涂 鵬 谷孝艷 張曉航 劉東云 林 蕓 張雪梅 董虹美 何怡華 冉素真

室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）是胎兒期最常見(jiàn)的先天性心臟病之一，近年來(lái)隨著產(chǎn)前超聲和胎兒血清學(xué)篩查技術(shù)迅速發(fā)展，以及我國(guó)二胎政策放開(kāi)、高危孕婦數(shù)量增加，胎兒期VSD檢出率、相關(guān)遺傳學(xué)檢查異常率均較以往有所提高，增加了孕婦的心理負(fù)擔(dān)和產(chǎn)前醫(yī)師咨詢難度。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)VSD胎兒的研究［1-4］大多集中在其病理分型及手術(shù)預(yù)后，對(duì)其相關(guān)遺傳學(xué)病因報(bào)道較少。本研究通過(guò)回顧性分析我院77例VSD胎兒的超聲異常表型及進(jìn)一步的染色體微陣列分析（CMA）、全外顯子測(cè)序（WES）等遺傳學(xué)檢查結(jié)果，旨在為VSD胎兒產(chǎn)前咨詢和預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2016年11月至2018年12月我院行系統(tǒng)超聲檢查和超聲心動(dòng)圖檢查檢出的77例VSD胎兒，均有完整的遺傳學(xué)檢測(cè)資料且隨訪至妊娠終止，孕婦年齡21～42歲，平均（30.3±3.5）歲；孕20～33周，平均孕（24.9±3.2）周。納入標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)前超聲心動(dòng)圖檢查存在VSD，且經(jīng)新生兒期超聲心動(dòng)圖證實(shí)或胎兒引產(chǎn)后解剖證實(shí)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有孕婦均簽署知情同意書(shū)。

二、儀器與方法

1.超聲檢查：產(chǎn)前超聲檢查使用GE E 10、E 8及三星WS 80A彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率2.0～5.0 MHz。新生兒超聲心動(dòng)圖檢查使用Philips iE 33彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率2.6 MHz。參照我國(guó)《胎兒心臟病產(chǎn)前超聲診斷咨詢及圍產(chǎn)期管理指南》［5］和國(guó)際婦產(chǎn)超聲協(xié)會(huì)（ISUOG）2013版胎兒心臟超聲篩查實(shí)踐指南［1］，經(jīng)腹橫切面、四腔心切面、心室流出道切面、三血管-氣管切面對(duì)胎兒心臟進(jìn)行序列檢查，記錄心臟大血管異常類(lèi)型、VSD位置及大小。VSD超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］：經(jīng)彩色多普勒和頻譜多普勒同時(shí)證明VSD存在。

2.胎兒遺傳學(xué)檢測(cè)：當(dāng)產(chǎn)前超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)，根據(jù)孕婦自愿原則依據(jù)胎齡選擇在我院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行羊水或臍帶血穿刺，行染色體核型分析、快速熒光原位雜交和單核苷酸多態(tài)性比較基因組雜交（SNP-array）及WES檢查。終止妊娠者簽署胎兒大體解剖及遺傳學(xué)檢測(cè)同意書(shū)，收集胎兒組織。在父母知情同意下采集父母雙方外周血各5 ml（乙二胺四乙酸抗凝）。標(biāo)本立即置于-80℃冰箱冷凍，按照DP318基因組提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］推薦步驟提取收集胎兒組織的基因組DNA（gDNA）?；驕y(cè)序內(nèi)容：①采用低深度全基因組測(cè)序（CNV-seq）檢測(cè)拷貝數(shù)異常（CNVs）和非整倍體：測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq2500，檢測(cè)100 kb以上的CNVs。對(duì)檢出的CNVs，通過(guò)檢測(cè)DGV（http：//dgv.tcag.ca/dgv/app/home）、Decipher（https：//decipher.sanger.ac.uk/）、OMIM（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）及PUBMED（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）等數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析，并依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)（ACMG）對(duì)拷貝數(shù)異常結(jié)果解讀指南［2］對(duì)其進(jìn)行致病性判定，將CNVs分為已知致病、疑似致病、臨床意義不明、疑似良性及良性5類(lèi)。同時(shí)對(duì)攜帶已知致病、疑似致病CNVs胎兒的父母外周血樣進(jìn)行檢測(cè)，明確來(lái)源。②WES檢測(cè)單基因變異：將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉，病富集后進(jìn)行外顯子目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序（Illumina Hiseq2500，測(cè)序類(lèi)型：PE100 bp），對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量過(guò)濾，利用標(biāo)準(zhǔn)生物信息分析流程檢測(cè)單核苷酸變異和小的插入缺失，對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行檢出、過(guò)濾及注釋。變異位點(diǎn)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)包括人群數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率（ExAC或千人基因組）<5%、最小覆蓋深度為10X，以及變異功能變化（非同義突變、剪切位點(diǎn)變化、無(wú)義突變、移碼突變）等。

