劉夢婷，羅飛亞，曾建國

（湖南農業(yè)大學，中獸藥湖南省重點實驗室，獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯合工程研究中心，湖南長沙 410128）

飼料在長期貯存中易產生氧化、腐爛及霉變現象,導致其營養(yǎng)價值降低［1］。為了延長飼料的貯存時間,常常在飼料中添加抗氧化劑、防腐劑和防霉劑,但目前使用的飼料添加劑多是化學類添加劑［2-3］。由于過多地使用此類添加劑,動物源食品已經嚴重受到污染,進而影響到人類的健康。而植物精油是從從植物中提取的一類天然物質,不僅具有較強的抗菌抗氧化作用［4-5］,更由于其綠色安全的特點被越來越多的人關注。研究表明,在仔豬飼料中添加牛至油,可提高平均日增重,同時提高飼料轉化率,且治療仔豬下痢也有很好的療效［6］。在肉雞基礎日糧中分別添加植物精油,對42 d齡肉仔雞的血清抗氧化指標有正向調節(jié)作用,表明植物精油在清除自由基方面有一定的作用［7］。柴向華等［8］通過測定抑菌圈等體外抑菌實驗研究了羅勒精油、百里香精油、牛至精油等13種植物精油對6種常見有害微生物的抑菌作用。結果表明,13種植物精油均對細菌、真菌、霉菌具有一定的抑殺能力。因此,植物精油的開發(fā)和應用前景十分廣闊。

石香薷Mosla chinensisMaxim.系唇形科石薺苧屬一年生草本植物,有細葉香薷、小香薷、野香薷等別稱,廣泛分布于我國長江以南地區(qū)。石香薷在民間以全草入藥,具有治療中暑發(fā)熱、感冒惡寒、胃痛嘔吐、急性腸胃炎、痢疾等作用［9］。石香薷精油是從石香薷全草中提取的揮發(fā)油,具有濃烈的香氣。研究表明石香薷精油具有較強的抗菌和抗氧化活性［10-11］,目前對石香薷精油的應用報道主要集中在植物殺蟲劑方面［12-13］,但其在飼料添加劑方面的應用報道較少。本研究通過GC-MS法分析石香薷精油中的化學成分,并研究其抗菌、抗氧化活性,旨在尋找一種天然高效的飼料添加劑,同時也為充分開發(fā)利用石香薷提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 98-1-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV2400型紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；Nano Quant infinite M200Pro TECAN酶標儀（瑞士Tecan公司）；ZHWY-103D型臺式恒溫振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；SPX-150型生化培養(yǎng)箱（北京市永安光明醫(yī)療儀器廠）；LDZF-75KB-Ⅱ型立體蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀、GC/MS solution色譜工作站和NIST.17質譜數據庫（日本島津公司）；移液槍（Gilson PIPETMAN?L手動單道移液器,法國Gilson公司）。

1.2 材料 石香薷干燥全草（湖南新寧）,經湖南農業(yè)大學曾建國教授鑒定為正品。DPPH （50 mg/瓶）、總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）（上海碧云天生物技術有限公司）；吐溫-80；無水硫酸鈉（分析純,500 g/瓶,國藥集團化學試劑有限公司）；沒食子酸丙酯 （PG,化學純,100 g/瓶）、抗壞血酸 （Vc,1 g/瓶,阿拉?。?；正己烷（色譜純,德國Merck公司）；無水乙醇（分析純,國藥集團化學試劑有限公司）；TPYPTONE （胰蛋白胨）、YEAST EXTRACT （酵母粉）,均購于美國OXOID公司；氯化鈉（分析純）、瓊脂粉（國藥集團化學試劑有限公司）。大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）,所有供試菌種均來自中國典型培養(yǎng)物保究藏中心（CCTCC）。鹽酸金霉素（純度94.1%,生產批號130306-201419,中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 石香薷精油提取 將石香薷干燥全草切斷（1 cm左右）,稱取200 g,用水蒸氣蒸餾裝置提取樣品中的精油,同時考察時間對精油提取的影響；將精油收集后用無水硫酸鈉干燥并裝瓶于低溫處保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 石香薷精油成分測定 CD-WAX色譜柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃；注入方式無分流；載氣高純氦氣 （99.99%）；載氣氣體體積流量1 mL/min。程序升溫條件為初始溫度40 ℃,保持2 min,以2 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,繼續(xù)以5 ℃/min升至200 ℃,保持2 min,分析檢測時間共計61 min。

離子源為EI源；離子源溫度為200 ℃；接口溫度為220 ℃；電離能量為70 eV；質荷比質量掃描范圍為m/z45～500；溶劑切除時間2.5 min,采集時間為58.5 min。

