熊延靖，吳艷紅，陳 京

（皖南醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)與醫(yī)學(xué)免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖 241002）

白色念珠菌Candida albicans是常駐于人體內(nèi)的一種條件致病性真菌。目前隨著抗癌藥物、HIV感染、免疫抑制劑的大量使用等引起的免疫功能下降,以及侵入性治療如血透、插管技術(shù)等廣泛應(yīng)用,均可能造成全身或局部真菌感染。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計,侵襲性念珠菌病在全球范圍內(nèi)已達25萬人/年,死亡案例超過5萬［1］,并且已成為重癥監(jiān)護室重癥感染的首要病因［2］。由于抗真菌藥物本身的不良反應(yīng),同時藥物的不合理應(yīng)用導(dǎo)致的耐藥問題亦日趨嚴重［3］,給抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)。因此,尋找新型高效、廣譜、低毒的抗真菌藥物具有重要意義。

大蒜素是從百合科植物大蒜Allium sativumL.的鱗莖中提取的含硫有機化合物的主要有效成分［4］。研究顯示大蒜素對多種細菌、真菌、病毒和寄生蟲等均具有良好的抑制作用,被譽為天然廣譜抗生素藥物［5］。本研究旨在探討大蒜素對白色念珠菌毒力因子的作用機制,以期闡明大蒜素的抗真菌作用機制,為豐富大蒜素的臨床應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)；同時拓寬大蒜素的應(yīng)用價值,加快傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展。

1 材料

1.1 供試菌株 白色念珠菌標準菌株：AX2-2086,購自廣州市微生物研究所。臨床分離念珠菌4株,CA1、CA2、CA3、CA4。經(jīng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基和酵母樣真菌鑒定卡鑒定為白色念珠菌。所有菌株均連續(xù)在改良沙氏固體培養(yǎng)基中接種2次,保持菌株活力,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與藥物 二甲基亞砜 （DMSO,美國Sigma公司,批號D2650）；RPMI-1640培養(yǎng)基（批號 BL303A）、PBS磷酸鹽緩沖液 （批號BL302A）（北京Biosharp公司）；葡萄糖 （批號F20190509）、甘露醇（批號20190321）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；蛋白胨（北京Solarbio公司,批號P8450）；營養(yǎng)肉湯（北京Solarbio公司,批號N8300）；瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號01-023）；卵黃乳液（青島海博生物技術(shù)有限公司,批號HB8295）；科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基（批號CA220）、酵母樣真菌鑒定卡（批號21343）（法國-生物梅里埃公司）。RNA提取試劑盒（美國Omega公司,批號R6870-01）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司,批號RR047A）；qRTPCR試劑盒 （瑞士 Roche公司,批號6402712001）；引物（上海生工生物工程有限公司合成）。大蒜素（江蘇正大清江制藥有限公司,國藥準字H32025683,批號190307）。

1.3 儀器 BECKMAN Allegra 64R高速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；THERMOFISHER IMH100隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermofisher公司）；微量培養(yǎng)板 （96孔、6孔；美國Coring公司）；ESCO CLASSⅡBSC生物安全柜（新加坡艾斯克公司）；ZQZY-VS2恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；ELGA Purelabflex 2純水機（英國埃爾格公司）；FA2004型電子分析天平（上海良平儀器儀表有限公司）；雙目顯微鏡、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BioDrop核酸蛋白分析儀（英國柏點公司）；Biotek Eon全波長酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Roche lighelycler 96熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）。

1.4 培養(yǎng)基制備

1.4.1 改良沙氏培養(yǎng)基 葡萄糖40 g、蛋白胨10 g,加入雙蒸水定容至1 L,112 ℃高壓滅菌15 min,待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時加入青霉素20 U/mL、鏈霉素40 U/mL,即為改良沙氏液體培養(yǎng)基。若制備改良沙氏固體培養(yǎng)基,則在上述改良沙氏液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g再高壓滅菌。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 Spider培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯10 g、甘露醇10 g、K2HPO42 g,加入雙蒸水定容至1 L,調(diào)整培養(yǎng)基pH 7.2 （25 ℃）,121 ℃高壓滅菌20 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 卵黃乳液瓊脂培養(yǎng)基 NaCl 5.73 g、蛋白胨1 g、葡萄糖3 g、CaCl20.055 g、瓊脂粉2 g,加入雙蒸水定容至100 mL。121 ℃高壓滅菌20 min,待高壓鍋溫度降至70 ℃時,立即取出并加入10%卵黃乳液混勻。在培養(yǎng)基中分別加入不同濃度大蒜素（終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC）,混勻后分裝至無菌培養(yǎng)皿,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 菌液制備 將白色念珠菌標準菌株和臨床菌株分別接種于改良沙氏固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h后,挑取培養(yǎng)基中單克隆菌落,轉(zhuǎn)種至5 mL改良沙氏液體培養(yǎng)基,于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,使白色念珠菌處于對數(shù)生長期。經(jīng)麥氏比濁管及血細胞計數(shù)板計數(shù),以RPMI-1640培養(yǎng)液將菌液調(diào)整至濃度為2×106CFU/mL,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 藥液制備 將大蒜素溶解于DMSO中,再用RPMI-1640培養(yǎng)液作倍比稀釋,使其質(zhì)量濃度依次為800、400、200、100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 大蒜素對白色念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）測定 按照美國臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）推薦的真菌敏感性檢測方法CLSI-M27-A3［6］,采用微量液基稀釋法中的操作步驟進行并略作改良。

