周佳佳，王 秋，王 勛

(貴州黔西南喀斯特區(qū)域發(fā)展研究院，貴州 興義 562400)

安龍縣位于25°N，是中國食用菌產(chǎn)業(yè)的黃金地帶[1]。但安龍縣食用菌企業(yè)食用菌母種和原種生產(chǎn)量較少，本地菌種制作技術(shù)落后、生產(chǎn)管理不規(guī)范，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)規(guī)程，對(duì)食用菌的可持續(xù)發(fā)展造成了巨大阻礙。食用菌的品質(zhì)和產(chǎn)量得不到保證，次品菇多、出菌率低且容易死亡，產(chǎn)業(yè)減收達(dá)30%左右，部分菇農(nóng)甚至絕收[2]。采用純度高、活力強(qiáng)、接種后發(fā)菌快、成本低的食用菌液體菌種法可增加生產(chǎn)廠房及設(shè)備周轉(zhuǎn)率[3]。以貴州山環(huán)菌草科技有限公司為代表的高新技術(shù)食用菌公司，廣泛引進(jìn)及研發(fā)液體菌種技術(shù)及相關(guān)生產(chǎn)線，將液體菌種技術(shù)應(yīng)用于平菇、香菇等大宗食用菌生產(chǎn)中，降本增效顯著。

一、液體菌種生產(chǎn)工藝流程

三角瓶空消—種子瓶液體培養(yǎng)基質(zhì)的制作—121℃高壓蒸汽滅菌20 min—冷卻至25℃—接種—搖床培養(yǎng)—發(fā)酵罐的清洗—發(fā)酵罐煮罐—發(fā)酵罐培養(yǎng)基質(zhì)的制作—121℃高壓蒸汽滅菌—冷卻至25℃—接種—菌絲發(fā)酵培養(yǎng)—菌種質(zhì)量檢測(cè)—接種至料棒—發(fā)菌培養(yǎng)。

二、秀珍菇培養(yǎng)基配方

1、搖瓶培養(yǎng)基配方

1000 mL三角瓶：營(yíng)養(yǎng)粉11%、葡萄糖1.5%、磷酸二氫鉀2‰、硫酸鎂1‰。

培養(yǎng)基滅菌條件：高壓蒸汽滅菌，121℃，30 min。

2、發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基質(zhì)配方

800 L 液體發(fā)酵罐：營(yíng)養(yǎng)粉0.7%、葡萄糖1%、紅糖1%、消泡劑1‰。

3、檢測(cè)培養(yǎng)基配方

250 mL 三角瓶：棉籽殼70%、麥麩28%、葡萄糖2%。

三、種子瓶液體菌種生產(chǎn)技術(shù)

三角瓶在使用前需徹底清潔，然后進(jìn)行121℃高壓蒸汽滅菌20 min 空消，消毒后轉(zhuǎn)移到烘箱內(nèi)烘干備用。1000 mL 三角瓶裝液量上限為500 mL，裝液量不宜過多，過多易導(dǎo)致污染。

依照種子瓶配方進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)稱量配制。應(yīng)先稱取營(yíng)養(yǎng)粉，加入一半體積的RO 水，加熱溶解，再加入其余的原料至溶解，稍微冷卻后放入搖瓶中。將瓶口用紗布棉塞或砂芯硅膠膠塞密封瓶口，在外層用牛皮紙包扎進(jìn)行二次封裝后，將搖瓶正置放入高壓滅菌鍋中，121℃、壓力為0.15MPa 下滅菌20 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，在超凈工作臺(tái)中，依照無菌操作規(guī)程進(jìn)行接搖瓶種。采用0.5 mm 打孔器接入8-10 塊秀珍菇母種菌塊，接種結(jié)束后消毒瓶口，塞好棉塞或橡膠塞。然后放入搖床，設(shè)定溫度25℃，轉(zhuǎn)速120 rpm/min，培養(yǎng)6-7 天。

搖瓶靜止時(shí)，菌球大小均勻，顆粒分明，菌球周邊菌絲明顯，培養(yǎng)液清澈。若搖瓶生長(zhǎng)期間氣味惡臭、培養(yǎng)液渾濁、菌球形態(tài)異常，則可能出現(xiàn)污染，需進(jìn)一步采用顯微鏡鏡檢確定是否污染，再?zèng)Q定是否可以生產(chǎn)使用。

四、發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)技術(shù)

1、發(fā)酵罐的清洗及檢查

發(fā)酵罐在每次生產(chǎn)周期結(jié)束后及下個(gè)生產(chǎn)周期開始前，需對(duì)其進(jìn)行無死角的清洗并進(jìn)行空消及煮罐后才能投料使用。發(fā)酵罐清洗的主要目的是去除罐壁及死角的菌球、菌塊、料液及其他可能造成繼發(fā)污染的殘留物。發(fā)酵罐的檢查主要是保證接種閥和接種口放氣閥通道通暢無異物、壓力表和安全閥正常及罐口密封。

