賴增嬌，滕秀英，劉國斌

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼 028000；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150001；3.內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)第一人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼 028000）

急性脊髓損傷是臨床常見的急重癥,多發(fā)生于交通事故、高處墜落等事故中,可影響肢體功能,甚至可導(dǎo)致癱瘓。調(diào)查［1］顯示,全球急性脊髓損傷的發(fā)病率約為每百萬人中有3.6～195例,且該病的發(fā)生率仍逐漸增長,由此所致的肢體運(yùn)動(dòng)障礙和死亡人數(shù)也越來越多,已引起高度重視。目前臨床上對(duì)此類患者多采用減壓手術(shù)或營養(yǎng)脊髓神經(jīng)、促脊髓神經(jīng)生長等保守治療,有一定療效,但仍存在較大的提升空間。蒙藥珍寶丸具有安神活絡(luò)、清熱涼血等功效,在既往研究中被證實(shí)對(duì)急性脊髓損傷具有輔助治療作用［2］,可改善患者的康復(fù)效果,且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)該藥物可改善急性脊髓損傷大鼠模型的行為學(xué)［3］。電針是基于經(jīng)絡(luò)學(xué)說的一種脈沖電刺激療法,可改善血流、增強(qiáng)損傷的脊髓神經(jīng)的自我修復(fù)功能,還可改善患者的運(yùn)動(dòng)功能［4］。有研究［5-7］提示,5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、巢蛋白 （Nestin）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)是脊髓神經(jīng)細(xì)胞生長、增殖和分化的重要參考指標(biāo),在急性脊髓損傷后上述指標(biāo)表達(dá)均有所升高以促進(jìn)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的生長、增殖和分化,加快損傷組織修復(fù),已被作為急性脊髓損傷的治療靶點(diǎn)應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中［8］。為嘗試探討增療效的方案,本研究特嘗試將蒙藥珍寶丸與電針聯(lián)用治療急性脊髓損傷大鼠,并觀察其效果,探討對(duì)脊髓損傷組織BrdU、Nestin、GFAP表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 45只成年SD大鼠,雌雄各半,無特定病原體（SPF）級(jí),10周齡,體質(zhì)量180～230 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （京）2018-0001。

1.2 藥物與試劑 蒙藥珍寶丸（內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字Z1502410,規(guī)格6 g/丸,批號(hào)171205003）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所,批號(hào)1706135A）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的生物素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色試劑盒（美國Roche公司,批號(hào)1710178）；兔抗鼠血管性血友病因子（vWF）、BrdU、Nestin、GFAP單克隆抗體和山羊抗兔vWF、BrdU、Nestin、GFAP多克隆抗體（辣根過氧化物酶標(biāo)記）（美國Abcam公司,批號(hào)1710115002、1711125001、1711017010、1710018007、1710014007、1712017008、1712151002、1711019004）；RNAiso Plus提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司,批號(hào)1710145001）；BrdU、Nestin、GFAP、內(nèi)參（βactin）引物委托深圳晶美生物技術(shù)有限公司合成；蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司,批號(hào)170812）。

1.3 儀器 G-6805型電針治療儀（北京科苑達(dá)醫(yī)療器械有限公司）；不銹鋼打擊桿（天津州杰技術(shù)發(fā)展有限公司定制）；Magnetion （德國西門子公司）；CH20 BIM型光學(xué)顯微鏡、BX63型熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；7500型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）；Allegra X-15R型低溫高度離心機(jī)（美國Beckman公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型蛋白質(zhì)凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠系統(tǒng)成像分析軟件（美國Alpha公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 取45只SD成年大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、丸劑組、電針組、聯(lián)合組。以水合氯醛腹腔注射麻醉,仰臥位固定大鼠于手術(shù)臺(tái)上,常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備,沿著T7～T11椎體中線做縱行切口,切開2 cm,逐層切開皮膚和椎旁肌肉,注意避免損傷血管,接著切除T8～T10棘突和椎板,沖洗傷口后壓迫止血。取10 cm不銹鋼打擊桿垂直下降擊打暴露脊髓中心的位置,注意每只大鼠建模時(shí)打擊高度需一致,均為10 cm,打擊物質(zhì)量為10 g。建模后出現(xiàn)痙攣性擺尾反射,雙后肢回縮性撲動(dòng),遲緩性癱瘓［9］,即為造模成功。與此同時(shí),正常對(duì)照組僅暴露脊髓,無擊打操作。

