趙 靜，孫 峰，李 云，趙曉珍，徐 丹，李英妮，李玉慧，孫曉麟

(北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100044)

系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis,SSc)是一種罕見的結(jié)締組織病，以全身器官血管炎和纖維化為主，臨床上主要表現(xiàn)為皮膚和內(nèi)臟的硬化，SSc患病率約為1/10 000，是死亡率高的風(fēng)濕病之一，肺間質(zhì)纖維化和肺動脈高壓是導(dǎo)致SSc死亡的主要并發(fā)癥[1-2]。SSc發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種細(xì)胞因子和自身抗體參與了SSc的發(fā)生、發(fā)展[3]，其中一些已知的自身抗體，如抗著絲點(diǎn)抗體(anti-centromere antibodies, ACA)和抗Scl-70抗體等，在一定程度上對診斷和評價疾病有幫助，但這些抗體在自身免疫病中廣泛存在，缺乏特異性，作用的機(jī)制尚不清楚[4]。SSc病情進(jìn)展快，預(yù)后差，早期診斷和對癥治療至關(guān)重要。發(fā)現(xiàn)并確定特定的生物標(biāo)志物，將有助于提高SSc的診療水平，盡早改善臨床癥狀，及時緩解皮膚、臟器纖維化等并發(fā)癥。

微管蛋白(tubulin)是細(xì)胞的一種骨架蛋白。微管蛋白超家族[5]包括6個不同的家族，即α,β,γ,δ,ε和ζ-微管蛋白。α和β-微管蛋白是微管的主要成分，而γ-微管蛋白在微管組裝的成核中起主要作用。Tubulin-α-1C又稱微管蛋白α-6[6]，是α-微管蛋白家族成員之一，廣泛表達(dá)于包括骨髓在內(nèi)的27個組織中，tubulin-α-1C對維持細(xì)胞形態(tài)、物質(zhì)運(yùn)輸和定位等起關(guān)鍵作用。早期抗tubulin抗體主要集中在神經(jīng)精神疾病、感染和腫瘤中，在自身免疫病中的研究甚少。近年有研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)中抗tubulin-α-1C抗體升高，可能加重患者皮膚病變和血管炎癥狀，而在其他結(jié)締組織病中，抗tubulin-α-1C抗體是否有同樣的效應(yīng)，沒有進(jìn)一步研究。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測了SSc患者、SLE患者、原發(fā)性干燥綜合征(primary Sj?gren’s syndrome, pSS)患者和健康人外周血中抗tubulin-α-1C抗體的表達(dá)水平，分析抗tubulin-α-1C抗體與SSc臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性，并探討抗tubulin-α-1C抗體在SSc診斷中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究納入2014年1月至2018年11月就診于北京大學(xué)人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科的住院SSc患者62例為實(shí)驗(yàn)組，平均年齡(54.8±13.11)歲，其中男性5例，女性57例，入選患者均符合2017年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟聯(lián)合發(fā)布的《系統(tǒng)性硬化癥診療指南》中SSc新診療標(biāo)準(zhǔn)[7]，其臨床及實(shí)驗(yàn)室資料完善，同時排除合并心血管病及其他自身免疫病。選取年齡性別相匹配SLE患者38例、pSS患者24例以及體檢中心的健康人(health control, HC)30例作為對照組。

本研究獲得北京大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(2018PHB147-01), 研究對象包括患者和健康人均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)室和臨床相關(guān)指標(biāo)

記錄患者臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括性別、年齡、病程、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor, RF)、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、ACA、抗心磷脂抗體(anticardiolipin, aCL)、抗雙鏈DNA抗體(抗dsDNA抗體)、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗Scl-70抗體、抗Ro-52抗體、抗SSA抗體、抗SSB抗體、著絲點(diǎn)蛋白A(centromere protein A,CENP-A)、著絲點(diǎn)蛋白B(centromere protein B,CENP-B)、雷諾現(xiàn)象等指標(biāo)，用改良的Rodnan評分(modified Rodnan skin score, MRSS)評估SSc患者皮膚改變。檢測前所有的血清樣本均保存在-80 ℃冰箱。

