齊秀春，陳 昕，曹玉凈，李 揚(yáng)，艾進(jìn)偉，李浩亮

（河南省中醫(yī)院骨傷科，河南鄭州 450002）

創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎是踝關(guān)節(jié)骨折治療后容易發(fā)生的一種并發(fā)癥,主要呈現(xiàn)出嚴(yán)重的腫脹和疼痛,危害踝關(guān)節(jié)的功能,影響患者的身體健康和正常生活［1］。它主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的變性和破壞,受損的軟骨組織修復(fù)與再生能力較弱,因此創(chuàng)傷后造成的軟骨損傷及退變成為臨床修復(fù)的難題［2］。雷公藤多苷是從衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.中提取的一種水-氯仿提取物,具有較強(qiáng)的抗炎及免疫抑制作用［3-4］。因此,本研究擬通過(guò)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并加入白介素1β（IL-1β）模擬創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎時(shí)軟骨細(xì)胞的環(huán)境,檢測(cè)不同濃度雷公藤多苷對(duì)軟骨細(xì)胞活性和功能的影響,以期為創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠（雄性,4周,體質(zhì)量60～80 g）購(gòu)自河南省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（使用許可證號(hào)SYXK （豫）2016-0009）。

1.2 藥物與試劑 雷公藤多苷片購(gòu)于江蘇美通制藥有限公司（批號(hào)151206,規(guī)格10 mg/片）,加入少量DMEM培養(yǎng)液充分溶解,以0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別稀釋至5、10、25、50 μg/mL。DMEM低糖培養(yǎng)基（批號(hào) C11885500BT ）、胎牛血清 （批號(hào)C20012500BT）、含50 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的雙抗（批號(hào)15140-122）、胰蛋白酶（批號(hào)25200-056）購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；氯化鋰（LiCl）溶液（批號(hào)R00473,規(guī)格1 mol/L）購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司,蒸餾水稀釋至20 mmol/L；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)KGA317）、LDH檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)KGT02424）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)KGA1012）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Col-Ⅱ（批號(hào)69-98687）、葡萄糖氨基聚糖（glycosaminoglycan,GAG）（批號(hào)69-98547）、COX-2 （批號(hào)69-36228）、iNOS （批號(hào)69-98762）ELISA檢測(cè)試劑盒,BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)69-97682）購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司；ECL顯色劑（批號(hào)P0018FS）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠MMP13 （批號(hào)ab219620）、Aggrecan（Acan）（批號(hào)ab186414）、Sox9 （批號(hào)ab185966）單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（批號(hào)ab172730）購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

2 方法

2.1 軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 將SD大鼠處死,消毒后剪開膝關(guān)節(jié),用刀片刮取關(guān)節(jié)表面軟骨,放入加有PBS的培養(yǎng)皿中,清除表面血污及附著組織,用PBS溶液沖洗后,將軟骨剪切到1 mm3大小的組織塊放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi),加入0.25% 胰蛋白酶在恒溫?fù)u箱中37 ℃下?lián)u蕩消化30 min。棄去上清液,加入2 mg/mL的Ⅱ型膠原酶,放入恒溫?fù)u箱中37 ℃下?lián)u蕩消化2～4 h,低溫離心5 min后棄去上清液,DMEM培養(yǎng)液沖洗3次,加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將含有完全培養(yǎng)基的組織塊均勻鋪在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),再加入適量完全培養(yǎng)基,繼續(xù)放在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每2～3天換液1次,待組織塊中軟骨細(xì)胞長(zhǎng)出后,傳代培養(yǎng),取第3代軟骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組、造模及CCK-8檢測(cè)軟骨細(xì)胞存活率取第3代軟骨細(xì)胞,以2×103/孔接種于96孔板中,分別用不同濃度雷公藤多苷（0、5、10、25、50 μg/mL）處理24 h,其中未加雷公藤多苷的細(xì)胞組作為對(duì)照組,每孔加入20 μL CCK-8溶液,用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照,繼續(xù)孵育培養(yǎng)2～4 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)450 nm處的吸光度值（OD）。細(xì)胞存活率=［（OD給藥組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）］×100%。第3代軟骨細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組（10 ng/mL IL-1β）、雷公藤多苷組 （10、50 μg/mL雷公藤多苷）、LiCl組（50 μg/mL雷公藤多苷+20 mmol/L LiCl）,加入10 ng/mL IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞24 h,給藥組加入相應(yīng)藥物繼續(xù)處理24 h。按上述CCK-8法,檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。

2.3 LDH釋放率檢測(cè) 取第3代軟骨細(xì)胞,以5×104/孔的濃度接種于培養(yǎng)瓶中,按照“2.2” 項(xiàng)下分組處理細(xì)胞,根據(jù)LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中LDH釋放量。LDH釋放率=［細(xì)胞上清液中LDH水平/ （細(xì)胞上清液LDH水平+細(xì)胞裂解液中LDH水平）］×100%,結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組LDH釋放率的比值來(lái)表示。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取第3代軟骨細(xì)胞,按照 “2.2” 項(xiàng)下分組處理細(xì)胞后,0.25%胰蛋白酶加入到各組的培養(yǎng)皿中消化收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作,將細(xì)胞重懸后加入Annexin V-FITC和PI,室溫避光條件下分別孵育15、5 min。最后,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.5 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中COX-2和iNOS的水平 取第3代軟骨細(xì)胞,按照“2.2” 項(xiàng)下分組處理細(xì)胞后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中COX-2和iNOS的水平。