用RPMI-1640培養(yǎng)液將白色念珠菌菌液濃度稀釋至2×103CFU/mL。將上述濃度的大蒜素依次加入96孔微量培養(yǎng)板中,每孔100 μL,并設(shè)生長對照孔（RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL+菌液100 μL,無大蒜素）和空白對照孔 （RPMI-1640培養(yǎng)液200 μL,無菌液,無大蒜素）,每個濃度均設(shè)3復(fù)孔。將配制好的菌液加入相應(yīng)孔中,每孔100 μL,使得每一梯度藥液和菌液分別被1 ∶1稀釋至終濃度。將96孔微量培養(yǎng)板置37 ℃溫箱靜置培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。以上實驗在不同時間重復(fù)3次。

結(jié)果判斷采用視覺法,肉眼觀察孔內(nèi)菌株生長情況,與不含藥物的空白對照孔比較,觀察到生長完全抑制、培養(yǎng)基清亮所對應(yīng)的最低藥物濃度為MIC。

2.4 白色念珠菌時間-殺菌曲線 采用不同時間點取樣點板計數(shù)的方法繪制大蒜素對白色念珠菌的時間-殺菌曲線。選取白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2為試驗菌株（下同）。具體實驗操作步驟為：取對數(shù)生長期的白色念珠菌,用沙氏改良液體培養(yǎng)基稀釋菌液濃度為2×106CFU/mL。以各試驗菌株的MIC值為依據(jù),設(shè)置大蒜素終濃度依次為 1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC。將白色念珠菌菌液2 mL加入無菌試管中,再依次加入不同濃度大蒜素。同時設(shè)立不加藥物的空白對照組。混勻后置37 ℃,200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、2、4、8、12、24 h時取10 μL菌液按10倍倍比稀釋,取100 μL稀釋液均勻涂布于改良沙氏固體培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)48 h后計算菌落數(shù)目。以時間點為橫軸,以不同時間點生長的菌落數(shù)的對數(shù)為縱軸,繪制時間-殺菌曲線。

2.5 大蒜素對白色念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響 檢測大蒜素對白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2在Spider液體培養(yǎng)基中形態(tài)轉(zhuǎn)化能力的影響。用Spider液體培養(yǎng)基將白色念珠菌稀釋至2×106CFU/mL。將菌液和不同濃度大蒜素分別加入6孔板中,大蒜素終濃度分別為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC。同時設(shè)立不加藥物的空白對照孔。37 ℃靜置孵育6 h。取出孔板,在倒置顯微鏡明場下觀察白色念珠菌菌絲形成情況并拍照。

2.6 qRT-PCR檢測大蒜素對菌絲相關(guān)基因表達的影響

2.6.1 總RNA提取 將大蒜素與菌液混勻,置37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后,收集菌體,用無菌PBS緩沖液清洗3次后提取總RNA,按照試劑盒說明書進行。

2.6.2 引物設(shè)計與合成 所用引物序列見表1,由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR

2.6.3 cDNA制備 根據(jù)TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書操作。第一步,RNA 1 μg,5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,gDNA Eraser 1 μL,加RNase Free dH2O至10 μL,反應(yīng)條件為42 ℃2 min；第二步,取第一步反應(yīng)液10 μL,Master Mix 10 μL,反應(yīng)條件為37 ℃15 min,85 ℃5 sec。

2.6.4 實時熒光定量PCR反應(yīng) 按照試劑盒說明,制備反應(yīng)體系見表2。將所有試劑加好后,置于熒光定量PCR儀中進行反應(yīng),反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃600 s；擴增定量程序為95 ℃10 s,60 ℃15 s,72 ℃20 s,擴增程序為45個循環(huán)；熔解曲線65～95 ℃。每個樣品平行3次。

