李樹林，傅應云*

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院，廣東省深圳市人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，深圳 518020)

模式識別受體可分為兩類，一類是膜結合受體，如Toll樣受體；另一類是區(qū)分于膜結合受體的細胞內(nèi)模式受體，如核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide binding oligomerization domain,NOD)樣受體(NOD like receptors,NLRs)。NLRs一般包括3個結構：C端識別配體的亮氨酸富集區(qū)、中間區(qū)發(fā)揮低聚化作用的核苷酸結合寡聚化域、N端調節(jié)蛋白質相互作用的效應結構域[募集域(Caspase recruitment domain,CARD)、熱蛋白結構域等]。NLRP3是NLRs中近年來研究最為廣泛及熱門的成員之一。NLRP3炎癥小體由感受蛋白NLRP3、衍接蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,AS-C)、效應蛋白半胱天冬酶-1(Caspase-1)組成[1]。NL-RP3通過病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)被激活，激活后的NLRP3募集ASC，使pro-Caspase-1激活成Caspase-1，三者形成復合物，即NLRP3炎癥小體，進而激活白細胞介素(interleukin,IL)-18、IL-1β 前體的激活和分泌，促進炎癥的發(fā)展，參與疾病的發(fā)生[2]。NLRP3在2型糖尿病、老年癡呆癥、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等疾病中發(fā)揮重要作用。血栓栓塞性疾病包括動脈栓塞及靜脈栓塞，均與靜脈內(nèi)皮損傷、血小板密切相關。炎癥小體NLRP3在動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)血栓形成中的作用近年也成為深入研究的一方面，但對靜脈血栓形成的研究仍較少?，F(xiàn)就NLRP3在兩種疾病中的研究進展進行綜述。

研究[3]表明，NLPR3炎癥小體完整的激活需要經(jīng)過兩個階段。第一階段是啟動階段，PAMPs或DA-MPs被識別后，導致炎癥小體的成分前體產(chǎn)生或激活，如Pro-IL-18、Pro-IL-1、NLRP3；第二階段是激活階段，即各組分(NLRP3蛋白、ASC、Caspase-1)的組裝形成NLRP3炎癥小體及IL因子的參與。目前NLRP3激活階段的具體機制仍有爭議，主要有3種模式：(1)低K+環(huán)境：某些物質刺激細胞后，在細胞膜表面形成小孔，大量的K+外流，細胞內(nèi)形成低K+環(huán)境，從而活化NLRP3炎癥小體；細胞外的ATP與細胞膜上的P2-X7受體結合后，由Pannexin-1也能在膜上形成小孔，造成低K+[4]；(2)溶酶體損傷：某些無機粒子或晶體可被巨噬細胞吞噬，吞噬后會導致巨噬細胞內(nèi)溶酶體的損傷及數(shù)量減少，從而作為DAMPs，激活N-LRP3炎癥小體[5]；(3)活性氧：活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS）通過作用硫氧還蛋白，使其裂解，形成硫氧還蛋白作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TNXIP)，從而激活NLPR3炎癥小體[6]。

1 血管內(nèi)皮細胞與血栓

完整的血管內(nèi)皮細胞把血液中的血小板、凝血因子和有高度促凝作用的內(nèi)皮下細胞外基質分隔開，完整的內(nèi)皮細胞具有屏障保護作用。血管內(nèi)皮細胞的破損是動靜脈血栓形成的第一步。內(nèi)皮細胞破損會出現(xiàn)大量NLRP3炎癥小體，而NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生又進一步引發(fā)內(nèi)皮細胞的損傷。K.KINNUNEN等[7]通過溶酶體消融劑作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)并觀察NLRP3表達的水平，證實了通過溶酶體損傷機制激活了NLRP3，促進IL-6、IL-8的分泌，從而作用于HUVECs。H.YANG等[8]報道，原花青素B2抑制HUVECs中脂多糖誘導的NLRP3表達水平、Caspase-1活化及IL-1的分泌。J.SONG等[9]發(fā)現(xiàn)芒果苷可降低R-OS水平，通過抑制內(nèi)質網(wǎng)相關TXNIP的激活，從而抑制NLRP3的激活及后續(xù)IL-1β 的活化及分泌，保護內(nèi)皮細胞免受進一步損傷。除了某些外來物質的作用，血流動力學的改變也可通過NLRP3介導內(nèi)皮細胞的損傷，但這多發(fā)生于動脈栓塞性疾病中，因為動脈血液流速快，在大動脈分叉處會形成異常的低剪切力，誘導血管內(nèi)皮細胞表達NLRP3增高，IL-1β 分泌增多，加重AS等動脈血栓前病變[10]。