2.6 葡萄糖氨基聚糖 （glucose aminoglycan，GAG）水平檢測(cè) 取第3代軟骨細(xì)胞,按照“2.2”項(xiàng)下分組處理細(xì)胞后,換液時(shí)的培養(yǎng)液100 μL,加入至含1.5 mL 1.5% 阿利新藍(lán)染液的試管內(nèi),室溫放置10 min,酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處吸光度值（OD）。以硫酸軟骨素制作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照曲線,計(jì)算出各組細(xì)胞培養(yǎng)液GAG水平。

2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取第3代軟骨細(xì)胞,按照“2.2” 項(xiàng)下分組處理細(xì)胞后,收集細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,每孔上樣量為20 μg,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,將PVDF膜于5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過(guò)夜,加入Wnt3a （1 ∶800）和β-catenin抗體 （1 ∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗滌,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG搖床孵育1 h,常規(guī)洗膜化學(xué)發(fā)光試劑顯色。Quantity One軟件分析灰度值。

2.8 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 取第3代軟骨細(xì)胞,按照“2.2” 項(xiàng)下分組處理細(xì)胞后,收集細(xì)胞并提取總RNA,按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)錄cDNA,引物序列為MMP13 （正向5′-CTTCCCAACCGTATTGATGC-3′,反向5′-TTTGGAAGACCCAGTTCAGA-3′）； Acan（正向 5′-TCGAGGACA GCGAGGCC-3′,反向 5′-TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA-3′）； Sox-9 （正向 5′-TACGACTGGAC GCTGGTGCC-3′,反向 5′-CCGTTCTTCACCGACTTCCTCC-3′）； GAPDH（正向5′-ATG TTCGTCATGGGTGTGAA-3′,反向5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。取cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、30 s；變性65 ℃、3 s,退火72 ℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算出各個(gè)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)量資料以（）表示,使用GraphPad Prism 7.0制圖,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖和毒性影響 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,雷公藤多苷（5、10、25、50 μg/mL）作用之后,軟骨細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)LDH水平無(wú)變化（圖1A～1B）。與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）LDH釋放升高（P＜0.05）；與模型組比較,雷公藤多苷（50 μg/mL）干預(yù)后,細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）,LDH釋放降低（P＜0.05）（圖1C～1D）。

3.2 雷公藤多苷抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞凋亡率上升（P＜0.05）,而雷公藤多苷作用之后,細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。結(jié)果表明,雷公藤多苷可以降低IL-1β 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。見圖2。

3.3 雷公藤多苷緩解IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退化及炎癥反應(yīng) 與對(duì)照組比較,模型組GAG水平降低,而雷公藤多苷作用之后,細(xì)胞中GAG水平上升（圖3A,P＜0.05）；與對(duì)照組比較,模型組COX-2和iNOS水平升高,而雷公藤多苷作用之后,細(xì)胞中COX-2和iNOS水平降低（圖3B,P＜0.05）；與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞中MMP13 mRNA升高,Acan、 Sox-9 mRNA下降,而雷公藤多苷作用后,細(xì)胞中MMP13 mRNA降低,Acan、Sox-9 mRNA上升（圖3C,P＜0.05）。結(jié)果表明,雷公藤多苷可以降低IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨退化及炎癥反應(yīng)。

3.4 雷公藤多苷抑制IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活 Western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞中Wnt3a和β-catenin的表達(dá)上調(diào),而雷公藤多苷作用之后細(xì)胞中Wnt3a和β-catenin表達(dá)下降（P＜0.05）,見圖4。結(jié)果表明雷公藤多苷可以抑制IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活。

圖1 雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖和毒性影響（n=3）Fig.1 Effects of tripterygium glycosides on the proliferation and cytotoxicity of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

圖2 雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響（n=3）Fig.2 Effects of tripterygium glycosides on the apoptosis of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

3.5 雷公藤多苷通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷 為了檢測(cè)雷公藤多苷是否通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷,將Wnt/β-catenin通路激動(dòng)劑LiCl作用于雷公藤多苷干預(yù)的IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞。Western blot結(jié)果表明,LiCl作用之后細(xì)胞中Wnt3a和β-catenin的表達(dá)上升（圖5A,P＜0.05）；與雷公藤多苷組比較,LiCl激動(dòng)劑作用之后細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）,LDH釋放上升（P＜0.05）,細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）,GAG水平及Acan、Sox-9 mRNA降低 （P＜0.05）,MMP13 mRNA及COX-2、iNOS水平上升（P＜0.05）,均逆轉(zhuǎn)了雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的緩解作用。結(jié)果表明,雷公藤多苷通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。

