College of Animal Science and Technology/Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Aquatic Healthy Breeding and Nutrition Regulation， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 2School of Marine Sciences， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 3Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning? 530021， China）

Abstract：【Objective】This study was to clarify the cause of fulminant death of Pseudocrossocheilus bamaensis and provide the basis for clinical diagnosis and scientific prevention of this disease. In turn， it would provide guarantee for the healthy breeding of P. bamaensis. 【Method】Samples of diseased P. bamaensis were collected from disease origin， and the dominant strains were isolated from the heart， liver， and spleen tissues by conventional bacterial isolation and purification methods. Morphological characteristics observation， API 20NE physiological and biochemical identification， PCR amplification analysis based on 16S rRNA and gyrB gene， artificial infection test as well as virulence gene detection were ca-rried out to determine the pathogenicity. Finally， K-B drug susceptibility disc diffusion method was used to detect the drug sensitivity. 【Result】A dominant strain（named BM178） was isolated from the heart， liver， and spleen tissues of the diseased P. bamaensis. Based on its morphological traits， API 20NE physiological and biochemical identification spectrum and molecular biological identification results， it could be identified as Aeromonas hydrophila. After artificial abdominal infection of strain BM178， P. bamaensis showed hemorrhage on the base of pectoral， pelvic and anal fins， anus swelling， punctate bleeding in visceral mass， liver congestion， spleen swelling and intestinal congestion， which were in accordance with na-tural infection. The median lethal dose（LD50） of the BM178 strain to healthy P. bamaensis was 1.26×102 CFU/g. The detection rate of six common virulence genes（hly， aer， act， alt， ahp and ahal） in BM178 strain was 100.0%， and virulence genotype was hly+aer+act+alt+ahp+ahal+. The results of drug sensitivity test showed that the BM178 strain was highly sensitive to seven antibiotics including ceftriaxone， cefoperazone， gentamicin， doxycycline， norfloxacin， trimethoprim-sulfamethoxazole and florfenicol， but had strong resistance to penicillin G. 【Conclusion】A. hydrophila is the main pathogen leading to sudden death of P. bamaensis and has strong pathogenicity. Doxycycline， trimethoprim-sulfamethoxazole or florfenicol can be used for prevention and treatment in actual production.

Key words： Pseudocrossocheilus bamaensis; Aeromonas hydrophila; pathogenicity; virulence gene; drug sensitivity test

Foundation item：Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFAA198044）; Guangxi Science and Technology Key Project（GuikeAA17204088-3）; Project of Basic Ability Improving of Young Teachers in Guangxi（KY2016YB021）