2 NLRP3與動脈血栓疾病

2.1 NLRP3與動脈粥樣硬化 普遍認為，AS發(fā)病過程中，無菌炎癥發(fā)揮著重要作用。G.P.VARGHESE等[11]通過對瑞典555例心肌梗死患者與1 016個健康人的DNA分析，明確了NLRP3基因下游調控區(qū)域的4個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)，證實NLRP3炎癥小體單基因多態(tài)性與AS密切相關。F.ZHENG等[12]對36例冠狀動脈搭橋手術患者升主動脈組織與10名捐獻腎臟正常人進行對比，得出冠狀動脈粥樣硬化患者動脈NLRP3炎癥小體表達水平與冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度呈正相關的結論。

2.1.1 NLRP3與巨噬細胞關系最密切 巨噬細胞是IL-1β 最主要的來源，外來的因素或巨噬細胞內(nèi)的某些物質通過激活IL-1β 而引起AS的發(fā)生。K.RAJAM?KI等[13]首先指出，膽固醇結晶激活NLRP3炎癥小體，促進IL-1β 的形成和分泌，參與AS的發(fā)生，具體機制：巨噬細胞識別并吞噬胞外的膽固醇晶體，超載的膽固醇結晶導致溶酶體破裂、溶酶體內(nèi)的組織蛋白酶B滲入胞質、鉀離子的外流形成的細胞內(nèi)低鉀環(huán)境，從而激活NLRP3炎癥小體，pro-IL-1β形成IL-1β 分泌出細胞外，引發(fā)AS炎癥反應。除了以上幾種方式，膽固醇晶體激活NLRP3炎癥小體仍存在其他的途徑。E.O.SAMSTAD[14]指出膽固醇晶體激活補體旁路，引發(fā)細胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的釋放，補體C5a與TNF的形成復合體作為引發(fā)物激活NLRP3炎癥小體，激活IL-1β。磷酸鈣也可通過溶酶體破裂、組織蛋白酶B滲漏的機制激活NLRP-3，參與AS炎癥過程。除了膽固醇結晶，氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL) 也是巨噬細胞中激活炎癥反應的關鍵物質，oxLDL通過CD36介導的ROS途徑，激活NLRP3炎癥小體，激活Caspase-1，使巨噬細胞內(nèi)IL-1β 分泌，促使泡沫細胞形成。使用IL-1β 抗體或IL-1RA后，泡沫細胞形成明顯減少，間接證明IL-1β 在AS炎癥反應發(fā)生過程中的作用[15]。除此之外，游離脂肪酸[16]、血清淀粉樣蛋白A[17]、單鈉尿酸鹽[18]等均通過巨噬細胞激活NLRP3，促進IL-1β 參與AS的發(fā)生發(fā)展。

2.1.2 NLRP3促進AS與血管平滑肌細胞(smooth muscle cells,SMC)相關 中膜SMC遷移入內(nèi)膜并增生，是AS進展期病變形成的主要環(huán)節(jié)。遷入內(nèi)膜的平滑肌細胞攝取低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)或極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)后成為肌原性泡沫細胞，參與AS斑塊的形成。SMC與動脈中膜鈣化聯(lián)系密切。外源性的磷酸鈣通過NALP3引起血管鈣化，趙曼等[19]通過建立大鼠主動脈鈣化模型，注射siNALP3的試驗組大鼠，血清IL-1β 水平明顯下降，說明siNALP3抑制血管平滑肌的鈣化，從而也說明炎癥小體是血管鈣化發(fā)生的基礎。C.WEN等[20]發(fā)現(xiàn)，大鼠的主動脈血管SMC在β-磷酸甘油的作用下可發(fā)生鈣化，細胞內(nèi)的NLRP3炎癥小體的mRNA表達明顯升高，IL-1β 分泌增多；而當NLRP3蛋白被沉默后，SMC的鈣化也受到抑制。T.N.TANGI等的研究[21]同樣證實了在主動脈平滑肌中NLRP3的表達上升，IL-1β 的分泌促進AS的發(fā)生。

