王亞瓊，張華鋒，周 堅(jiān)

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇蘇州 215104）

口服液中可作為甜味劑的輔料有糖漿、甜菊糖、蜂蜜等多個(gè)種類,甜菊糖因口感、糖漿因工藝復(fù)雜、甜度難以控制等原因,大部分的口服制劑仍以蔗糖應(yīng)用最為廣泛。2015年版《中國(guó)藥典》 中合劑項(xiàng)下要求：除另有規(guī)定外,含蔗糖量應(yīng)不高于20%［1］。另外蜂蜜作為蜜丸、煎膏劑及蜜汁飲片中重要的輔料,在我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)中使用廣泛。然而,近年來(lái)蜂蜜摻偽的現(xiàn)象較為嚴(yán)重,間接對(duì)中藥的質(zhì)量造成了不良影響［2-3］。判定蜂蜜是否摻偽,則需要結(jié)合處方量考察果糖、葡萄糖及麥芽糖的含有量及相關(guān)比值［4］。

電噴霧檢測(cè)器（CAD）是一種新型的HPLC通用質(zhì)量型檢測(cè)器,可應(yīng)用于各種非揮發(fā)或者半揮發(fā)化合物的檢測(cè),特別適合糖類等無(wú)紫外吸收或紫外吸收很弱的天然產(chǎn)物的分析［5］。與傳統(tǒng)糖類分析使用的質(zhì)量型檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和示差檢測(cè)器相比,CAD靈敏度、重現(xiàn)性更好［6］。故本研究先就HPLC-CAD及HPLC-ELSD 2種方法進(jìn)行比較,使用更優(yōu)HPLC-CAD方法測(cè)定了果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖及乳糖的含有量,并應(yīng)用于中成藥中甜味劑的測(cè)定及蜂蜜類輔料的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀配Corona Veo電噴霧檢測(cè)器（美國(guó)Thermo Fisher公司）；UFLC型LC-20島津高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Alltech 3300 ELSD蒸發(fā)光散檢測(cè)器（瑞士Buchi公司）；AG245電子天平（瑞士Mettler公司）。

果糖對(duì)照品（批號(hào)100231-201606,純度99.7%）、 D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)110833-201506,純度99.9%）、蔗糖對(duì)照品（批號(hào)111507-201704,純度100%）、麥芽糖對(duì)照品（批號(hào)100287-201604,純度94.4%）及乳糖（批號(hào)100058-201605,純度94.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；水 （美國(guó) Millpore公司）；色譜乙腈 （美國(guó)Honeywell公司）。

中成藥中甜味劑的測(cè)定樣品來(lái)源于2018年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽樣小兒咳喘靈口服液114批及顆粒劑184批,其余樣品來(lái)自江蘇省藥品抽樣及蘇州市藥品抽樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hon-Sugar色譜柱 （250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（75 ∶25）；體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃。Corona電噴霧檢測(cè)器,采集頻率10 Hz,濾光片1 s,霧化器溫度設(shè)定值為high。ELSD檢測(cè)器,霧化氣體積流量1.8 L/min；漂移管溫度95 ℃,增益1。CAD圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品貯備液制備 分別精密稱取果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖對(duì)照品各1 g,加水定容于50 mL,置4 ℃密封貯藏。

2.3 供試品溶液制備 精密量取小兒咳喘靈口服液1 mL,加水稀釋并定容至20 mL,濾過(guò),即得小兒咳喘靈口服液供試品溶液。取蜜丸類樣品,剪碎,取約1 g,精密稱定后置50 mL量瓶中,加水約40 mL,超聲（350 W,40 kHz）15 min,放冷,加水至刻度,搖勻,濾過(guò),即得蜜丸類樣品供試品溶液。取蜜制飲片樣品,粉碎,取約1 g,同蜜丸類樣品制備供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取不同體積的果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖對(duì)照品貯備液至同一量瓶中,加水稀釋至刻度,配成系列質(zhì)量濃度的果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖混合對(duì)照品溶液。在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣,以各對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）,并計(jì)算回歸方程。逐級(jí)稀釋對(duì)照品貯備液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣,以3倍信噪比估算檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 精密度試驗(yàn) 取3種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算各組分的平均RSD,HPLC-CAD法測(cè)定果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含有量的精密度分別為3.34%、4.19%、3.03%、3.57%、4.07%,HPLC-ELSD法測(cè)定果糖、葡糖糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含有量的精密度分別為1.53%、3.26%、1.83%、3.45%、3.21%。表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取小兒咳喘靈口服液的供試品溶液6份,按“2.3” 項(xiàng)下制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,HPLC-CAD法測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖含有量RSD分別為2.10%、3.21%、4.04%,HPLC-ELSD法測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖含有量RSD分別為4.79%、1.04%、4.26%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取小兒咳喘靈口服液的供試品溶液,分別放置0、2、4、8、16、24 h后,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各組分RSD,結(jié)果HPLC-CAD法測(cè)定果糖、葡萄糖、蔗糖RSD分別為3.96%、4.24%、3.93%。HPLC-ELSD法果糖、葡萄糖、蔗糖RSD分別為4.31%、4.48%、4.92%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取小兒咳喘靈口服液的供試品溶液,分別精密加入約等量對(duì)照品適量,濾過(guò),在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得回收率均在95%～105%之間,結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品含有量測(cè)定 114批小兒咳喘靈口服液蔗糖含有量介于0～15.53%,均未超過(guò)2015年版《中國(guó)藥典》 中合劑項(xiàng)下規(guī)定的限度20%。但其中17批樣品,涉及5家生產(chǎn)企業(yè)的蔗糖含有量高于3%,同時(shí)HPLC-UV法測(cè)出甜菊糖的含有量均低于定量限0.026 ng/mL。推測(cè)這些批次的樣品中矯味劑以蔗糖為主,與執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)處方描述“加入甜菊糖” 為矯味劑不一致。184批小兒咳喘靈顆粒劑樣品中蔗糖含有量不同生產(chǎn)企業(yè)差別較大,蔗糖含有量介于2.14%～87.13%。結(jié)果表明不同企業(yè)在顆粒劑制粒環(huán)節(jié)中輔料的用量差別較大。制粒過(guò)程中輔料使用比例過(guò)大,導(dǎo)致浸膏量比例減少,建議標(biāo)準(zhǔn)中明確浸膏的相對(duì)密度及加入量,控制制劑中輔料的比例。見(jiàn)圖2～3。