0 引言

【研究意義】巴馬擬纓魚（Pseudocrossocheilus bamaensis）原名巴馬繐唇鲃，隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）擬纓魚屬（Pseudocrossocheilus），主要分布于廣西境內(nèi)的紅水河水系（張鶚和陳景星，1997）。巴馬擬纓魚骨刺松軟、可整體食用，且富含脂肪，是廣西地區(qū)名貴的土著經(jīng)濟(jì)魚類（程光平等，2008）。目前，市售巴馬擬纓魚均為野外捕獲，受過度捕撈及自然棲息生境惡化等因素的影響，巴馬擬纓魚捕獲量逐年減少，且呈群體低齡化和個體小型化趨勢，其野生資源瀕臨枯竭（Zhang et al.，2018）。為恢復(fù)巴馬擬纓魚種群資源及滿足當(dāng)前市場需求，程光平等（2008）從2004年起開始對巴馬擬纓魚進(jìn)行馴養(yǎng)和人工繁殖研究，但由于巴馬擬纓魚對人工養(yǎng)殖環(huán)境要求較高，特別是在水溫較高時易暴發(fā)以敗血病為主的細(xì)菌性病害，極大制約了巴馬擬纓魚苗種的規(guī)模化繁育。因此，有針對性開展巴馬擬纓魚病害研究與防治，對實(shí)行健康養(yǎng)殖及種質(zhì)資源保護(hù)均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，關(guān)于巴馬擬纓魚的研究主要集中在肉質(zhì)營養(yǎng)評價（龐衛(wèi)等，2010）、基礎(chǔ)生物學(xué)（Wang et al.，2015）和遺傳學(xué)（Zhang et al.，2018）等方面，而針對其病害防治的研究尚無相關(guān)報道。近年來，已有研究人員從其他鯉科魚類如禾花鯉（Cyprinus carpio）、黃河鯉（C. carpio haematopterus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）和長絲裂腹魚（Schizothorax dolichonema）等體內(nèi)分離獲得多種可引起敗血癥等疾病的細(xì)菌性病原，主要為氣單胞菌（Aeromonas spp.）（龍?zhí)K等，2016a;趙賢亮等，2017;何濤等，2018;雷雪平等，2019）。最常見的氣單胞菌是嗜水氣單胞菌（A. hydrophila），其廣泛分布于自然界，是引起魚類氣單胞菌敗血癥的主要病原，臨床癥狀表現(xiàn)為魚類體表有不同程度出血，剖檢可見臟器充血腫大，發(fā)病率和死亡率極高（曹青等，2017），給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時，嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。黃新財?shù)龋?013）研究證實(shí)，黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）源嗜水氣單胞菌耐藥株對鹽酸沙拉沙星的耐藥性在短期內(nèi)很難消除，且具有穩(wěn)定的遺傳性，因此在實(shí)際生產(chǎn)中不宜常用或?yàn)E用鹽酸沙拉沙星;陳婷婷（2014）研究發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）源嗜水氣單胞菌的致病力與氣溶素基因（aerA）、絲氨酸蛋白酶基因（ahpA）和溶血素基因（hlyA）具有顯著相關(guān)性;秦莉（2014）研究表明，白斑狗魚（Esox lucius）源嗜水氣單胞菌不同菌株間的致病力差異是其攜帶基因水平不同所致，對青霉素G、左氧氟沙星、強(qiáng)力霉素和環(huán)丙沙星呈高度或中度敏感且敏感性基本一致;牛志偉等（2016）基于Meta分析對我國耐喹諾酮類嗜水氣單胞菌毒力基因及耐藥基因的檢出情況進(jìn)行系統(tǒng)評價，結(jié)果顯示檢測我國致病性嗜水氣單胞菌時，淮河以南地區(qū)應(yīng)以毒力基因actA和aerA為致病性強(qiáng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，而淮河以北地區(qū)建議以毒力基因hlyA和aerA為致病性強(qiáng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2018年5月廣西大學(xué)水產(chǎn)基地人工馴養(yǎng)的巴馬擬纓魚出現(xiàn)暴發(fā)性死亡（發(fā)病水溫28 ℃），主要臨床癥狀為攝食減少、反應(yīng)遲鈍，鰭條基部出血，肛門紅腫;剖檢可見內(nèi)臟團(tuán)出血、脾臟腫大、肝臟和腸道充血;2 d內(nèi)的累計(jì)死亡率高達(dá)85.0%。因此，迫切需要探明發(fā)病原因并科學(xué)防治，以降低該病造成的經(jīng)濟(jì)損失?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對患病巴馬擬纓魚進(jìn)行病原菌分離鑒定、致病力檢測及藥敏性分析，明確巴馬擬纓魚暴發(fā)性死亡的原因，為該病的臨床診斷和科學(xué)防治提供參考依據(jù)，進(jìn)而為巴馬擬纓魚健康養(yǎng)殖提供保障。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

患病巴馬擬纓魚采自廣西大學(xué)水產(chǎn)基地，體質(zhì)量25.1±1.8 g/尾;健康巴馬擬纓魚購自廣西大化縣農(nóng)貿(mào)市場，體質(zhì)量21.6±1.3 g/尾，暫養(yǎng)3周后用于人工感染試驗(yàn)。營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和MHA培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;API 20NE試劑條和藥敏紙片購自法國生物梅里埃公司;2×Bench TopTM Taq Master Mix購自杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司;所有擴(kuò)增引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 病原菌分離與鑒定

1. 2. 1 病原菌分離 在無菌條件下，以MS-222麻醉魚體，從患病巴馬擬纓魚的心臟、肝臟和脾臟等組織病料中取樣，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單個優(yōu)勢菌落連續(xù)純化培養(yǎng)3次，分離純化的菌株于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 病原菌形態(tài)觀察及理化特性鑒定 肉眼觀察分離菌株的菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色和氧化酶試驗(yàn)。若分離菌株為革蘭氏陰性且氧化酶試驗(yàn)呈陽性，則選用API 20NE試劑條對其進(jìn)行各項(xiàng)理化指標(biāo)鑒定。