2.2 NLRP3與心肌梗死 在動脈粥樣斑塊形成的基礎上，斑塊內(nèi)發(fā)生繼發(fā)性改變，如斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂、鈣化、血栓形成等，改變的斑塊堵塞冠脈即導致心肌梗死。在心肌梗死發(fā)生發(fā)展中，無菌性炎癥同樣發(fā)揮關鍵作用，而IL-1β 是心肌梗死炎癥反應早期的關鍵物質，提示著NLRP3炎癥小體的重要作用。動物實驗[15]證實，IL-1β 的中和抗體及阿那白滯素(某種重組IL-1受體拮抗劑)能減輕急性心梗的損傷。除此之外，NLRP3在心梗后缺血再灌注中同樣有著極其關鍵的作用，主要通過心肌細胞、心肌成纖維細胞[22]。在小鼠心梗模型中，ASC表達水平上升主要在發(fā)生浸潤的中性粒細胞和巨噬細胞中，還發(fā)生在心肌細胞和心肌成纖維細胞，與人類是一樣的。M.TAKAHASHI[23]應用ASC-knockout(KO)和Caspase-1-KO小鼠建立左前降支閉塞缺血再灌注模型，發(fā)現(xiàn)炎癥反應明顯減低，包括炎細胞浸潤減少，細胞因子、趨化因子等表達下降；同時發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死面積、心肌纖維化程度、左室功能障礙均明顯減輕。提示心肌細胞及成纖維細胞參與心梗缺血再灌注的機制與炎癥過程相關。進一步發(fā)現(xiàn)，同樣是ASC-KO的模型，非骨髓移植細胞心梗面積的減少程度與骨髓移植細胞相似，這也表明非骨髓來源的心肌細胞、心肌成纖維細胞在心梗缺血再灌注炎癥反應中的作用。但在心肌細胞和心肌成纖維細胞中NLRP3引發(fā)缺血再灌注損傷的具體機制近年研究頗多，觀點稍有不同。S.MARIATHASAN等[24]發(fā)現(xiàn)，P2X7是一種嘌呤受體通道，它會被損傷細胞釋放出細胞外的ATP激活，引發(fā)鉀離子流出，進而激活NLRP3，最終引起Caspase-1依賴的心肌細胞死亡，即細胞焦亡。而?.SANDANGER團隊[25]在小鼠心梗模型中，NLRP3在心肌成纖維細胞中表達顯著上調，組織損傷后釋放的ATP刺激心肌成纖維細胞分泌IL-1β。前者強調的是NLRP3心肌細胞細胞焦亡途徑，后者強調的是NLRP3引發(fā)心肌成纖維細胞分泌IL-1β。綜上，心肌細胞與心肌成纖維細胞在心梗缺血再灌注的炎癥反應中發(fā)揮著不同但重要的作用，都通過NLRP3炎癥小體最終引起心肌炎癥及心肌重構。