2.2 治療 丸劑組予以蒙藥珍寶丸治療,取蒙藥珍寶丸以開水浸泡,制作懸液,劑量0.54 g/kg,溶于1 mL/100 g大鼠體質(zhì)量的溫開水中灌胃,于術(shù)后23 h予以治療,此后每間隔24 h給藥1次,共1周；電針組予以電針干預(yù),選取大椎穴（位于第7頸椎和第1胸椎間背部正中）、命門穴（位于第2腰椎棘突下）,大椎穴向下斜刺、命門穴向上斜刺,分別接入陽極、陰極,持續(xù)脈沖電流刺激,于術(shù)后23 h予以治療,針刺30 min,留針30 min,此后每間隔24 h治療1次,共1周；聯(lián)合組予以蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針治療,具體方法分別同丸劑組、電針組。

2.3 治療前后行為學(xué) 分別于治療前（確認(rèn)建模成功后,正常對(duì)照組同一時(shí)刻）、治療后采用后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（Basso Beattie Bresnahan,BBB）量表評(píng)價(jià)［10］,評(píng)分范圍為0～21分,0分表示后肢完全無活動(dòng),21分表示后肢活動(dòng)完全正常,運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分量表評(píng)分越高認(rèn)為行為學(xué)越佳,每只大鼠均評(píng)價(jià)3次,每2次時(shí)間間隔至少5 min,求平均值。

2.4 治療后損傷脊髓組織病理變化和脊髓細(xì)胞凋亡率 采用HE染色法觀察損傷脊髓組織病理變化,采用TUNEL法檢測(cè)脊髓細(xì)胞凋亡率。常規(guī)腹腔麻醉,取T11～T13段損傷部位的脊髓組織,留取樣本,保存于-80 ℃的超低溫冰箱中。取1 mg組織固定、沖洗、脫水,二甲苯透明處理后石蠟包埋,制作石蠟切片,層厚4 μm,嚴(yán)格按照HE染色法試劑盒操作,最后以中性樹膠封固,于光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。將無明顯神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為0級(jí),將有散在、輕微神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為1級(jí),將有片狀神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為2級(jí),將有嚴(yán)重神經(jīng)細(xì)胞損傷劃為3級(jí)。同法取組織制作石蠟切片,嚴(yán)格按照TUNEL檢測(cè)試劑盒操作,于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)不重復(fù)的視野計(jì)算陽性染色細(xì)胞率,即為脊髓細(xì)胞凋亡率。

2.5 治療后損傷區(qū)域血管生成 采用免疫熒光染色法檢測(cè)。取待檢測(cè)組織,脫水包埋,液氮速凍,切片后平鋪于防脫載玻片上。室溫下干燥,于搖床上振搖清洗3次,5 min/次,透膜后采用PBS清洗3次,5 min/次。加入2 mol/L鹽酸溶液,孵育30 min、37 ℃。加入0.1 mmol/L硼酸鈉溶液,中和反應(yīng)10 min,采用PBS清洗3次,5 min/次。以10%濃度小牛血清蛋白封閉,加入一抗（兔抗鼠vWF單克隆抗體）,濕盒孵育,4 ℃過夜,PBS清洗后加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔vWF多克隆抗體）,濕盒孵育,37 ℃、1 h,PBS清洗。吹干,封片,4 ℃避光,干燥后以熒光顯微鏡采集圖像,統(tǒng)計(jì)vWF陽性血管數(shù)目。