2.3 石香薷精油抗氧化活性測定

2.3.1 對DPPH·清除率 準確稱取0.019 7 g DPPH·溶解于無水乙醇中,定容于250 mL棕色量瓶中,即配制成2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,低溫儲藏備用；另取適量精油用無水乙醇溶解,分別配制成質量濃度為1、5、10、20、40、80 μg/mL的精油乙醇溶液,低溫儲藏備用。

參照文獻［14-15］中的方法。吸取2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液,再加入2 mL無水乙醇,至于具塞試管中,記作A0；另取2根具塞試管各加入2 mL 1 μg/mL的精油溶液,然后分別加入2 mL 2×10-4mol/L的DPPH·乙醇溶液、2 mL無水乙醇溶液,分別記作Ai和Aj。用力搖勻。將A0、 Ai、 Aj所表示的樣品在室溫暗處靜置反應30 min,加入比色皿中在波長517 nm處進行吸光度的測定,以無水乙醇作為對照調零,分別測出A0、 Ai和Aj所示樣品的吸光度值。同理分別測定出5、10、20、40、80 μg/mL的精油溶液的吸光度值,并用PG和Vc做陽性對照。石香薷精油的清除率（SR）計算公式為SR=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%。

2.3.2 總抗氧化能力（FRAP法）參照文獻［16-17］進行。96孔板的每個檢測孔中加入180 μL FRAP工作液,空白對照孔中加入5 μL蒸餾水,樣品檢測孔內分別加入5 μL 0.1%石香薷精油溶液。以Trolox作為陽性對照。37 ℃孵育3～5 min在593 nm處測定其吸光度。以FeSO4標準溶液測定繪制標準曲線,樣品的總抗氧化能力以FRAP值來表示,1 FRAP值與1 mmol/L FeSO4相當。

2.4 抗菌活性 采用濾紙片擴散法［18-19］,將一定量的石香薷精油用1%吐溫-80水溶液稀釋成25%精油溶液。在無菌條件下,將濾紙片（d=6 mm）浸入已配置好的精油溶液中,取出自然風干,貼到涂抹適宜濃度菌懸液（1×106～107CFU/mL）的培養(yǎng)基平板上,每皿2片并以吐溫-80水溶液作對照,重復3次,37 ℃培養(yǎng)12 h,十字交叉法測定抑菌圈大?。?0-21］。

2.5 最低抑菌濃度（MIC）采用二倍稀釋法［22］,將石香薷精油用1% 吐溫-80水溶液稀釋成體積分數為160 μL/mL的溶液。取無菌試管10支,排成一排,編號1～10。除1號管中加入1.6 mL LB培養(yǎng)基,其余各管各加入1 mL。然后再加入0.4 mL精油溶液至1號管,混勻,從1號管中吸取1 mL液體加入至2號管,混勻后吸取1 mL加入3號管,以此類推,8號管中吸取1 mL液體棄去。9號管為不含精油溶液的生長對照,10號管為空白對照。然后在1～8號每管內加入菌液1 mL,使精油體積分數最終為0.125～16 μL/mL,最終菌液濃度為1×106～107CFU/mL。將接種好的試管,于37 ℃培養(yǎng)6 h,然后吸取100 μL涂布瓊脂平板,再于37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察,無細菌生長的為最低抑菌濃度。

精確稱取鹽酸金霉素適量,制備成質量濃度為5.12 mg/mL的母液,參照石香薷精油二倍稀釋法進行稀釋,取無菌試管10支,編號1～10。使1～8號管鹽酸金霉素質量濃度最終為4～512 μg/mL,9號管為不含鹽酸金霉素溶液的生長對照,10號管為空白對照。將接種好的試管,于37 ℃培養(yǎng)6 h,然后吸取100 μL涂布瓊脂平板,再于37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察細菌生長情況,無細菌生長的為最低抑菌濃度。

3 結果與分析

3.1 石香薷精油提取及化學成分分析 測定結果表明,石香薷精油的提取率隨著時間的延長而提高,當時間達到4 h后,提取率不再提高。本研究中石香薷精油的提取率為1.72%～1.85% （實際生產中,影響石香薷精油提取率的因素還有料液比、粉碎粒度、原料浸泡時間等）?？傠x子流圖見圖1。

圖1 石香薷精油總離子流圖

采用面積歸一化法對各積分色譜峰占總峰面積百分比進行計算,再將GC-MS獲取的石香薷精油成分的質譜數據,通過NIST.17譜庫檢索和人工仔細比對,參考文獻［11-12］,本研究從石香薷精油中共檢測出52種成分,鑒定了其中32種,見表1,相似度均達到84%以上,占總峰面積的97.84%。其中百里香酚、對傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯是其主要成分。