2.3 NLRP3與腦血管疾病 對于NLRP3與腦血管疾病的研究，主要集中在NLRP3介導缺血性腦卒中的損傷及炎癥反應機制。D.Y.FANN等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧缺糖的條件下，NLRP3蛋白、IL-1β、IL-18在皮層神經(jīng)元中水平均上升，同時在大腦缺血再灌注小鼠模型及腦卒中死亡患者腦組織中，NLRP3水平也明顯升高。但F.YANG等[27]在小鼠大腦中動脈阻塞的模型中發(fā)現(xiàn)NLRP3在小膠質細胞和內(nèi)皮細胞中的表達為主，提示小膠質細胞、內(nèi)皮細胞可能才是腦卒中機制的研究靶點。但無論是神經(jīng)元還是小膠質細胞、內(nèi)皮細胞，均提示NLRP3炎癥小體是缺血性腦血管病中炎癥反應的重要角色。F.YANG等[27]還發(fā)現(xiàn)，在大腦中動脈閉塞小鼠模型中，NLRP3-/-小鼠腦組織的壞死范圍、水腫程度、血腦屏障的通透性均比普通小鼠減輕，表明NLRP3還與缺血后血腦屏障的損傷相關[27]。NLRP3介導的腦缺血后炎癥反應有多種機制，主要有ROS途徑和核因子/絲裂原激活的蛋白激酶(nuclear factor-κB/mitogen-activated protein kinase,NF-κB/MAPK)通路。如前所述，ROS途徑同樣存在于腦缺血再灌注損傷NLRP3的調控，通過TNXIP激活NLRP3，引發(fā)下游的改變進行調控。而NF-κB/MAPK通路是更新的觀點。NF-κB/MAPK信號通路的激活使NLRP3的表達水平上升，而體外或體內(nèi)的腦缺血條件下，這兩種信號通路的藥物抑制劑會使這種激活NLRP3的作用明顯減弱；靜注免疫球蛋白就是通過抑制NF-κB/MAPK信號通路，從而抑制NLRP3的表達而達到減輕腦卒中缺血再灌注損傷的作用[26]。綜上，NLRP3介導的炎癥反應在腦卒中缺血后損傷及血腦屏障損傷中作用顯著。

3 NLRP3與靜脈血栓形成

血小板與NLRP3炎癥小體是研究熱點，在內(nèi)皮細胞受損后，血小板聚集、黏附于內(nèi)皮破損處，進而血小板活化，分泌活性物質進一步引發(fā)周圍血小板黏附及活化。P.MURTHY等[28]指出，血小板中NLRP3炎癥小體促進血小板的激活、聚集和體外血栓形成；在已激活的血小板中，NLPR3炎癥小體表達上調；血小板中的bruton′s酪氨酸蛋白激酶在調控NLRP3的對血小板作用中起著關鍵的角色。NLPR3炎癥小體的激活，促進IL-1β 的成熟與分泌，在體內(nèi)氯化鐵(FeCl3)栓塞模型中，在白細胞導致各種機能障礙前，IL-1β 已在血小板富集處被大量檢測到，說明IL-1β 在栓塞早期發(fā)揮著重要作用，也提示了NLRP3的作用。IL-1β 作為一種新的血小板興奮因素，促進血小板的激活，同時激活的血小板會再次引起IL-1β 的激活，從而使更多的血小板活化，引起血栓形成，所以IL-1β 作為血小板激活劑將血栓形成與免疫反應聯(lián)系起來。E.D.HOTTZ等[29]發(fā)現(xiàn)登革熱感染后，通過依賴ROS的途徑激活NLRP3炎癥小體，促使血小板原性的IL-1β 從微粒中釋放，進而導致內(nèi)皮細胞滲透性的增高，引發(fā)登革熱的一系列臨床表現(xiàn)。提示了炎癥小體NLRP3與血小板的關系，但涉及NLRP3通過血小板引起靜脈血栓栓塞的報道仍較少。同樣為NLRs家族的核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide binding oligonucleotide structure domain 2,NOD2)，S.ZHANG等[30]首次提出血小板中NOD2的表達及其功能在血小板的激活和血栓形成中的作用，為血小板激活機制的研究提供了新的觀點，同時也強調了血小板NOD2在血栓形成與免疫及炎癥之間的關鍵的橋梁作用。N.GUPTA等[31]研究了高海拔肺栓塞患者NLRP3炎癥小體促進由低氧導致靜脈血栓栓塞的機制，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體參與血栓形成的早期炎癥環(huán)境，并受低氧誘導因子-1α 的調節(jié)。

4 小結

目前，血栓性疾病的治療主要針對凝血過程，對炎癥反應的控制與干預甚少。事實上，炎癥反應參與血栓性疾病發(fā)生發(fā)展全過程，加重血栓性疾病的損傷，也是血栓性疾病致死率居高不下的重要原因。對NLRP3炎癥小體的深入研究，探討其介導的血栓性疾病的發(fā)生機制和炎癥損傷，可為未來的血栓性疾病防治提供新的思路與方法。