羅遠(yuǎn)利 喬 斌 曹 進(jìn) 袁 勛 謝卓晏 楊安宇 胡興華 周志益 王志剛 任建麗

多模態(tài)分子成像是影像學(xué)發(fā)展的方向，是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診療的必要手段。其可整合各種分子成像技術(shù)，彌補(bǔ)單一成像方式的局限性［1-3］。超聲分子成像是分子影像學(xué)的重要分支，因其有成本低、安全性好、可對(duì)病灶組織進(jìn)行實(shí)時(shí)、便捷顯影等優(yōu)點(diǎn)備受臨床醫(yī)師青睞。傳統(tǒng)的微米級(jí)超聲造影劑雖然可有效增強(qiáng)超聲信號(hào)，但由于其直徑遠(yuǎn)大于血管內(nèi)皮間隙，僅能達(dá)到血池顯像。而液氣相變型造影劑可穿過(guò)血管內(nèi)皮間隙，可能成為理想的超聲造影劑［4］。由于超聲成像受穿透深度影響較大，而MRI不受穿透深度限制，且對(duì)軟組織有更好的成像效果，因此制備超聲/MRI雙模態(tài)成像造影劑具有重要臨床意義。釓劑是目前臨床最常用的MRI造影劑之一，釓離子（Cd3+）的4f層有7個(gè)未成對(duì)電子，具有很強(qiáng)的順磁特性，可極大地增強(qiáng)腫瘤組織的T1弛豫率［5］。將Gd3+整合到血卟啉單甲醚可減輕其毒性，增加其包封率，因此血卟啉單甲醚-釓（HMME-Gd）有成為MRI造影劑的潛力［6-7］。研究［8］證明，在低強(qiáng)度聚焦超聲（LIFU）的觸發(fā)或溫度升高的情況下，全氟戊烷（PFP）可由液態(tài)變?yōu)榉細(xì)鈶B(tài)，增強(qiáng)超聲成像信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)擬采用高生物安全性的脂質(zhì)體包裹HMME-Gd和PFP，構(gòu)建一種超聲/MRI雙模態(tài)成像的納米級(jí)造影劑即攜帶HMME-Gd的液態(tài)氟碳納米粒（HMME-Gd-PFPNPs），并觀(guān)察其體外超聲/MRI雙模態(tài)成像的效果，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供更多影像學(xué)依據(jù)，同時(shí)為新型超聲造影劑的設(shè)計(jì)提供新思路。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料

二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）、膽固醇（CH）均由西安瑞禧生物科技有限公司生產(chǎn)；HMME-Gd（麥迪鑫生物科技有限公司）；PFP（Strem Chemicals公司）；瓊脂糖（Life Technologies公司）；二甲基亞砜（DMSO）、三氯甲烷均由重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司生產(chǎn)。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器

倒置光學(xué)顯微鏡（Olympus IX71，日本Olympus公司）；粒徑分析儀（Zeta-sizer 3000HS，英國(guó)Malvern有限公司）；透射電子顯微鏡（Hitachi H-7600，日本Hitachi公司）；紫外分光光度計(jì)（SHIMADZU UV-2550，蘇州雨澤儀器有限公司）；聲振儀（Sonics＆Materials，美國(guó)Sonic公司）；彩色多普勒超聲診斷儀（MyLab 90，意大利百勝公司）；3.0 T磁共振成像儀（Verio-40690，西門(mén)子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司）；LIFU超聲儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）。

三、主要實(shí)驗(yàn)方法

1.HMME-Gd-PFPNPs的制備：稱(chēng)取10 mg DPPC、4 mg DSPE、3 mg DPPG、3 mg CH、2 mg HMME-Gd，充分溶解于10 ml三氯甲烷中，50℃水浴條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀工作1 h使溶液形成脂質(zhì)薄膜，并用4 ml PBS洗下脂質(zhì)薄膜。冰浴條件下，加入400 μl PFP，采用功率100 W的聲振儀聲振6 min。再用低溫離心機(jī)洗滌3次（8000 r/min，5 min，4℃），最后用4 ml PBS重懸，獲得HMME-Gd-PFPNPs。制備過(guò)程全程避光。

