丁侶霞，趙 枰，陳 相*

(1 江蘇省如東縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科，如東 226400；2 江蘇省南通市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是起源于漿細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，漿細(xì)胞的異常增殖可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能異常，機(jī)體抗腫瘤的免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫為主，而淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答水平、維持免疫穩(wěn)定的重要細(xì)胞，其表型和功能上面的異?？蛇M(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞免疫監(jiān)視功能的缺陷，對(duì)惡變漿細(xì)胞的清除能力亦下降，因此，該疾病的產(chǎn)生及病情發(fā)展與機(jī)體免疫細(xì)胞數(shù)量及功能的異常有著緊密的聯(lián)系[1-2]。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MM患者淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，進(jìn)一步了解淋巴細(xì)胞亞群的變化，以期通過調(diào)節(jié)患者機(jī)體的細(xì)胞免疫功能來延長生存期并最終清除腫瘤負(fù)荷提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取南通市第一人民醫(yī)院2015年1月—2018年12月收治的MM患者39例(MM組)，男15例，女24例，年齡48～81歲，中位年齡64歲，均符合MM診斷標(biāo)準(zhǔn)；另選取24例同期體檢健康者(對(duì)照組)，男10例，女14例，年齡45～78歲，中位年齡60歲。兩組在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，具有可比性。研究對(duì)象在采血前均簽署知情同意書，并排除其他腫瘤、急慢性感染及自身免疫性疾病。

1.2 主要儀器和試劑 BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，熒光單克隆抗體試劑盒CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC、CD-3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC(中國北京同生時(shí)代生物技術(shù)有限公司)。

1.3 檢測方法 抽取空腹外周靜脈血2 mL，用EDTA-K2抗凝。采用免疫熒光法：先取兩支FACS專用試管，在流式管底部分別加入20 μL CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC和CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC試劑，采用反向移液技術(shù)在各流式管中加入50 μL抗凝全血，渦動(dòng)混勻3 s，室溫避光放置20 min，加1 mL溶血素，渦動(dòng)混勻10 s，再避光靜置10 min，500 g離心5 min，棄去上清液，加細(xì)胞染色緩沖液4 mL洗滌，500 g離心5 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌1次，加細(xì)胞染色緩沖液200 μL，混勻，上機(jī)，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Kolmogorov-Smirnov Z檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者外周血CD3、CD4細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；MM組患者CD8、CD16+56細(xì)胞比例較對(duì)照組高，CD19細(xì)胞、CD4/CD8比值較對(duì)照組下降，見表1。

表1 兩組患者淋巴細(xì)胞亞群水平比較(,%)