2.6 損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。同法取組織,采用RNAiso Plus提取總RNA,配置反應(yīng)體系,共10 μL,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參,取待檢測(cè)基因的上下游引物配置反應(yīng)體系,共25 μL,實(shí)施PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃ （5 s）、60 ℃ （30 s）,共40個(gè)循環(huán),最后55 ℃ （90 s）。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物實(shí)施凝膠電泳驗(yàn)證,并繪制溶解曲線,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)采用Western blot法檢測(cè)。取組織,液氮冷凍,加入經(jīng)過預(yù)冷處理的裂解液,冰上快速勻漿并裂解1 h。將產(chǎn)物離心分析,并進(jìn)行蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記處理。加入一抗（1 ∶1 000）,濕盒孵育,4 ℃過夜,PBS沖洗3次,5 min/次；加入二抗（1 ∶5 000）,室溫孵育1 h,PBS沖洗3次,5 min/次。計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以（）表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn),配對(duì)t檢驗(yàn)檢測(cè)本組內(nèi)治療前后資料。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 治療前后各組行為學(xué) 40只建模大鼠中共有33只建模成功,7只死亡,推測(cè)由于脊髓損傷過重所致,建模成功率為82.50% （33/40）,將建模成功大鼠隨機(jī)分為模型組（8只）、丸劑組（8只）、電針組（9只）、聯(lián)合組（8只）。治療前模型組BBB評(píng)分低于正常對(duì)照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯(lián)合組均與模型組相近（P＞0.05）,治療后模型組BBB評(píng)分較治療前下降（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯(lián)合組BBB評(píng)分均較治療前升高（P＜0.01）；治療后組間BBS評(píng)分比較,模型組低于正常對(duì)照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組、聯(lián)合組均高于模型組（P＜0.01）,聯(lián)合組高于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖1。

圖1 治療前后各組行為學(xué)Fig.1 Behavior of each group before and after treatment

3.2 治療后各組損傷脊髓組織病理變化和脊髓細(xì)胞凋亡率 正常對(duì)照組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常,灰質(zhì)未見彌漫性水腫；模型組可見脊髓灰質(zhì)有大量、較大空泡形成,脊髓組織的正常結(jié)構(gòu)被破壞,白質(zhì)中可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量增生,受損的脊髓白質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見嚴(yán)重微囊性病變,且神經(jīng)元細(xì)胞可見嚴(yán)重的崩解、核碎裂表現(xiàn),大量炎性細(xì)胞浸潤；丸劑組和電針組可見脊髓灰質(zhì)有部分、大空泡形成,白質(zhì)可見神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,受損的脊髓白質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見微囊性病變,且部分神經(jīng)元細(xì)胞可見崩解、核碎裂表現(xiàn),部分炎性細(xì)胞浸潤；聯(lián)合組可見脊髓灰質(zhì)少量、大空泡形成,白質(zhì)可見較少神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,受損的脊髓白質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見較少微囊性病變,較少神經(jīng)元細(xì)胞可見崩解、核碎裂表現(xiàn),少量炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 各組損傷脊髓組織病理變化（HE，×40）Fig.2 Pathological changes of spinal cord injury tissue in each group （HE，×40）

治療后模型組損傷脊髓組織分級(jí)高于正常對(duì)照組（P＜0.05）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組均低于模型組（P＜0.05）,且聯(lián)合組低于丸劑組、電針組（P＜0.05）。見表2。治療后模型組損傷脊髓細(xì)胞凋亡率高于正常對(duì)照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組損傷脊髓細(xì)胞凋亡率均低于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組損傷脊髓細(xì)胞凋亡率低于丸劑組、電針組 （P＜0.01）。見圖3。

3.3 治療后損傷區(qū)域血管生成 治療后模型組vWF陽性血管數(shù)目多于正常對(duì)照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組vWF陽性血管數(shù)目均多于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組vWF陽性血管數(shù)目多于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖4～5。

表2 各組損傷脊髓組織病理分級(jí)（）Tab.2 Pathological grade of spinal cord injury tissue in each group （）