3.基因突變驗(yàn)證：對(duì)發(fā)現(xiàn)遺傳變異的家系進(jìn)行產(chǎn)前超聲咨詢及圍產(chǎn)兒預(yù)后咨詢，根據(jù)胎兒父母自愿原則，進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

4.隨訪：孤立性VSD胎兒隨訪至生后1年，觀察VSD預(yù)后及治療情況，同時(shí)由我院兒童保健科進(jìn)行大運(yùn)動(dòng)及智力發(fā)育專(zhuān)業(yè)評(píng)估。

結(jié) 果

一、VSD胎兒合并心臟及心外超聲結(jié)構(gòu)異常表型情況

77例VSD胎兒中，孤立性VSD胎兒最多，為41例（53.2%），其次為VSD同時(shí)合并心臟及心外畸形16例（20.8%）、VSD僅合并心臟畸形14例（18.2%）、VSD僅合并心外畸形6例（7.8%）。

1.合并心外畸形22例（28.6%），其中單發(fā)畸形13例（59.1%），合并2種及以上畸形9例（40.9%），具體種類(lèi)及檢出率見(jiàn)表1。

2.合并心臟畸形30例（39.0%），均為圓錐動(dòng)脈干畸形；其中肺動(dòng)脈狹窄/閉鎖伴VSD最多，為15例（50.0%），其次為法洛四聯(lián)癥6例（20.0%）、右室雙出口6例（20.0%）、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位3例（10.0%）。另外伴發(fā)主動(dòng)脈弓位置異常8例（26.7%）、永存左上腔靜脈5例（16.7%）、無(wú)名靜脈走行異常2例（6.7%）、靜脈導(dǎo)管缺如2例（6.7%）、房室間隔缺損2例（6.7%）、左心發(fā)育不良綜合征1例（3.3%）、肺動(dòng)脈瓣缺如1例（圖3，3.3%）、右鎖骨下動(dòng)脈迷走1例（3.3%）、冠狀動(dòng)脈瘺1例（3.3%）。

二、VSD胎兒遺傳學(xué)檢查結(jié)果

77例胎兒中共檢出遺傳學(xué)異常16例，檢出率20.8%。染色體非整倍體異常、基因點(diǎn)突變情況及胎兒超聲表型情況見(jiàn)表2～4。在核型正常VSD胎兒中檢出12例異常，其中致病性CNVs 8例（6例微缺失和2例微重復(fù)），4例單基因病，分子診斷率分別提高了15.1%、7.5%。TUBA1A基因點(diǎn)突變胎兒（case14）產(chǎn)前超聲和Sanger測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1，2；22q11.2微缺失胎兒（case5）相關(guān)超聲圖像見(jiàn)圖3，CNVs結(jié)果見(jiàn)圖4。

表1 22例胎兒心外畸形類(lèi)型及其檢出率

1.41例孤立性VSD胎兒中，2例（4.9%，case11、12）檢出遺傳學(xué)異常，均為CNVs，case11檢出2q13微重復(fù)，case12檢出Xp22.31微重復(fù)；均未進(jìn)行雙親驗(yàn)證。

表2 4例染色體非整倍體異常胎兒心臟及心外超聲表型

表3 8例致病性CNVs胎兒心臟及心外超聲表型

表4 4例基因點(diǎn)突變胎兒心臟及心外超聲表型

圖1 TUBA1A基因點(diǎn)突變胎兒（case14）產(chǎn)前超聲顯示胎兒胼胝體缺如、單純腭裂

圖2 TUBA1A基因點(diǎn)突變胎兒（case14）Sanger測(cè)序結(jié)果

圖3 22q11.2微缺失胎兒（case5）超聲心動(dòng)圖顯示胎兒肺動(dòng)脈瓣缺如、胸腺發(fā)育不良

圖4 22q11.2微缺失胎兒（case5）及其父母CNVs檢測(cè)結(jié)果

2.14例VSD僅合并心臟畸形胎兒中，5例（35.7%）檢出遺傳學(xué)異常。染色體異常2例，case1檢出8P-三體綜合征，雙親驗(yàn)證后為新發(fā)變異；case4檢出4q重復(fù)綜合征，重復(fù)區(qū)域?yàn)閝26-q35，但該胎兒雙親拒絕進(jìn)行驗(yàn)證。CNVs 2例（case8、9），均檢出22q11.2微缺失，雙親驗(yàn)證后為新發(fā)變異。case13為單基因病，檢出其攜帶DNNAAF1基因的1個(gè)復(fù)合雜合突變c.767C>T（p.P256L），測(cè)序驗(yàn)證該突變分別來(lái)自胎兒健康父母。

