張紅娜，周玉法，龐全海

(1 .河北經(jīng)貿(mào)大學 生物科學與工程學院，石家莊 050061；2.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，山西太谷 030801；3.泰安市岱岳區(qū)畜牧局，山東泰安 271000)

為了降低畜產(chǎn)品中的藥物殘留以及控制養(yǎng)殖業(yè)中耐藥菌的散播，目前益生菌在畜牧業(yè)中得到廣泛應用，不僅因為日糧中添加益生菌可以作為抗生素的替代品促進動物的生長，提高免疫力和維持腸道健康，而且益生菌的添加還可改善養(yǎng)殖環(huán)境，提高畜產(chǎn)品的存儲質(zhì)量[1-2]。

芽孢桿菌屬中已經(jīng)有許多菌株被用作益生菌，如枯草芽孢桿菌、克勞斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，其孢子處于休眠狀態(tài)具有耐高溫、耐干燥等特性，在腸道內(nèi)萌發(fā)為營養(yǎng)細胞對動物的腸道健康起著至關重要的作用[3-4]。這些益生菌之所以具有益生功效與其能產(chǎn)生大量的次級代謝產(chǎn)物密不可分，比如生物活性肽、聚酮類化合物、脂肪酸、硫辛酰胺等[5-7]。筆者前期研究中發(fā)現(xiàn)，日糧中添加解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238可改善蛋雞盲腸菌群多樣性，調(diào)控腸道粘膜中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂類消化和腸道吸收等生物學過程相關基因的表達，增強腸道營養(yǎng)吸收能力和飼料利用率，從而提高蛋雞生產(chǎn)性能[8-9]。

目前，關于動物益生菌的研究主要側(cè)重于從動物的角度探討其發(fā)揮益生功效的機理，但很少有研究從益生菌的功能基因組學角度去闡述其益生機制[10-11]。功能基因組學又被稱為后基因組學，可以從基因組整體水平上對基因功能進行比較和分析，是挖掘基因功能的有效手段[10]。因此，本研究利用功能基因組學的方法，通過分析解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238的基因組特點，明確其在動物機體內(nèi)發(fā)揮益生功效的相關機制，為后續(xù)開發(fā)和利用提供科學數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DNA提取試劑盒由QIAGEN公司提供；Tiangen凝膠回收試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供；Nextera XT DNA sample preparation kit由Illumina公司；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies公司)；Illumina MiSeq測序平臺(Illumina公司)。

1.2 基因組測序和注釋

解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238菌株由山東寶來利來生物工程有限公司提供，經(jīng)鑒定為純菌種。首先，將解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238菌株在TSB瓊脂板中37 ℃培養(yǎng)24 h，再在TSB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，繪制生長曲線，選擇OD600=1.2，濃度為108cfu/mL的菌液進行后續(xù)檢測。參照試劑盒說明提取和純化菌株DNA，根據(jù)Nextera XT DNA sample preparation kit構(gòu)建DNA片段文庫，隨后在Illumina MiSeq平臺進行測序。

測序結(jié)果使用Trimmomatic軟件[12]進行修剪處理，用FastQC軟件[13]進行質(zhì)量評價，合格后用CLC Genomics Workbench、A5-miseq[14]和SPAdes[15]軟件對序列片段進行組裝，在組裝的過程中考慮contigs的數(shù)量、平均長度、N50和最大長度。應用Mauve軟件[16]對contigs進行排序后提交至RAST server[17]中進行自動基因 注釋。

1.3 基因組比較

利用R2Cat、BRIG和NCBI中BLAST做基因組比較[18]。選取已提交的全基因組序列且與解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238具有高同源性的7個芽孢菌屬的菌株作為比較對象。利用Genome-Genome Distance Calculator (GGDC) 2.0 BLAST+計算體外DNA-DNA雜交值(DNA-DNA hybridization，DDH)，70%DDH被看做是不同種的臨界值[19]。采用JSpecies軟件[20]計算不同菌株序列間的平均核酸同源性(Average Nucleotide Identity，ANI)，當ANI>95%且與70% DDH的分析結(jié)果一致則認為是同一個 菌種。