圖1 小兒咳喘靈制劑中各成分CAD色譜圖

圖2 不同生產(chǎn)企業(yè)小兒咳喘靈制劑中蔗糖含有量頻數(shù)分布圖

圖3 不同生產(chǎn)企業(yè)蔗糖含有量箱式圖

表3 加煉蜜的中成藥及飲片中糖類含有量推算標(biāo)準(zhǔn)

2015年版《中國(guó)藥典》 一部“蜂蜜” 項(xiàng)下規(guī)定,蜂蜜中含蔗糖及麥芽糖分別不得過(guò)5.0%,果糖與葡萄糖的總量不得少于60.0%,果糖與葡萄糖含有量比值不得小于1.0。按不同成藥及飲片炮制的煉蜜用量折算,結(jié)果見(jiàn)表3。據(jù)參考文獻(xiàn)［2-3］中均提出藥材中含有蔗糖,因此蔗糖含有量不予考慮。加煉蜜的中成藥及飲片中糖類測(cè)定結(jié)果顯示,果糖與葡萄糖含有量比值均大于1.0,麻仁潤(rùn)腸丸中麥芽糖的含有量超標(biāo),蛇膽川貝枇杷膏中輔料為蜂蜜,因處方量未公開,無(wú)法推算限度,但麥芽糖含有量偏高。根據(jù)含有量推算標(biāo)準(zhǔn)麻仁丸、疏風(fēng)活絡(luò)丸及蜜制款冬花的果糖與葡萄糖的總量均小于推算限度,可確定煉蜜質(zhì)量存在一定問(wèn)題。見(jiàn)表4、圖4。

表4 加煉蜜的中成藥及飲片中糖類含有量（%）

圖4 加煉蜜的中成藥及飲片中各成分CAD色譜圖

3 討論

糖類的分析方法有很多種,早期的有光度法、容量分析法等,目前,液相色譜法、氣相色譜法、PMP衍生法等,新技術(shù)有氣相-質(zhì)譜連用、液相-質(zhì)譜連用、核磁法、超臨界流體等也用于糖類分析［7-12］。在藥物分析領(lǐng)域中應(yīng)用較為普遍的是液相法分離,ELSD和示差檢測(cè)器檢測(cè),由于示差檢測(cè)器對(duì)環(huán)境高,不能梯度分離樣品,同時(shí)穩(wěn)定性也受多個(gè)因素影響,不適合于大批量樣品的分析,因此,本研究比較了HPLC-ELSD法和新型HPLC-CAD法的差異,CAD法比ELSD法的線性范圍更寬廣,靈敏度也更高,穩(wěn)定性也非常適合大批量樣品長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)樣。同時(shí),在儀器維護(hù)方面,由于CAD直接連接氮?dú)鉃檩d氣,低溫分析,長(zhǎng)時(shí)間分析穩(wěn)定性高,而ELSD空氣泵易產(chǎn)生水汽,長(zhǎng)時(shí)間分析干燥管變色,檢測(cè)池進(jìn)水后將無(wú)法繼續(xù)分析。

本研究采用HPLC-CAD法測(cè)定了國(guó)家評(píng)價(jià)性抽樣中小兒咳喘靈口服液及顆粒劑中甜味劑的含有量,發(fā)現(xiàn)部分企業(yè)違規(guī)采用非標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的矯味劑投料；并對(duì)普通抽樣中部分中成藥及飲片中蜂蜜類輔料進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)部分中成藥中加入的煉蜜質(zhì)量存在一定的問(wèn)題。HPLC-CAD法樣品提取方法簡(jiǎn)單快捷,分析方法穩(wěn)定可靠,以期為中成藥中甜味劑的測(cè)定及中成藥及飲片中蜂蜜類輔料的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。