3.2 例VSD僅合并心外畸形胎兒中，2例（33.3%，case3、7）檢出遺傳學(xué)異常，染色體異常1例，case3檢出為18-三體；CNVs 1例，case7檢出22q11.2微缺失，雙親驗(yàn)證后為新發(fā)變異。

4.16 例VSD同時(shí)合并心臟及心外畸形胎兒中，7例（43.8%）檢出遺傳學(xué)異常。染色體異常1例（case2），為9號(hào)染色體環(huán)狀變形，雙親驗(yàn)證后為新發(fā)變異。CNVs 3例（case5、6、10），均檢出22q11.2微缺失，雙親驗(yàn)證后均為新發(fā)變異。單基因病3例：case14檢出攜帶TUBA1A基因的已知致病突變c.1169G>C（p.R390P），為新發(fā)突變；case15檢出攜帶FGFR3基因的已知致病突變c.G1144A（p.G382R），為新發(fā)突變。case16檢出攜帶MLL2基因的已知致病突變c.11729_c.11734delAGCAAC（p.Q3910_L3912delinsL），為新發(fā)突變。

討 論

VSD是由于胚胎期心室間隔發(fā)育不完全，導(dǎo)致左、右心室間形成異常血流交通，是常見(jiàn)的胎兒期及新生兒期心臟病，根據(jù)缺損部位通常將其分為膜周部、流出道、流入道及肌部4類(lèi)。雖然胎兒期VSD檢出率有所提高，但主要以孤立性VSD常見(jiàn)，30%病例會(huì)合并其他心臟異常。目前外科手術(shù)治療已經(jīng)能對(duì)大部分出生后VSD進(jìn)行有效干預(yù)，封堵成功率達(dá)95%［4］。新的遺傳檢測(cè)手段CNV-seq、WES的應(yīng)用使胎兒VSD在分子水平的診斷成為可能，為臨床及患兒家屬提供了更多產(chǎn)前咨詢信息。

一、VSD胎兒心臟及心外超聲結(jié)構(gòu)異常解讀

既往研究［6］顯示，孤立性VSD病例的缺損處<3 mm、位于膜周部或肌部時(shí)，自然閉合率達(dá)60%，性別、是否使用輔助生殖技術(shù)等均不影響預(yù)后。但若VSD伴發(fā)心臟其他結(jié)構(gòu)異?；蜻z傳學(xué)異常，自然閉合可能性?。?］，尤其是由遺傳缺陷引起的先天性心臟病多伴有其他并發(fā)癥，即使手術(shù)成功修補(bǔ)VSD缺口，仍會(huì)因其他并發(fā)癥導(dǎo)致預(yù)后不佳。故決定VSD胎兒的預(yù)后除其缺損大小、部位外，更應(yīng)關(guān)注胎兒是否合并心臟、心外畸形。本研究中非孤立性VSD胎兒中同時(shí)合并心臟及心外畸形比例最高，達(dá)44.4%；而在遺傳學(xué)異常VSD胎兒中，同時(shí)合并心臟及心外畸形胎兒遺傳學(xué)比例也最高，達(dá)43.8%。提示當(dāng)檢查發(fā)現(xiàn)胎兒存在VSD時(shí)，應(yīng)仔細(xì)掃查胎兒心臟及心外是否同時(shí)存在多發(fā)畸形，這對(duì)胎兒的手術(shù)預(yù)后及后續(xù)遺傳學(xué)檢查有著重要的指導(dǎo)意義。

另外，本研究中30例合并心臟畸形的VSD胎兒均為圓錐動(dòng)脈干畸形，這可能與胚胎期瓣下圓錐與心室間隔對(duì)接過(guò)程中發(fā)生吸收、旋轉(zhuǎn)移位、向下融合封閉室間孔過(guò)程異常有關(guān)［7］，發(fā)生率較高的分別為肺動(dòng)脈狹窄/閉鎖伴VSD、法洛四聯(lián)癥、右室雙出口。