1.4 基因組數(shù)據(jù)挖掘次級代謝產(chǎn)物和水解酶

采用RAST server對推測的蛋白序列進行注釋。借助于CAZymes Analysis Toolkit[21]和MEROPS[22]數(shù)據(jù)庫對水解酶和肽酶進行分析，利用在線工具NP.searcher和antiSMASH[23]鑒定次級代謝產(chǎn)物的基因簇，用NRPSpredictor2分析能合成次級代謝產(chǎn)物的非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases，NRPS)[24]。與參照基因相比，當解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238擁有>65%的同源性且覆蓋率>85%，則認為是相同的基因或基因簇。對于假定的蛋白序列參照NCBI的非重復數(shù)據(jù)庫用BLASTP算法進行預測，設置E-value<1×10-5。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組比較和注釋

經(jīng)基因組測序發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組大小約為3.88 Mb，G+C含量為46.6%，RAST自動注釋了3 941編碼序列，其中89個對應rRNA基因。利用NCBI數(shù)據(jù)庫進行全基因組比對發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238與其他解淀粉芽孢桿菌具有最高的同源性為99%，序列覆蓋范圍為95%～96%(圖1)。解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他解淀粉芽孢桿菌的平均核苷酸同源性>95%，具有高一致性(表1)。從推測DDH可知，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238與解淀粉芽孢桿菌CAU B946的預測值為98.89%(表2)?？傊?，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238在分類上屬于解淀粉芽孢桿菌。

2.2 抗菌代謝產(chǎn)物

在解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238菌株基因組中，共有8個基因簇編碼抗菌次級代謝產(chǎn)物，且與其他芽孢桿菌具有高的一致性，主要包括聚酮類化合物、環(huán)二肽、非核糖體合成的脂肽、細菌粘附和聚集基因(圖2)。

2.2.1 聚酮類化合物 經(jīng)AntiSMASH和NP.searcher servers分析(圖2)，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組中bae基因簇(72.5 kb)負責聚酮類化合物bacillaene的生物合成，與CAU B946、FZB42(B.amyloliquefaciensFZB42)分別具有100%、97%的同源性，并且解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238與CAU B946基因組中bae基因簇的構(gòu)成分布相同。解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238的基因組中dfn基因簇(70 kb)參與聚酮類化合物difficidin的生物合成，與CAU B946具有88%的同源性，其差異主要集中在dfnI和dfnD基因開放閱讀框。此外，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組中mln基因簇(54.8 kb)負責大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(macrolactin)的生物合成，與CAU B946的同源性達到98%。

2.2.2 環(huán)二肽 解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組中編碼環(huán)二肽bacillibactin基因簇為11 kb，與CAU B946的同源性為96%；編碼環(huán)二肽bacilysin的基因簇與M27(B.amyloliquefacienssbusp. plantarum M27)具有100%的同源性 (圖2)。

2.2.3 非核糖體合成的脂肽 在解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238的基因組中含有表面活性素(surfactin)、依枯草菌素(iturin)、泛革素(fengycin)的編碼基因簇(圖2)。表面活性素基因簇與CAUB 946有95%的同源性，由4個開放閱讀框組成，分別是srfAA、srfAB、srfAC和srfAD。依枯草菌素基因簇與FZB42有98%的同源性，也包含4個開放閱讀框，分別是ituAA、ituAB、ituAC和ituAD。泛革素基因簇與FZB42有98%的同源性，含有5個開放閱讀框，分別是fenA、fenB、fenC、fenD和fenE。同時，AntiSMASH工具還預測到了羅克霉素(locillomycin)的編碼基因簇，且與LFB112(B.amyloliquefaciensLFB112)有99%的同源性。

圖1 解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238與7株近緣的芽孢桿菌基因組比較分析Fig.1 Genome comparison between genome of BLCC1-0238 and seven closest Bacillus species

表1 8個芽孢桿菌基因組平均核苷酸同源性分析Table 1 Average nucleotide identity analyses among 8 genomes of Bacillus species

表2 解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238與7個近緣芽孢桿菌基因組的DDH預測結(jié)果Table 2 DDH prediction of genomes from BLCC1-0238 and 7 closest Bacillus species