表2 各組損傷脊髓組織病理分級(jí)（）Tab.2 Pathological grade of spinal cord injury tissue in each group （）

注：與正常對(duì)照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,#P＜0.05；與丸劑組比較,&P＜0.05；與電針組比較,￥P＜0.05。

圖3 各組治療后損傷脊髓細(xì)胞凋亡率Fig.3 Post-treatment apoptosis rates of spinal cord injury tissue cells in each group

3.4 治療后各組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、GFAPmRNA表達(dá) 治療后模型組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)均高于正常對(duì)照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)均高于丸劑組、電針組（P＜0.01）。見圖6。

圖4 vWF陽性血管數(shù)目（免疫熒光染色，×100）Fig.4 Number of vWF positive blood vessel （immunofluorescence staining，×100）

圖5 各組治療后vWF陽性血管數(shù)目Fig.5 Post-treatment number of vWF positive vessels in each group

3.5 治療后各組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá) 治療后模型組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)均高于正常對(duì)照組（P＜0.01）,丸劑組、電針組和聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)均高于模型組（P＜0.01）,且聯(lián)合組損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)均高于丸劑組、電針組 （P＜0.01）。見圖7～8。

4 討論

急性脊髓損傷后,局部神經(jīng)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)某些病理性變化,如新血管生成、干細(xì)胞被激發(fā)并向損傷部位遷移等,可以為損傷組織的修復(fù)創(chuàng)造有利條件。但是在此過程中,由于某些因素出現(xiàn)拮抗作用,影響損傷脊髓組織的自我修復(fù),如興奮性氨基酸的毒性作用、自由基大量產(chǎn)生、損傷所致的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)等［11-12］。Wan等［13］研究指出,急性脊髓損傷后常規(guī)的治療措施難以達(dá)到理想的效果,患者往往需要較長時(shí)間的恢復(fù)過程,且肢體功能受損嚴(yán)重,給患者的生活質(zhì)量造成極大的影響。故而該領(lǐng)域工作者需積極探討新的治療方案促進(jìn)急性脊髓損傷患者脊髓功能快速恢復(fù),改善療效。

圖6 各組治療后損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA表達(dá)Fig.6 Post-treatment expressions of BrdU， Nestinand GFAPmRNA in spinal cord injury tissue of each group

圖7 Western blot檢測(cè)各組治療后損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)Fig.7 Detection of post-treatment expressions of BrdU，Nestin and GFAP proteins in spinal cord injury tissue of each group by Western blot

圖8 各組治療后損傷脊髓組織BrdU、Nestin、GFAP蛋白表達(dá)Fig.8 Post-treatment expressions of BrdU，Nestin and GFAP proteins in spinal cord injury tissue of each group

神經(jīng)行為學(xué)功能障礙是急性脊髓損傷的共同特性,已成為臨床醫(yī)師關(guān)注的重點(diǎn)問題。本研究中模型組BBB評(píng)分顯著下降,遠(yuǎn)不如正常對(duì)照組,而丸劑組、電針組和聯(lián)合組治療后BBB評(píng)分均升高且均高于模型組,聯(lián)合組BBB評(píng)分明顯高于丸劑組和電針組,提示蒙藥珍寶丸、電針治療急性脊髓損傷均可改善急性脊髓損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能,且蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針的效果更佳。根據(jù)蒙醫(yī)理論,急性脊髓損傷屬于白脈病,可出現(xiàn)水腫、血液循環(huán)障礙和神經(jīng)損傷等表現(xiàn),從而損傷白脈,需針對(duì)病因?qū)嵤┲委?。蒙藥珍寶丸具有清熱除濕、舒筋活絡(luò)、安神寧心等功效,對(duì)白脈病療效理想。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),蒙藥珍寶丸不僅有助于增強(qiáng)受損的脊髓神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)功能,改善局部微循環(huán),還可清除氧自由基、控制炎癥反應(yīng),最終達(dá)到加快急性脊髓損傷恢復(fù)的目的［14-15］。電針刺激大椎穴和命門穴可舒筋活絡(luò)、疏通血脈,濡養(yǎng)經(jīng)脈氣血,在外力損傷督脈所致的氣血逆亂、瘀阻經(jīng)絡(luò)病癥中療效確切。陳溫慈等［16］研究表明,電針刺激急性脊髓損傷大鼠的大椎穴和命門穴可溫煦氣血,濡養(yǎng)肢體筋脈,疏利關(guān)節(jié),益氣活血。因此將蒙藥珍寶丸與電針刺激大椎穴和命門穴聯(lián)用治療急性脊髓損傷可獲得理想的效果。本研究中病理學(xué)觀察、分級(jí)和脊髓細(xì)胞凋亡率對(duì)比結(jié)果也顯示丸劑組、電針組和聯(lián)合組均較模型組顯著改善,提示蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針治療急性脊髓損傷效果良好,可減輕病理學(xué)改變程度,減少脊髓細(xì)胞凋亡,提示該方案具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