1. 2. 3 分子生物學(xué)鑒定 提取病原菌DNA，采用16S rRNA和gyrB基因引物（表1）進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系20.0 μL，包括DNA模板（50.0 ng/μL）1.0 μL，上、下游引物（10.0 μmol/L）各0.3 μL，2×Bench TopTM Taq Master Mix （Taq DNA聚合酶0.05 U/μL，MgCl2 4.0 mmol/L，dNTPs 0.4 mmol/L）10.0 μL，ddH2O 8.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 45 s，55/64 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行29個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果通過BLAST比對進(jìn)行核苷酸序列相似性分析，采用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，并以1000次Bootstrap進(jìn)行置信度檢測。

1. 3 病原菌致病力分析

1. 3. 1 人工感染試驗(yàn)與半數(shù)致死劑量（LD50）測定

對低溫保存的病原菌株進(jìn)行活化，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)6～8 h，離心去除培養(yǎng)基后以無菌PBS制成菌懸液，并稀釋為1.00×106、1.00×105、1.00×104、1.00×103和1.00×102 CFU/mL等5個濃度梯度。試驗(yàn)設(shè)5個試驗(yàn)組和1個對照組，每組20尾巴馬擬纓魚，經(jīng)MS-222麻醉后，試驗(yàn)組巴馬擬纓魚腹腔注射菌懸液（60.0 μL/尾），對照組注射等量無菌PBS。試驗(yàn)期間持續(xù)泵氣增氧，水溫（28±1）℃，連續(xù)觀察7 d，每天記錄各組巴馬擬纓魚的死亡情況，觀察其病癥并對死亡個體進(jìn)行剖檢。根據(jù)死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用SPSS 24.0計(jì)算病原菌株對巴馬擬纓魚的LD50，并再次對人工感染后具有典型癥狀的病魚進(jìn)行病原菌分離鑒定，檢驗(yàn)其與原致病菌是否一致。

1. 3. 2 毒力基因檢測 選取氣單胞菌屬中已報道的6種常見毒力基因進(jìn)行PCR檢測（表1），包括4種外毒素基因[溶血素基因（hly）、氣溶素基因（aer）、細(xì)胞毒性腸毒素基因（act）和細(xì)胞興奮性腸毒素基因（alt）]、1種胞外蛋白酶基因——絲氨酸蛋白酶基因（ahp）和1種黏附素基因（ahal）。PCR反應(yīng)體系同1.2.3，擴(kuò)增程序參照相關(guān)文獻(xiàn)（表1）并稍加改進(jìn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 4 藥敏試驗(yàn)

參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）公布的抗菌藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)（羅土炎等，2018），采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法檢測病原菌對9種抗菌藥物的敏感性。取50.0 μL菌懸液（約1.00×108 CFU/mL）均勻涂布于MHA培養(yǎng)基上，將藥敏紙片平鋪于培養(yǎng)基表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察并測量抑菌圈直徑，判定病原菌對藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分離與鑒定結(jié)果

從患病巴馬擬纓魚的心臟、肝臟和脾臟等組織中分離獲得1株優(yōu)勢菌株（命名為BM178）。將BM178菌株接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，其菌落形態(tài)特征為圓形，中央凸起，邊緣光滑，顏色呈灰白色（圖1-A）;革蘭氏染色結(jié)果顯示BM178菌株為革蘭氏陰性短桿菌（圖1-B）。API 20NE生理生化鑒定結(jié)果（表2）表明，BM178菌株與胡子鯰源嗜水氣單胞菌參考菌株HZN-500（龍?zhí)K等，2016b）的生理生化特性基本一致，僅在阿拉伯糖發(fā)酵方面存在差異，故初步判定BM178菌株為嗜水氣單胞菌。

PCR擴(kuò)增獲得BM178菌株的16S rRNA序列和gyrB基因，其序列長度分別為1325和1044 bp，對應(yīng)的GenBank登錄號為MN559379和MN587713。基于16S rRNA序列的BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果表明，BM178菌株與豚鼠氣單胞菌（A. caviae）QW14株和嗜水氣單胞菌GX5株的相似性均達(dá)100.0%，且聚在同一分支上（圖2），三者的親緣關(guān)系最近;基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析則顯示，BM178菌株與嗜水氣單胞菌NSAH-05株的相似性達(dá)100.0%，親緣關(guān)系最近，隨后與其他嗜水氣單胞菌聚類，最后與豚鼠氣單胞菌聚為一大支（圖3）。綜合BM178菌株的形態(tài)特征、API 20NE生理生化鑒定譜及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可確定其為嗜水氣單胞菌。