3 討論

MM是源于漿細(xì)胞的惡性疾病，在某種程度上，本身具有免疫抑制效應(yīng)和阻礙腫瘤細(xì)胞凋亡，有利于骨髓瘤細(xì)胞的存活。淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞，機(jī)體在抗腫瘤過程中T淋巴細(xì)胞和自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞有著重要的意義。T淋巴細(xì)胞具有殺傷靶細(xì)胞、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)等功能，其中，CD4+T細(xì)胞有輔助和誘導(dǎo)作用，并促進(jìn)CD8+T細(xì)胞吞噬活性，以提高抗腫瘤能力；CD8+T細(xì)胞可產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行清除，并協(xié)調(diào)CD4+T細(xì)胞。CD4/CD8比值在一定程度上反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，比值相對(duì)正?？鼓[瘤效應(yīng)最大，平衡一旦被打破，機(jī)體的抗腫瘤免疫會(huì)顯著降低，且利于腫瘤的生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。NK細(xì)胞被視為腫瘤免疫第一道防線的“效應(yīng)器”，殺傷力強(qiáng)，不受主要組織相容性復(fù)合體限制，不依賴于補(bǔ)體和抗體，也不需要外來抗原激活，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時(shí)，腫瘤細(xì)胞本身可對(duì)NK細(xì)胞產(chǎn)生多種抑制作用。B淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗體，抗原提呈及分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)等，發(fā)揮體液免疫的功能。根據(jù)淋巴細(xì)胞表面CD分子可分為：CD3+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、CD16+56+NK細(xì)胞等。CD3+T細(xì)胞又分為CD3+CD4+T細(xì)胞即CD4+輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞(Th細(xì)胞)和CD3+CD8+T細(xì)胞即CD8+抑制/殺傷T細(xì)胞(Ts細(xì)胞)，細(xì)胞亞群間相互協(xié)作、制約、平衡，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，比例失衡時(shí)，機(jī)體的免疫力降低，對(duì)腫瘤發(fā)生的控制力亦會(huì)降低[4-5]。近年來嵌合抗原受體正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果令人鼓舞，T細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)正在研究中。然而，由于固有免疫抑制網(wǎng)絡(luò)對(duì)細(xì)胞療法產(chǎn)生耐藥性仍是實(shí)現(xiàn)治愈MM的主要障礙。以過繼轉(zhuǎn)移T細(xì)胞為基礎(chǔ)同時(shí)深入研究嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)靶向MM。目前針對(duì)B細(xì)胞成熟抗原的CAR-T細(xì)胞研究已有初步進(jìn)展，但最終對(duì)CAR-T細(xì)胞療法的耐藥性仍存在問題。通過對(duì)MM患者外周血T細(xì)胞亞型改變的研究，可為其治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，MM患者CD8+T細(xì)胞較對(duì)照組明顯增高，表明機(jī)體的免疫功能受抑，機(jī)體原有的免疫調(diào)節(jié)能力降低，機(jī)體抗腫瘤的功能亦降低，促進(jìn)病情進(jìn)展、加重[6]。CD8+T與CD4+T細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)構(gòu)成了一種免疫平衡，維持正常的免疫功能，異常增高的CD8+T細(xì)胞使CD4+/CD8+的比例降低，平衡被打亂，這對(duì)MM患者進(jìn)行CD8+T細(xì)胞治療以重建免疫平衡可能會(huì)成為一個(gè)新的思路。CD16+56+NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用通過某種機(jī)制重整MM患者體內(nèi)的骨髓瘤細(xì)胞，其功能下降可能與疾病的進(jìn)展相關(guān)，在控制疾病方面具重要的意義，但這種機(jī)制尚不明確。MM患者NK細(xì)胞較對(duì)照組明顯降低，說明機(jī)體抗腫瘤的能力已經(jīng)被削弱，提示患者可能預(yù)后不良，對(duì)臨床評(píng)估預(yù)后有重要的價(jià)值。NK細(xì)胞的降低也可能與患者所處疾病時(shí)期有關(guān)。CD19是一種表達(dá)在前體細(xì)胞和成熟B細(xì)胞細(xì)胞膜上的表面抗原。它還表達(dá)于各種B細(xì)胞惡性腫瘤，包括B-急性淋巴母細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。針對(duì)CD19的CAR-T細(xì)胞療法是迄今為止應(yīng)用最廣泛、最成功的嵌合抗原受體。并且自體CD19 CAR-T細(xì)胞已被用于表達(dá)CD19的B細(xì)胞惡性腫瘤，并取得了巨大的成功[7]。本研究結(jié)果顯示MM患者CD19+B細(xì)胞較對(duì)照組明顯降低，提示患者體液免疫功能亦存在缺陷，可能的原因[8]：(1)MM常伴有異常單克隆免疫球蛋白增多，其Fc段可與正常B細(xì)胞表面Fc受體結(jié)合，阻止信號(hào)通路的刺激，反饋抑制正常B細(xì)胞分化成熟；(2)MM患者白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6大量分泌，引起肝細(xì)胞產(chǎn)生的C反應(yīng)蛋白增多，進(jìn)而抑制T輔助細(xì)胞的功能，IL-4產(chǎn)生受抑，干擾多克隆B細(xì)胞的激活；(3)骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)正常前B細(xì)胞凋亡，干擾正常多克隆B細(xì)胞的分化成熟。MM患者外周血多克隆B細(xì)胞的減少，導(dǎo)致體液免疫功能缺陷[9]。由于樣本量的問題可能使健康人群和MM患者的差異參數(shù)略微接近，在未來的研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，同時(shí)進(jìn)一步研究MM患者體內(nèi)T細(xì)胞亞群改變的潛在機(jī)制。

綜上所述，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MM患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的水平，了解患者機(jī)體的免疫狀態(tài)，通過T細(xì)胞來觀察細(xì)胞免疫功能、B細(xì)胞來觀察體液免疫功能、NK細(xì)胞來反映機(jī)體抗腫瘤的能力，便于及時(shí)了解患者的病情變化，為MM患者免疫治療策略提供指導(dǎo),為患者制定適合有效的診治方案及判斷預(yù)后提供依據(jù)。