急性脊髓損傷后新血管生成是快速恢復(fù)的有利條件,而其中與相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控關(guān)系緊密,可增加vWF表達(dá),促進(jìn)新血管生成。BrdU屬于一種胸腺脫氧核苷類似物,在細(xì)胞增殖周期S期可整合進(jìn)入細(xì)胞核的脫氧核糖核苷酸中,可反映細(xì)胞增殖狀態(tài),其表達(dá)越高意味著細(xì)胞增殖越快,從而為新血管的生成提供條件［17］。Nestin屬于一種中間絲類型蛋白,主要在神經(jīng)上皮干細(xì)胞特異性表達(dá),可促進(jìn)神經(jīng)元分化,增強(qiáng)損傷的脊髓神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)作用,在急性脊髓損傷患者治療中可將其作為靶點(diǎn),上調(diào)其表達(dá)以改善脊髓功能。GFAP可與肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞膜相結(jié)合,增強(qiáng)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的遷移和黏附能力,并且還與蛋白激酶有密切關(guān)系,可共同參與脊髓損傷細(xì)胞的修復(fù)和功能改善［18］。有研究［19-21］顯示,急性脊髓損傷大鼠中損傷的脊髓組織中UrdU、Nestin和GFAP均較正常大鼠高表達(dá),而予以對(duì)癥治療可上調(diào)其表達(dá),提示在急性脊髓損傷治療中應(yīng)上調(diào)UrdU、Nestin和GFAP表達(dá),以改善脊髓功能。本研究中,模型組vWF陽性血管數(shù)目、損傷脊髓組織BrdU、 Nestin、 GFAPmRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組,提示機(jī)體的自我修復(fù)機(jī)制可能啟動(dòng),進(jìn)而保證急性脊髓損傷的恢復(fù),但其作用不甚理想,遠(yuǎn)不如丸劑組、電針組和聯(lián)合組,且聯(lián)合組的作用最佳,表明蒙藥珍寶丸、電針夾脊穴和命門穴均可刺激急性脊髓損傷大鼠新血管生成,上調(diào)損傷的脊髓組織中BrdU、 Nestin、GFAPmRNA及蛋白表達(dá),從而發(fā)揮加快恢復(fù)的作用。

綜上所述,蒙藥珍寶丸、電針治療急性脊髓損傷大鼠均可改善其行為學(xué)、減輕病理損傷,并且均可促進(jìn)新血管生成,二者聯(lián)用的效果明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用,且很可能是通過上調(diào)損傷脊髓組織的BrdU、Nestin、GFAP表達(dá)實(shí)現(xiàn)此作用的。本研究為蒙藥珍寶丸聯(lián)合電針在急性脊髓損傷患者臨床治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),提供了一種高效可行的治療方案,但該方案對(duì)損傷脊髓組織的BrdU、Nestin、GFAP表達(dá)上調(diào)的具體機(jī)制尚不明確,仍需進(jìn)一步研究探討,以加深人們對(duì)其認(rèn)識(shí),更好地在臨床中推廣使用。