二、VSD胎兒遺傳學(xué)檢查結(jié)果分析及產(chǎn)前咨詢指導(dǎo)

文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道，CMA/CNV-seq及WES可在超聲檢查和染色體核型分析均正常的胎兒中將陽(yáng)性檢出率提高8%～42%，對(duì)改善妊娠結(jié)局的臨床管理有所幫助，能更好地為患兒家庭的生育決策提供信息。本研究核型正常的VSD胎兒中，運(yùn)用CMA/CNV-seq和WES技術(shù)額外檢出12例異常，其中致病性CNVs 8例、單基因病4例，分子診斷率分別提高了15.1%、7.5%，其中VSD同時(shí)合并心臟及心外畸形胎兒、VSD僅合并心臟畸形胎兒的遺傳學(xué)異常率較高，分別達(dá)到43.8%、35.7%，以CNVs和單基因病的比例更高（分別為21.4%、37.6%），提示VSD胎兒若合并心臟或心外異常時(shí)，其預(yù)后除關(guān)注超聲表型外，有必要進(jìn)一步行遺傳學(xué)檢查。

本研究致病性CNVs中，6例（75%）為22q11.2微缺失綜合征；但有2例單純VSD胎兒檢出了CNVs異常，既往文獻(xiàn)［10］均未報(bào)道與VSD相關(guān)：case11檢出2q13片段微重復(fù)，該片段與生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常相關(guān)；case12檢出Xp22.31片段微重復(fù)，該片段與遺傳性兒童癲癇相關(guān)［11］。但此2例胎兒雙親均拒絕進(jìn)行來(lái)源驗(yàn)證，為其再次妊娠的遺傳咨詢?cè)斐闪死щy。

4例單基因病例中，case13為DNAAF1［12］的復(fù)合雜合突變，屬于常染色體隱性遺傳，可以導(dǎo)致異質(zhì)度高的先天性心臟病管和神經(jīng)管缺陷異常，遺傳咨詢后告知患者自然受孕得到正常胎兒的概率約1/4，建議可通過(guò)植入前診斷選擇健康胚胎受孕。case14為T(mén)UBA1A基因突變導(dǎo)致的無(wú)腦回3型［13］，為常染色體顯性遺傳，以腦畸形、小頭畸形、發(fā)育遲緩為主要臨床特征，case14主要是胼胝體缺失表型符合，而單純腭裂、PA-VSD等超聲表現(xiàn)拓展了該病的產(chǎn)前表型譜；case15為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3（FGFR3）基因［14］突變，主要為引起骨發(fā)育不良相關(guān)表型，與本研究病例心外異常表型部分相符；case16為MLL2基因突變，為常染色體顯性遺傳，可以引起主動(dòng)脈弓縮窄和骨骼系統(tǒng)異常［15］，與本研究病例心外畸形表型部分相符。通過(guò)Sanger驗(yàn)證，以上3例父母均未攜帶此位點(diǎn)，為新發(fā)突變，遺傳咨詢后建議可再次自然受孕，對(duì)此3例孕婦再次妊娠時(shí)的遺傳學(xué)指導(dǎo)有重要意義。

本研究局限性：為單中心研究，我中心為產(chǎn)前超聲診斷中心，部分病例為周邊地區(qū)異常轉(zhuǎn)診病例，所以VSD合并心臟及心外畸形胎兒比例明顯高于孤立性VSD胎兒，且部分VSD病例孕婦因?yàn)樽陨碓蜻x擇了放棄遺傳學(xué)檢查，可能會(huì)對(duì)本研究結(jié)果產(chǎn)生潛在的選擇性偏倚，無(wú)法全面顯示VSD胎兒超聲表型及遺傳變異真實(shí)情況，后續(xù)的工作中將繼續(xù)增加病例數(shù)來(lái)完善相關(guān)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)。

綜上所述，產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒VSD時(shí)，應(yīng)仔細(xì)掃查心臟及心外是否合并異常，幫助臨床醫(yī)師進(jìn)行全面的手術(shù)預(yù)后評(píng)估。同時(shí)還應(yīng)根據(jù)超聲表型異常類(lèi)型進(jìn)行進(jìn)一步遺傳學(xué)檢查，對(duì)VSD胎兒的產(chǎn)前評(píng)估、預(yù)后咨詢及孕婦再次妊娠能提供更多信息和遺傳咨詢指導(dǎo)。