2.HMME-Gd-PFPNPs基本性質(zhì)檢測(cè)：采用倒置光學(xué)顯微鏡觀(guān)察HMME-Gd-PFPNPs的大小及分散性；將125.00 μg/ml的HMME-Gd-PFPNPs滴于銅網(wǎng)上，風(fēng)干成膜，采用透射電子顯微鏡觀(guān)察HMME-Gd-PFPNPs的表面形態(tài)；采用粒徑分析儀測(cè)量HMMEGd-PFPNPs的大小、分布及電位。

3.HMME-Gd包封率檢測(cè)：取1 mg HMME-Gd溶于DMSO中，并用DMSO將溶液稀釋成不同濃度（60.00 μg/ml、30.00 μg/ml、15.00 μg/ml、7.50 μg/ml、3.75 μg/ml）。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各濃度溶液的紫外全波長(zhǎng)，用吸光度（A411 nm）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；經(jīng)低溫離心機(jī)洗滌后保留上清液，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上清液在A(yíng)411 nm的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算上清液中HMME-Gd的含量，計(jì)算包封率，包封率=［（HMME-Gd投入量-上清液中HMME-Gd含量）/HMME-Gd投入量］×100%。

4.體外超聲成像：將250.00 μg/ml的HMME-Gd-PFPNPs通過(guò)不同功率［0 W/cm2（對(duì)照組）、0.8 W/cm2、1.6 W/cm2、2.4 W/cm2、3.2 W/cm2］LIFU輻照1 min后，置于瓊脂糖凝膠模型中，使用彩色多普勒超聲診斷儀觀(guān)察B模式（B-mode）及造影模式（CEUS-mode）超聲圖像。并采用DFY組織灰度定量軟件檢測(cè)B-mode及CEUS-mode超聲信號(hào)的灰度值。

5.體外MRI成像：采用PBS將HMME-Gd-PFPNPs稀釋為不同濃度（31.25μg/ml、62.50μg/ml、125.00μg/ml、250.00 μg/ml、500.00 μg/ml），以PBS為對(duì)照組，分別置于2 ml EP管內(nèi)，使用3.0 T磁共振成像儀采集T1加權(quán)圖像。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.2統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HMME-Gd-PFPNPs的基本性質(zhì)

制備的HMME-Gd-PFPNPs于倒置光學(xué)顯微鏡下呈形態(tài)規(guī)則、大小均一（圖1A）；于透射電子顯微鏡下呈黑色的球形結(jié)構(gòu)（圖1B）。粒徑分析儀測(cè)得HMMEGd-PFPNPs平均粒徑為（250.27±11.9）nm，平均電位為（-26.17±0.45）mV。見(jiàn)圖1C、D。

二、HMME-Gd的包封率

HMME-Gd在波長(zhǎng)為411 nm處出現(xiàn)最高峰（圖2）；將波長(zhǎng)設(shè)定在411 nm，選擇吸光度為0.2～0.8的數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖3），計(jì)算出HMME-Gd的包封率為（84.70±0.35）%。

三、體外超聲成像

隨著LIFU功率增加，B-mode及CEUS-mode的回聲均逐漸增強(qiáng)，且各實(shí)驗(yàn)組回聲均高于對(duì)照組，見(jiàn)圖4；B-mode及CEUS-mode超聲圖像的灰度值也逐漸增加，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)圖5。