2. 2 病原菌致病力分析結(jié)果

以不同濃度梯度（1.00×102～1.00×106 CFU/mL）的菌懸液分別對健康巴馬擬纓魚進(jìn)行腹腔注射，結(jié)果（表3）顯示，最小菌懸液濃度組（1.00×102 CFU/mL）的7 d累計(jì)死亡率為0;隨著菌懸液濃度的增加，各組巴馬擬纓魚均有死亡，且死亡率呈上升趨勢;當(dāng)菌懸液濃度達(dá)1.00×106 CFU/mL，腹腔注射后8～12 h即出現(xiàn)暴發(fā)性死亡現(xiàn)象，2 d內(nèi)的累計(jì)死亡率達(dá)100.0%;而注射無菌PBS的巴馬擬纓魚未出現(xiàn)任何病變及死亡現(xiàn)象。根據(jù)巴馬擬纓魚死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算得到BM178菌株對健康巴馬擬纓魚的LD50為1.26×102 CFU/g。人工感染發(fā)病巴馬擬纓魚的臨床癥狀主要表現(xiàn)為魚體游動緩慢、反應(yīng)遲緩、攝食減少;胸鰭、腹鰭和臀鰭基部不同程度出血，肛門紅腫（圖4-A）;內(nèi)臟團(tuán)有點(diǎn)狀出血，肝臟充血，脾臟腫大（圖4-B），腸道充血（圖4-C），與自然發(fā)病巴馬擬纓魚的癥狀基本一致，均有別于健康巴馬擬纓魚（圖4-D～圖4-F）。對人工感染發(fā)病的巴馬擬纓魚再次進(jìn)行病原菌分離，經(jīng)鑒定與初次分離獲得的BM178菌株相同，因此判定BM178菌株是引起巴馬擬纓魚暴發(fā)性死亡的致病菌。

毒力基因檢測結(jié)果（圖5）顯示，在BM178菌株中6種常見毒力基因（hly、aer、act、alt、ahp和ahal）的檢出率為100.0%，即毒力基因型為hly+aer+act+alt+ahp+ahal+。PCR擴(kuò)增得到的毒力基因片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，對應(yīng)的GenBank登錄號分別為MN587716（hly基因）、MN587717（aer基因）、MN 587720（act基因）、MN587718（alt基因）、MN587715（ahp基因）和MN587714（ahal基因）。

2. 3 病原菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，BM178菌株對頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑和氟苯尼考等7種抗菌藥物高度敏感，而對青霉素G已產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。

3 討論

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界，是典型的人—畜—水生動物共患病原菌。近年來，先后從胡子鯰（Clarias fuscus）、異育銀鯽（Carassius auratus gibe-lio）、山瑞鱉（Palea steindachneri）和西伯利亞鱘（Acipenser baerii）等不同感染宿主體內(nèi)分離鑒定出嗜水氣單胞菌（龍?zhí)K等，2016b;曹青等，2017;韓書煜等，2017;葉彩燕等，2018），且該細(xì)菌可引發(fā)急性出血性敗血癥，導(dǎo)致水產(chǎn)動物暴發(fā)性死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究首次從患病巴馬擬纓魚的內(nèi)臟組織中分離獲得1株優(yōu)勢菌株（BM178），綜合其形態(tài)特征、生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定和致病力分析結(jié)果，確定引起巴馬擬纓魚暴發(fā)性死亡的致病菌為嗜水氣單胞菌。其中，BM178菌株的阿拉伯糖試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，與絕大多數(shù)魚源嗜水氣單胞菌的阿拉伯糖代謝特性（曹青等，2017;王藝等，2019）存在差異，但與加州鱸源嗜水氣單胞菌LY4株的結(jié)果（葉偉東等，2018）一致。在分解已二酸和檸檬酸等方面，BM178菌株與懷頭鲇源嗜水氣單胞菌NY-12株（李紹戊等，2018）和禾花鯉源嗜水氣單胞菌TH3株（鄧小紅等，2017）間存在差異，可能是種間差異所致，也可能與地域來源有關(guān)。分子生物學(xué)鑒定是在核酸水平上快速、準(zhǔn)確地對細(xì)菌種屬進(jìn)行鑒定的方法。高度保守的16S rRNA序列是細(xì)菌鑒定的理想靶基因;而gyrB基因是相對保守但又存在一定變異率的管家基因，其堿基替換率（7.0%～8.0%/千萬年）遠(yuǎn)高于前者（0.2%/千萬年），更適用于相似度較高的屬內(nèi)近緣種鑒定（徐先棟等，2016）。本研究在生理生化鑒定的基礎(chǔ)上，選用16S rRNA序列和gyrB基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，在基于16S rRNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中BM178菌株與豚鼠氣單胞菌QW14株和嗜水氣單胞菌GX5株聚為一支，難以確定其種類;而基于gyrB基因序列相似性的聚類分析結(jié)果表明，BM178菌株與嗜水氣單胞菌的相似性高于其與豚鼠氣單胞菌的相似性，故確定BM178菌株為嗜水氣單胞菌。