表1 石香薷精油化學成分鑒定結果

3.2 結果分析

3.2.1 總抗氧化能力 FRAP法測定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原（Fe3+-TPTZ）復合物,產生藍紫色的（Fe2+-TPTZ）,利用酶標儀測定其吸光度,其變化與還原物質的含有量呈比例關系,并在593 nm處達到最大吸收,因此可作為樣品總抗氧化能力的指標［23-24］。

由FeSO4標準曲線可知,其在0.15～1.5 mmol/L之間線性關系良好,回歸方程為Y=0.351 9X+0.019 8 （r=0.998 2）,通過對石香薷精油總抗氧化能力測定,計算得出石香薷精油的總抗氧化能力的FRAP值為327.08±1.92,結果表明石香薷精油的抗氧化能力較強。

3.2.2 DPPH·清除 由圖2可知,石香薷精油的IC50為1.92 μg/mL。石香薷精油對DPPH·的清除率與精油濃度呈現明顯的量效關系,當石香薷精油的質量濃度到20 μg/mL時,對DPPH·的清除率達到飽和,而總體來看,石香薷精油的清除率要高于同質量濃度的PG和Vc溶液?？寡趸瘎┍憩F出來的抗氧化活性大小一般是酚類＞醛類＞醇類,石香薷精油中的化學成分以百里香酚、對傘花烴、香芹酚等為主要物質,因此有較強的清除DPPH·的能力。

圖2 石香薷精油對DPPH·的清除率

3.3 石香薷精油及鹽酸金霉素的抑菌活性結果分析

3.3.1 抑菌活性 石香薷精油的抑菌活性結果見表2,石香薷精油對4種供試菌均有抑制作用,抑菌活性強弱為金黃色葡萄球菌＞腸炎沙門氏菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌,對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,對大腸桿菌抑制效果較弱。

表2 石香薷精油對不同菌種的抑菌活性（）

表2 石香薷精油對不同菌種的抑菌活性（）

3.3.2 石香薷精油和鹽酸金霉素的MIC測定結果 表3顯示,生長對照號管供試菌種正常生長,表明1%吐溫-80溶液對其生長沒有抑制作用,空白對照管無細菌生長,表明培養(yǎng)基未受到污染。由于不同菌種對石香薷精油的敏感程度不同,最低抑菌體積分數也各不相同。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌的MIC值為1 μL/mL,大腸桿菌的MIC值為2 μL/mL?？梢?石香薷精油對其均有良好的抑制作用。

見表4顯示,生長對照管供試菌種正常生長,表明蒸餾水對其生長沒有抑制作用,空白對照管無細菌生長,表明培養(yǎng)基未受到污染。由于不同菌種對鹽酸金霉素的敏感程度不同,最低抑菌體積分數也各不相同。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌的MIC值分別為128、8、32、64 μg/mL?？梢?鹽酸金霉素對不同菌種的抑制效果各不相同,其中對金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用。

表3 石香薷精油體外對4種病原菌MIC值

表4 鹽酸金霉素對4種病原菌的MIC值

4 討論

石香薷是我國重要的一種含有較多揮發(fā)油的植物,其精油含有量隨著其生長期、部位及提取工藝的不同有較大差異［24-26］。本研究中石香薷精油的提取率為1.72%～1.85%,精油提取率較高。

本研究通過GC-MS分析石香薷精油化學成分,結果表明其成分以萜烯類為主,主要成分為百里香酚、對傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯、香芹酚等,和已報道結果相似［27-28］,張瀟月等［29］研究報道,石香薷化學成分中未檢測對傘花烴、α-松油烯、乙酸百里酚酯,而百里香酚和香芹酚含有量相對較高,可能是由于地域性差異導致?？寡趸钚詫嶒灲Y果顯示石香薷精油清除DPPH·的能力與其濃度呈現一定的量效關系,表明其有較強的自由基清除能力和抗氧化能力。通過測定石香薷精油對4種細菌的抑菌活性,發(fā)現石香薷精油對不同種類細菌具有良好的抑菌活性,尤其是對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌展現出較強的抑制作用,而石香薷精油中的帖烯類物質可能在其較強的抗菌抗氧化能力而發(fā)揮主要作用［30-31］。在設置的陽性對照中,其抑菌效果不明顯,僅對金黃色葡萄球菌具有一般抑菌效果,對其他3種菌的抑制效果較差,石香薷精油抑菌效果明顯優(yōu)于鹽酸金霉素。

本研究表明石香薷精油具有良好的抗菌抗氧化作用,可作為一種新的天然、綠色、無毒的飼料添加劑開發(fā)應用,前景廣闊。同時希望通過更深入的研究挖掘出更多芳香植物精油［32-33］,以便在將來替代化學類添加劑應用于人們生活中的各個領域,有利于人類健康。