表2 RT-PCR反應(yīng)體系Tab.2 Reaction system of RT-PCR

2.6.5 定量分析 qRT-PCR分別測定的目的基因和內(nèi)參基因的CT值,將實驗結(jié)果取平均值,計算并統(tǒng)計。最后基因表達水平用2-△△CT法進行分析。

2.7 大蒜素對白色念珠菌細胞外磷脂酶活性的影響 分別取白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2的菌液（1×107CFU/mL）1 μL,滴加在含有不同濃度大蒜素（終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC）的卵黃乳液瓊脂培養(yǎng)基中,同時設(shè)置不加藥物的空白對照組。將培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)4 d后,白色念珠菌在平板上形成菌落,并在菌落周圍形成乳黃色不透明的沉淀圈。實驗重復(fù)3次。用游標卡尺測定菌落直徑和沉淀圈（含菌落）直徑。細胞外磷脂酶活性用Pz表示,Pz=d1/d2,其中,d1為菌落直徑,d2為沉淀圈直徑。 Pz值越小,表明磷脂酶活性越強,反之則活性越弱。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析處理,計量資料以（）表示,組間差異比較采用單因素方差分析檢驗,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大蒜素對白色念珠菌的MIC值 采用CLSIM27-A3推薦的微量稀釋法,經(jīng)過3次重復(fù)體外藥物敏感性試驗,大蒜素對白色念珠菌標準菌株AX2-2086的MIC為25 μg/mL。對于臨床分離菌株,大蒜素的MIC為12.5～25 μg/mL。結(jié)果見表3,表明,大蒜素對白色念珠菌具有良好的抑菌作用。后續(xù)選用白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2作為試驗菌株。

表3 大蒜素對白色念珠菌的MIC值（μg/mL）Tab.3 MIC values of allicin to C.albicans（μg/mL）

3.2 大蒜素對白色念珠菌的時間-殺菌曲線 時間-殺菌曲線可以反映各時間點藥物的抑菌或殺菌作用。本實驗通過計數(shù)平板上白色念珠菌單克隆菌落的數(shù)量,并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出原始CFU。結(jié)果表明,2 MIC和4 MIC濃度的大蒜素對白色念珠菌保持有效的抑制作用,1 MIC濃度組也具有一定的抑制作用。但是1/4 MIC濃度組未顯示明顯抑制作用,這與大蒜素對白色念珠菌的MIC值結(jié)果基本相符,見圖1。

圖1 大蒜素對白色念珠菌的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-kill curve of allicin against C.albicns

3.3 大蒜素抑制白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化 菌絲是白色念珠菌最主要的致病因子之一,酵母相-菌絲相形態(tài)轉(zhuǎn)化也是其生物被膜形成的重要一步［7］。通過倒置顯微鏡觀察大蒜素對白色念珠菌菌絲形成的影響,結(jié)果見圖2。在Spider液體培養(yǎng)基中,未經(jīng)藥物處理的白色念珠菌能在6 h內(nèi)形成較長且密的菌絲,錯綜復(fù)雜,相互纏繞重疊。當加入1 MIC濃度大蒜素時,視野內(nèi)可觀察到菌絲長度明顯變短,且與對照組比較數(shù)量明顯減少。而4 MIC濃度則能夠基本抑制菌絲的生長,鏡下觀察以酵母相細胞為主。這一現(xiàn)象表明,大蒜素可以抑制白色念珠菌由酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)化,且這種抑制作用具有劑量依賴性,即隨著藥物濃度的升高,抑制作用更加明顯。

3.4 大蒜素對白色念珠菌菌絲相關(guān)基因表達的影響 與空白對照組比較,經(jīng)1 MIC、2 MIC和4 MIC濃度的大蒜素干預(yù)后,參與正向調(diào)控白色念珠菌菌絲生長的基因RAS1、 CDC35、 EFG1的表達均明顯下降,而負向調(diào)控菌絲生長的基因PDE2的表達量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3,結(jié)果顯示,大蒜素對白色念珠菌菌絲生長的作用機制可能是通過調(diào)節(jié)菌絲形成相關(guān)基因的表達,從而抑制菌絲的形成。

圖2 大蒜素對白色念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響（×400）Fig.2 Effect of allicin on morphological transition of C.albicans（×400）

圖3 大蒜素對白色念珠菌菌絲相關(guān)基因表達的影響Fig.3 Effect of allicin on gene expression of C.albicanshyphae