2、煮罐

為保證液體菌種品質(zhì)，在制罐前一般要對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行煮罐，特別是感染過雜菌的發(fā)酵罐。發(fā)酵罐罐體加水至視鏡底線，約為罐體總?cè)莘e的80%后，連接蒸汽發(fā)生器進(jìn)行加熱滅菌，打開罐頂氣流控制閥，充分排出罐內(nèi)上層的冷空氣后，關(guān)閉所有的閥門讓罐內(nèi)溫度和壓力升高至100℃、0.05MPa 后，打開罐頂氣流控制閥，進(jìn)一步放空罐內(nèi)冷空氣，使滅菌更加徹底。關(guān)閉罐頂氣流控制閥后，待罐內(nèi)溫度達(dá)到121℃、壓力達(dá)到0.12－0.15 MPa后，調(diào)節(jié)蒸汽發(fā)生器，維持罐壓和溫度30 min，期間3-4 次打開排料口，維持每秒3-5 滴排料量，每次排料1-2 min，滅菌結(jié)束后關(guān)閉蒸汽發(fā)生器。罐壓降至0.05 MPa 時(shí)，打開接種閥，使罐內(nèi)的高溫水通過排料口進(jìn)入到料管及接種槍，殺菌10 min后關(guān)閉排料口閥門。將接種槍密封在裝有75%酒精的自封袋內(nèi)，保持其無菌狀態(tài)，以備接種使用。

3、發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基質(zhì)的制作及滅菌

發(fā)酵罐內(nèi)層加水至視鏡底線，打開氧氣呼吸器和罐頂氣流控制閥，連接蒸汽器加熱到30℃以上。然后按照發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基質(zhì)的配方稱取原料，依次倒入發(fā)酵罐中，加入消泡劑攪拌均勻，蓋上罐口。當(dāng)培養(yǎng)液溫度達(dá)到80℃時(shí)關(guān)閉氧氣呼吸器，溫度升至105℃時(shí)關(guān)閉罐頂氣流控制閥。當(dāng)壓力達(dá)到0.12-0.15 MPa，調(diào)節(jié)蒸汽發(fā)生器，使溫度保持為121℃，維持60 min。

4、降溫

液體培養(yǎng)基質(zhì)滅菌完畢后打開罐頂氣流控制閥，30 min 后發(fā)酵罐夾層迅速通水降溫。降溫過程中發(fā)酵罐要打開氧氣呼吸器通氣，一方面攪拌降溫，另一方面給發(fā)酵罐內(nèi)加壓，使發(fā)酵罐維持正壓。盡快使發(fā)酵液溫度降至27℃以下，減少營(yíng)養(yǎng)損失。

5、接種

將搖瓶接種口和發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒，用95%酒精的火焰圈套在接種口上，然后完全打開罐頂氣流控制閥，使發(fā)酵罐壓力為0 MPa。點(diǎn)燃火焰圈，打開接種口，關(guān)閉罐頂氣流控制閥，將搖瓶接種口置于火焰上方，用鑷子去掉搖瓶上的牛皮紙和棉塞，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐中。然后擰上接種口，去掉火焰圈，調(diào)節(jié)罐頂氣流控制閥，使發(fā)酵罐維持正壓。

6、培養(yǎng)及檢測(cè)

通氣后調(diào)節(jié)呼吸器，使罐內(nèi)壓力穩(wěn)定在0.02-0.03 MPa，培養(yǎng)2-3 天后可看到小米粒狀的菌絲球。罐頂氣流控制閥排出的液體培養(yǎng)基質(zhì)的香味隨著培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)越來越淡，菌絲球濃度和菌液粘度逐漸增大，適當(dāng)增加氧氣，調(diào)節(jié)氧氣呼吸器。秀珍菇生長(zhǎng)周期為6-7 天，培養(yǎng)好的液體菌種取樣后放置5 min 基本分層。菌球大小均勻，顆粒分明，菌球周邊菌絲明顯。培養(yǎng)4 天后間隔12 h 用檢測(cè)培養(yǎng)基取樣，恒溫箱培養(yǎng)24 h 后觀察菌種走絲情況，取樣時(shí)需75%酒精消毒和火焰圈保護(hù)。

五、接種

確認(rèn)菌種無污染且菌絲生長(zhǎng)正常后，將滅菌接種膠管和接種槍接上接種閥門，接種時(shí)適當(dāng)放掉一部分菌種，減少感染機(jī)會(huì)。要在已消毒的接種車間進(jìn)行接種工作，接種槍伸入菌棒窩口中間接入40-50 mL，塞上已提前高溫滅菌的海綿塞即可。

六、污染液體菌種的處理

發(fā)現(xiàn)雜菌感染的液體菌種應(yīng)及時(shí)關(guān)上發(fā)酵罐的排氣閥，避免雜菌在發(fā)酵室爆發(fā)性生長(zhǎng)，然后接種閥接上排廢管通入下水道，使罐內(nèi)的菌種通過排廢管排出，及時(shí)清洗發(fā)酵罐，并對(duì)發(fā)酵室進(jìn)行消毒。

七、生產(chǎn)效益

目前，秀珍菇的菌種生產(chǎn)工藝多采用三級(jí)固體菌種模式，逐級(jí)擴(kuò)繁生產(chǎn)母種、原種及栽培種，存在菌種成本高、制種周期長(zhǎng)、用種量大、人工成本高、發(fā)菌周期長(zhǎng)、菌齡不一致等問題。

采用液體菌種法每年可節(jié)約菌種生產(chǎn)費(fèi)用約75 萬元，同時(shí)縮短生產(chǎn)周期30 天，有效降低了菌種生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，減少了人工成本及環(huán)境維持成本。目前，液體菌種已經(jīng)在安龍縣秀珍菇產(chǎn)業(yè)得到了一定規(guī)模的推廣應(yīng)用，取得了優(yōu)異的效果，為全縣食用菌產(chǎn)業(yè)的集約化可持續(xù)發(fā)展提供了有力支撐。