1.3 血清中抗tubulin-α-1C抗體檢測

用ELISA方法檢測血清中抗tubulin-α-1C抗體的濃度。首先，用濃度為10 mg/L的重組tubulin-α-1C蛋白(Origene公司, 北京) 包被96孔板，放置在4 ℃過夜。用含0.05%(體積分?jǐn)?shù))吐溫的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗4遍后，加入3% (體積分?jǐn)?shù))PBS稀釋的牛血清白蛋白常溫封閉3.5 h。血清用PBS 1 ∶100稀釋后加入微孔板反應(yīng)，加入酶標(biāo)二抗,洗滌后加TMB(3，3’，5，5’-tetramethylben-zidine liquid substrate)顯色液，室溫避光反應(yīng)10 min；每孔加入2 mol/L硫酸終止，10 min內(nèi)放入雙波長酶標(biāo)儀(檢測濾光片450 nm, 參考濾光片630 nm)中讀取光密度(D)值。所有樣品均做復(fù)孔，每板設(shè)置空白對照，同時為減少板間差異，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)血清對照，標(biāo)準(zhǔn)血清由10份SSc患者血清混合組成，所得D值換算成arbitary units(AU)值：

AU值=[待測血清(D抗tubulin-α-1C-D空白)/標(biāo)準(zhǔn)血清(D抗tubulin-α-1C-D空白)] ×100。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 5軟件處理，計量資料描述為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組間比較先進(jìn)行F檢驗(yàn)，如果方差齊用LSD法兩兩比較，如果方差不齊用Dunett-t法進(jìn)行比較；兩組間差異的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計數(shù)資料用率或構(gòu)成比描述，組間率或構(gòu)成比的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，雙變量采用Spearman相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗tubulin-α-1C抗體在SSc、SLE、pSS及HC血清中的濃度比較

2.2 分析抗tubulin-α-1C抗體對于診斷SSc價值

繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線，曲線下面積 (area under the curve, AUC)為0.805，對應(yīng)的敏感性是43.55%～46.77%，特異性是86.54%。

2.3 SSc患者血清抗tubulin-α-1C抗體陽性組與陰性組間臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的分析

根據(jù)陽性閾值的設(shè)定將62例SSc患者分為抗tubulin-α-1C抗體陽性組(29例)和陰性組(33例)，結(jié)果顯示抗tubulin-α-1C抗體陽性組與抗tubulin-α-1C抗體陰性組間有多個實(shí)驗(yàn)室和臨床指標(biāo)存在明顯差異，抗tubulin-α-1C抗體陽性組中抗Scl-70抗體、ACA、aCL的陽性率、ESR、雷諾現(xiàn)象明顯高于抗tubulin-α-1C抗體陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CRP、免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、補(bǔ)體(C3、C4)及RF等水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 抗tubulin-α-1C抗體陽性組與陰性組間實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較Table 1 Clinical and laboratory characteristics of SSc patients with the elevated and normal levels of serum anti-tubulin-α-1C

2.4 SSc患者血清抗tubulin-α-1C抗體水平與實(shí)驗(yàn)室和臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

對SSc患者的臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，顯示血清中抗tubulin-α-1C抗體水平與疾病活動指標(biāo)相關(guān)：ESR (r=0.313,P=0.019)、MRSS (r=0.636,P<0.001)，其他臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均無相關(guān)性(表2)。

表2 血清抗tubulin-α-1C抗體與SSc患者其他臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)間的相關(guān)性Table 2 Correlation of serum anti-tubulin-α-1C with clinical features of SSc patients