3.5 大蒜素抑制白色念珠菌細胞外磷脂酶活性卵黃乳液瓊脂平板法是檢測細胞外磷脂酶的經(jīng)典方法［8］。在結(jié)果觀察中,菌落直徑代表菌細胞數(shù)目的多少,沉淀圈直徑代表磷脂酶催化的沉淀產(chǎn)物的量,兩者直徑比值（Pz）可近似反映單位細胞數(shù)量的磷脂酶活性。 Pz越低,反映磷脂酶產(chǎn)生越多,活性越強。圖4表明,白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2均能分泌較高活性的磷脂酶。加入濃度為1/4 MIC大蒜素未能明顯改變磷脂酶活性,菌體仍能分泌活性較高的磷脂酶。當大蒜素濃度≥1/2 MIC時,與空白對照組比較,白色念珠菌細胞外磷脂酶的活性降低,Pz逐漸升高。結(jié)果表明,大蒜素可以抑制白色念珠菌細胞外磷脂酶的活性。

4 討論

目前,應(yīng)用于臨床的抗真菌藥物數(shù)量和種類有限,但是由于臨床上有限抗真菌藥物的大量使用,導(dǎo)致真菌耐藥性的情況日益嚴重,而且出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象［9］。其中白色念珠菌是臨床最常見的條件致病性真菌。白色念珠菌在體內(nèi)最主要的致病原因在于宿主免疫功能受損導(dǎo)致的不受控制的增殖。過度的增殖導(dǎo)致白色念珠菌毒力因子的釋放,進而對機體造成危害［10］。白色念珠菌的毒力因子主要包括粘附、分泌酶、形態(tài)轉(zhuǎn)化、生物被膜的形成等等。

圖4 大蒜素對白色念珠菌細胞外磷脂酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of allicin on the activity of phospholipase of C.albicans

在白色念珠菌的毒力因子中,形態(tài)轉(zhuǎn)化是最主要也是最吸引注意力的一種。白色念珠菌是一種二相性真菌,從形態(tài)上分為酵母相和菌絲相。在相關(guān)誘導(dǎo)因素的刺激下,白色念珠菌能經(jīng)歷酵母相和菌絲相的相互轉(zhuǎn)化。在被感染宿主體內(nèi)的病灶部位,2種形態(tài)的白色念珠菌都能被發(fā)現(xiàn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在小鼠系統(tǒng)性感染中,多種菌絲形成缺陷的白色念珠菌突變體,其毒力是減弱的［11］。因此,如果能抑制白色念珠菌形態(tài)的轉(zhuǎn)化,或許能抑制其毒力和感染性。

Spider培養(yǎng)基常被用來評估白色念珠菌維持菌絲生長的能力［12］。在本實驗中,將白色念珠菌標準菌株AX2-2086和臨床菌株CA2接種到Spider液體培養(yǎng)基中,鏡下觀察發(fā)現(xiàn)白色念珠菌形成細長的錯綜復(fù)雜的菌絲。加入大蒜素后可抑制菌絲的形成,甚至基本抑制白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化,使其停留在酵母相。

Ras-cAMP-Efg1途徑是調(diào)節(jié)白色念珠菌由酵母相到菌絲相轉(zhuǎn)化的重要信號通路之一,其中第二信使cAMP是重要的調(diào)控分子。cAMP由Cdc35酶合成,Pde2酶降解［13］?；駿FG1編碼的菌絲生長蛋白是目前研究最深入的多功能調(diào)節(jié)因子之一,它可以正向調(diào)節(jié)菌絲的形成過程,并在生物膜形成過程中起著中心作用［14］。為驗證大蒜素對白色念珠菌菌絲形成的作用機制,實驗進一步通過qRTPCR檢測了菌絲相關(guān)基因的表達。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,大蒜素能夠下調(diào)與菌絲形成正相關(guān)基因（RAS1、 CDC35、 EFG1）,并上調(diào)菌絲形成負相關(guān)基因（PDE2）的表達。

細胞外磷脂酶是白色念珠菌重要的毒力因子之一,磷脂酶的高表達與小鼠播散性念珠菌病具有顯著相關(guān)性,而磷脂酶缺陷的白色念珠菌突變體在小鼠系統(tǒng)性感染模型中的毒力是減弱的［15-16］。本實驗通過卵黃乳液瓊脂培養(yǎng)基測定大蒜素對白色念珠菌細胞外磷脂酶活性的作用,發(fā)現(xiàn)加入大蒜素后,白色念珠菌分泌磷脂酶活性降低,表明大蒜素能夠有效地抑制白色念珠菌細胞外磷脂酶活性,從而發(fā)揮抗真菌作用。

綜上所述,大蒜素可通過抑制白色念珠菌菌絲生長、調(diào)節(jié)菌絲相關(guān)基因的表達,以及抑制細胞外磷脂酶活性等,從而發(fā)揮抑制白色念珠菌毒力因子的作用。這將為拓寬大蒜素潛在的臨床用途奠定了基礎(chǔ)。但大蒜素對體內(nèi)白色念珠菌毒力因子的干預(yù)效應(yīng)尚有待于進一步揭示。