四、體外MRI成像

隨著HMME-Gd-PFPNPs濃度增加，T1加權(quán)圖像信號(hào)逐漸增強(qiáng)。見(jiàn)圖6。

討 論

本實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)有分子影像探針的基礎(chǔ)上應(yīng)用生物相容性較好的脂質(zhì)體［9］作為殼膜材料，包裹PFP和HMME-Gd，利用薄膜水化法、乳化法制備了可進(jìn)行超聲/MRI雙模態(tài)成像的納米粒HMME-Gd-PFPNPs。脂質(zhì)體［10］的生物安全性良好，制備成納米粒之后，由于粒徑較小，表面積增大，可顯著增加細(xì)胞對(duì)其的攝取，同時(shí)保證納米粒在體內(nèi)不會(huì)對(duì)正常組織造成損害。血卟啉單甲醚（HMME）作為光敏劑，具有成分明確、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、光敏化作用強(qiáng)、在生物體清除速度快等特點(diǎn)［11-12］。目前，卟啉已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)各方面，金屬離子的摻入使卟啉在醫(yī)學(xué)影像學(xué)展現(xiàn)出了可觀(guān)的發(fā)展前景［13］。Mouraviev等［14］成功研制了摻入錳離子的卟啉，發(fā)現(xiàn)其可有效增強(qiáng)前列腺腫瘤的MRI成像；Zheng等［15］發(fā)現(xiàn)錳卟啉可通過(guò)MRI信號(hào)的變化來(lái)檢測(cè)溫度的細(xì)微變化。但過(guò)量的錳離子可對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生一定的副作用，這也是臨床上不采用錳離子作為MRI造影劑的原因之一。因此，本實(shí)驗(yàn)選用親和性較強(qiáng)的HMME螯合Gd3+，將其包載在脂質(zhì)體的磷脂雙分子層之間，憑借脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的親和力，使HMME-Gd在腫瘤區(qū)域大量積聚，并實(shí)現(xiàn)T1加權(quán)MRI成像，在腫瘤的影像學(xué)診斷方面有廣泛的應(yīng)用前景。而包載在HMME-Gd-PFPNPs內(nèi)核的PFP在常溫下為液態(tài)，可在LIFU輻照后轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)，促使納米粒逐漸膨脹實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)超聲成像［16］，且脂質(zhì)體碎片也無(wú)需生物降解。因此，將HMME-Gd和PFP包裹進(jìn)脂質(zhì)體內(nèi)制備成的納米探針生物安全性高，有望作為一種雙模態(tài)造影劑應(yīng)用于臨床。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)HMME-Gd-PFPNPs的物理性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HMME-Gd-PFPNPs呈棕褐色，顏色均勻，未見(jiàn)游離相。HMME-Gd-PFPNPs在光鏡下呈大小均一、形態(tài)規(guī)則及較好的分散性；電鏡下呈250 nm左右的類(lèi)圓形。粒徑分析儀測(cè)定其平均粒徑為（250.27±11.9）nm。體外超聲成像顯示，隨LIFU功率的增加，B-mode及CEUS-mode超聲圖像的回聲呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，而對(duì)照組（0 W/cm2）未顯影；定量分析顯示，與對(duì)照組（0 W/cm2）比較，隨著LIFU功率的增加，B-mode及CEUS-mode超聲圖像的灰度值也逐漸增加，且各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），表明HMME-Gd-PFPNPs成功包載了PFP，且在LIFU輻照下，由于超聲的機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)使納米粒內(nèi)部包裹的PFP發(fā)生液-氣相變，從而達(dá)到增強(qiáng)B-mode及CEUS-mode成像的效果。本實(shí)驗(yàn)后期還利用3.0 T磁共振成像儀評(píng)價(jià)HMME-Gd-PFPNPs體外MRI成像效果，發(fā)現(xiàn)隨HMME-Gd-PFPNPs濃度增加T1加權(quán)圖像信號(hào)逐漸增強(qiáng)，而對(duì)照組（PBS）未見(jiàn)明顯顯影，進(jìn)一步證實(shí)了HMME-Gd被成功包裹進(jìn)入HMME-Gd-PFPNPs。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)薄膜水化法、乳化法成功制備了包載HMME-Gd和PFP的納米粒HMME-Gd-PFPNPs，其形態(tài)較規(guī)則、大小較均一，在體外的超聲/MRI雙模態(tài)顯影效果均比較明顯，表明HMME-Gd-PFPNPs具有超聲/MRI雙模態(tài)成像的能力。本實(shí)驗(yàn)HMME-Gd-PFPNPs主要依賴(lài)被動(dòng)靶向（增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)）聚集于腫瘤部位，后期實(shí)驗(yàn)可連接特異性配體（如腫瘤歸巢穿膜肽）或天然細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)提高納米粒主動(dòng)靶向的能力，為下一步體內(nèi)外腫瘤的精準(zhǔn)診療提供新方向。