3 討論

SSc以血管損傷、免疫功能失調(diào)及多器官纖維化為主要病理機(jī)制，最終導(dǎo)致皮膚及內(nèi)臟器官過量纖維化，可導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙和幾乎所有內(nèi)臟器官衰竭，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全。SSc的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前研究主要包括遺傳與環(huán)境因素、免疫的影響、膠原產(chǎn)生過度及成纖維細(xì)胞功能異常、血管功能異常等。微管蛋白是微管的基本單位，它構(gòu)成細(xì)胞骨架的一部分，在細(xì)胞分裂過程中形成紡錘體纖維，有證據(jù)表明，抗微管蛋白抗體存在于包括人類在內(nèi)的正常哺乳動物的血清中[8-12]，但這些天然的抗微管蛋白自身抗體通常在體內(nèi)含量很低[13]，這些自身抗體異常升高常與其他器官特異性自身免疫性疾病有關(guān)，包括毒性彌漫性甲狀腺腫(Graves病)、橋本甲狀腺炎、脫髓鞘疾病等[14]，患者自身的微管蛋白在炎癥條件下從受損細(xì)胞中釋放出來，可引發(fā)一系列自身免疫反應(yīng)?？箃ubulin-α抗體是針對微管蛋白分子成員之一tubulin-α的特異性自身抗體，早期僅在肺移植后的慢性同種異體排斥反應(yīng)患者中觀察到[8-9]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在確診的SLE患者血清中抗tubulin-α-1C抗體異常升高，并且升高的抗tubulin-α-1C抗體與SLE皮膚病變的發(fā)生率有關(guān)，包括皮疹和口腔潰瘍[15]。

本研究中，我們測定和比較了SSc、SLE、pSS患者和健康對照者的血清抗tubulin-α-1C自身抗體水平。與pSS患者和健康對照組相比，抗tubulin-α-1C抗體在SSc患者血清中顯著升高，但是和SLE區(qū)別不大。我們進(jìn)一步揭示了這種新的自身抗體在SSc中的臨床相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)抗tubulin-α-1C抗體的升高與ESR和反映皮膚病變的MRSS有關(guān)。SSc炎癥環(huán)境中存在大量受損或未清除的死亡細(xì)胞，細(xì)胞裂解釋放出tubulin-α-1C，抗tubulin-α-1C抗體可能與釋放的tubulin-α-1C形成免疫復(fù)合物，導(dǎo)致免疫復(fù)合物沉積，隨后發(fā)生放大的炎癥反應(yīng)和組織破壞，促進(jìn)膠原表達(dá)的細(xì)胞因子增多(如轉(zhuǎn)化生長因子β、血小板源性生長因子等)， 增加膠原和其他結(jié)締組織大分子物質(zhì)合成，沉積在結(jié)締組織中，引起組織纖維化，出現(xiàn)皮膚和內(nèi)臟損害的表現(xiàn)。

除通過免疫復(fù)合物形成的致病作用外，抗tubulin-α-1C與細(xì)胞表面抗原的直接結(jié)合也可能引起炎癥反應(yīng)。以往的研究顯示抗Kα-1微管蛋白與上皮細(xì)胞結(jié)合可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子5(TCF5)的表達(dá)增加，TCF5是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)基因的調(diào)控和纖維增生級聯(lián)[16-17]，誘導(dǎo)下游促炎效應(yīng)因子如血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，釋放大量的炎癥細(xì)胞和免疫介質(zhì)。這些免疫介質(zhì)刺激纖維母細(xì)胞，產(chǎn)生大量膠原及細(xì)胞外基質(zhì)，沉積在組織中，加重組織損傷(如肺間質(zhì)纖維化)，并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成血管腔狹窄及閉塞，在疾病的早期出現(xiàn)雷諾現(xiàn)象。然而，抗tubulin-α-1C在SSc血管炎中的確切發(fā)病機(jī)制是否遵循上述相同的機(jī)制仍有待實(shí)驗(yàn)研究，下一步的組織培養(yǎng)或動物模型研究將用于解決抗tubulin-α-1C 在SSc血管炎發(fā)展中的作用。

本研究僅僅反映了抗tubulin-α-1C抗體在SSc中可能的臨床意義，沒有闡明具體的病理生理途徑，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本并開展更深入的機(jī)制研究有可能為SSc的診斷及風(fēng)險預(yù)測提供一個血清學(xué)標(biāo)志的有益補(bǔ)充，并可能進(jìn)一步揭示SSc發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。