本研究的人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明，BM178菌株在短時間內(nèi)可導(dǎo)致巴馬擬纓魚暴發(fā)性死亡，對巴馬擬纓魚的LD50為1.26×102 CFU/g。依據(jù)Mittal等（1980）將嗜水氣單胞菌LD50在104～105 CFU/g時判定為強(qiáng)毒株的標(biāo)準(zhǔn)，可知BM178菌株具有較強(qiáng)毒力，屬于強(qiáng)致病菌株。嗜水氣單胞菌的致病機(jī)理復(fù)雜，涉及到外毒素、胞外蛋白酶和黏附素等多種毒力因子（田佳鑫等，2017）。劉杰等（2015）研究發(fā)現(xiàn)hly和act基因是嗜水氣單胞菌的重要毒力基因，由于這2種外毒素均具有溶血性和細(xì)胞毒性，可直接作用于宿主細(xì)胞導(dǎo)致其裂解死亡（胡安東等，2019）。此外，各種毒力因子在致病性方面具有協(xié)同效應(yīng)，當(dāng)嗜水氣單胞菌攜帶hly和act基因，且同時攜帶aer、alt、ahp和ahal基因中的2種或2種以上毒力基因時，即認(rèn)定為強(qiáng)毒株。本研究對BM178菌株常見毒力基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，hly、aer、act、alt、ahp和ahal等6種毒力基因在BM178菌株中均有表達(dá)，符合強(qiáng)毒株的特征。綜合人工感染試驗(yàn)結(jié)果，可判定BM178菌株即為強(qiáng)毒株，且對巴馬擬纓魚的強(qiáng)致病力是多個毒力基因協(xié)同作用的結(jié)果。

目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用抗菌藥物仍是疫病防控的主要手段。因此，有針對性開展藥敏試驗(yàn)，對科學(xué)用藥和疫病防治均具有重要指導(dǎo)意義。本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，BM178菌株對頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、多西環(huán)素、諾氟沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑和氟苯尼考等7種抗菌藥物高度敏感。其中，對復(fù)方磺胺甲噁唑和氟苯尼考的敏感性與羅土炎等（2018）、時少坤等（2019）的研究結(jié)果一致，而對頭孢曲松、頭孢哌酮、慶大霉素、多西環(huán)素和諾氟沙星等5種藥物的敏感性與李紹戊等（2018）、時少坤等（2019）的研究結(jié)果存在一定差異，可能與菌株來源及地區(qū)間的用藥差異有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步探究。此外，BM178菌株對青霉素G已產(chǎn)生耐藥性，與多數(shù)研究結(jié)果（徐先棟等，2016;王藝等，2019）一致。Penders和Stobberingh（2008）研究認(rèn)為，嗜水氣單胞菌對青霉素類藥物具有固有耐藥性，可能與其擁有多重可誘導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)。β-內(nèi)酰胺酶可破壞青霉素類藥物結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而導(dǎo)致此類藥物失去抗菌效果（李梅等，2018）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果可為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的疾病防控提供科學(xué)依據(jù)，但實(shí)際用藥仍需嚴(yán)格執(zhí)行國家的相關(guān)規(guī)定及政策。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2019年1號》文件中明確指出，頭孢曲松、頭孢哌酮和諾氟沙星等抗生素屬于禁用藥物;而在《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2019年2號》文件中，多西環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑和氟苯尼考是國務(wù)院獸醫(yī)行政管理部門已批準(zhǔn)的水產(chǎn)用獸藥，因此建議選用這3種藥物進(jìn)行防治。

4 結(jié)論

嗜水氣單胞菌是引起巴馬擬纓魚暴發(fā)性死亡的主要病原菌，具有較強(qiáng)的致病性，實(shí)際生產(chǎn)中可選用多西環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑或氟苯尼考進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）