4 結(jié)論

圖3 雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退化及炎癥反應(yīng)的影響（n=3）Fig.3 Effects of tripterygium glycosides on the degeneration and inflammation of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

圖4 雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的影響（n=3）Fig.4 Effects of tripterygium glycosides on Wnt/β-catenin Pathway of IL-1β-induced chondrocytes （n=3）

關(guān)節(jié)軟骨是固態(tài)的結(jié)締組織,由分布在其中的特異性軟骨細(xì)胞及大量的細(xì)胞外基質(zhì)組成。軟骨基質(zhì)中含有水分、蛋白多糖和膠原纖維,還包括一些脂肪、蛋白質(zhì)、糖蛋白和無(wú)機(jī)鹽等［5-6］。創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致的軟骨、滑膜損傷及變性將導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙,其中炎癥是創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎病理變化過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)［7］。因此,本研究通過(guò)IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞模擬創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的軟骨細(xì)胞環(huán)境,探究雷公藤多苷對(duì)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用及其潛在的分子機(jī)制。

雷公藤多苷具有抗炎、抗腫瘤和免疫抑制等多種生物功能,其活性主要由二萜內(nèi)酯、生物堿和三萜等多種有效成分協(xié)同產(chǎn)生。在臨床上,雷公藤多苷主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性腎小球腎炎和強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療［8］。有研究表明,使用雷公藤多苷治療關(guān)節(jié)炎模型大鼠之后,大鼠的足腫脹度、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)均顯著降低,且其機(jī)制可能是雷公藤多苷上調(diào)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及炎性細(xì)胞抑制因子白介素10水平［9］。環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase-2,COX-2）是前列腺素合成和起始步驟的關(guān)鍵酶,而前列腺素與滑膜、軟骨破壞,關(guān)節(jié)周圍組織炎癥等病變過(guò)程息息相關(guān)［10］。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶 （induced nitric oxide synthase,iNOS）在軟骨細(xì)胞損傷和退變中發(fā)揮重要作用。目前很多研究證實(shí),iNOS抑制劑的應(yīng)用有助于炎性軟骨代謝的恢復(fù)。iNOS抑制劑能抑制iNOS的表達(dá),減少軟骨細(xì)胞產(chǎn)生NO的同時(shí),抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和膠原酶的活性及基因表達(dá),使軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖的能力逐漸恢復(fù),并能抑制自由基和IL-1β 誘發(fā)的軟骨細(xì)胞凋亡［11-12］。葡萄糖氨基聚糖（GAG）是軟骨基質(zhì)的主要成分,軟骨基質(zhì)合成關(guān)鍵基因Acan、Sox-9蛋白等的水平均作為關(guān)節(jié)炎癥中軟骨損傷的指標(biāo)受到廣泛的研究［13-14］。另外,MMP13是唯一能夠裂解膠原分子中三維螺旋結(jié)構(gòu)的酶,對(duì)膠原具有特異性,軟骨破壞中研究較多［15］。本研究表明,IL-1β誘導(dǎo)之后,軟骨細(xì)胞的增殖活性降低,細(xì)胞凋亡率增加,COX-2,iNOS的表達(dá)水平提高,GAG、Acan和Sox-9的水平降低,而雷公藤多苷作用之后細(xì)胞活性上升,炎性相關(guān)COX-2、iNOS的表達(dá)水平降低,GAG、Acan和Sox-9的水平提高。結(jié)果表明,雷公藤多苷能夠保護(hù)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨損傷。

圖5 雷公藤多苷通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路緩解IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷（n=3）Fig.5 Alleviation of IL-1β-induced chondrocyte injury by tripterygium glycosides via Wnt/β-catenin pathway inhibition （n=3）

Wnt信號(hào)通路包含多種通路系統(tǒng),調(diào)節(jié)生細(xì)胞形態(tài)與功能的分化與維持、免疫、應(yīng)激等過(guò)程,其中典型的Wnt/β-catenin通路在關(guān)節(jié)炎中具有至關(guān)重要的作用［16］。Wnt/β-catenin通路的激活增強(qiáng)腫瘤壞死因子（TNF）-α 的分泌,促進(jìn)MMP的生成,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解,引起關(guān)節(jié)軟骨破壞。有研究表明,雷公藤多苷能夠通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路延緩糖尿病腎病的進(jìn)展［17］。為了檢測(cè)Wnt/β-catenin通路的抑制是否同樣參與了雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,我們將Wnt/β-catenin通路的激活劑作用于雷公藤多苷處理的軟骨細(xì)胞損傷模型中,結(jié)果表明,Wnt/β-catenin通路的激活劑反轉(zhuǎn)了雷公藤多苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。

綜上所述,雷公藤多苷可能通過(guò)抑制Wnt/βcatenin通路反轉(zhuǎn)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性降低、LDH分泌和細(xì)胞凋亡率的增加,以及GAG、MMP13、Acan、Sox-9水平的降低和COX-2,iNOS水平的上升等,以期這一結(jié)果為創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的臨床治療提供理論支持。