2.2.4 細菌黏附素和聚集素 通過對生物表面活性素的基因簇進行RAST自動注釋分析，發(fā)現(xiàn)一個細菌素編碼基因。經(jīng)tBlastN進一步分析，發(fā)現(xiàn)一個編碼肽基脯氨酰異構(gòu)酶的基因序列(PrsA)，該基因編碼的蛋白含有296個氨基酸，能協(xié)助細菌粘附在腸道細胞表面。

2.3 耐酸基因和水解酶

經(jīng)分析，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238菌株中含有12個與抗酸脅迫相關的基因(表3)，含有7種酶參與蛋白降解(表4)。

3 討論與結(jié)論

本研究從益生菌自身角度分析全基因組功能，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組中含有與抗菌物質(zhì)合成相關的基因簇。研究表明，芽孢桿菌通?？梢援a(chǎn)生化學結(jié)構(gòu)各異的多種抗菌物質(zhì)，參與抗菌物質(zhì)合成的基因堿基數(shù)可達350 kb，但目前還沒有發(fā)現(xiàn)一種芽孢桿菌可同時擁有這些編碼基因[25]。合成表面活性素的基因簇通常超過25 kb，包含4個開放閱讀框[26]；合成依枯草菌素的基因簇也包括4個大的開放閱讀框，2個基因簇在枯草芽孢桿菌中廣泛存在[27]，這與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)在解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組中合成表面活性素和依枯草菌素的基因簇比較保守，且分別與已經(jīng)報道的解淀粉芽孢桿菌CAUB 946 和FZB42具有高的同源性。表面活性素是一種環(huán)狀的七肽結(jié)構(gòu)，含有鏈接在β-羥基脂肪酸鏈上的D-氨基酸殘基，能夠通過改變細胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)揮溶血，抗菌和抗病毒的作用[28]。腸道中表面活性素的存在會增加芽孢桿菌和腸道黏膜的相互粘附作用，可有效的阻斷致病菌的入侵，與腸道黏膜的黏附能力也是考量益生菌的重要指標[26]。依枯草菌素的結(jié)構(gòu)與表面活性素相似，含有半個環(huán)狀的七肽結(jié)構(gòu)和一個β-羥基脂肪酸鏈。由于多肽鏈上氨基酸殘基的易變性，依枯草菌素在形態(tài)上具有多樣性，可分為依枯草菌素A、B、C、D和芽孢菌霉素D、F、L、Lc和枯草菌抗霉素[27]。研究表明，依枯草菌素對植物真菌病原具有良好的拮抗作用[29]。筆者前期研究表明，在蛋雞日糧添加解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238后，盲腸中乳酸桿菌屬等有益菌的相對豐度增加，而很多條件性致病菌的相對豐度降低，說明解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238能夠在一定程度上抑制病原微生物的繁殖，參與調(diào)節(jié)腸道微生物之間平衡，這與該益生菌的抗菌代謝產(chǎn)物密切相關[9]。

BLCC1-0238 (上方)，CAU B946 (綠色箭頭，下方)，F(xiàn)ZB42 (藍灰色箭頭，下方)

表3 解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238中耐酸性相關基因Table 3 Genes related to acid tolerance in BLCC1-0238

表4 解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238菌株中水解酶相關基因Table 4 Genes related to hydrolytic enzymes in BLCC1-0238

本研究解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組中還包括合成脂肽類抗生素物質(zhì)泛革素和羅克霉素的基因簇。泛革素類似于制磷脂菌素是環(huán)狀的十肽結(jié)構(gòu)，含有4個D-氨基酸殘基，這些氨基酸殘基連接在含有16-19個碳原子的β-羥基脂肪酸鏈上。研究表明，泛革素抗菌物質(zhì)能有效地對抗絲狀真菌，抑制磷酸酶A2的活性[30]。羅克霉素是環(huán)狀脂肽的新家族，試驗表明它能有效的對抗細菌、真菌和病毒，由于其具有較低的溶血活性，因此具有較好的實踐應用前景[31]。與bacillaene和difficidin生物合成相關的聚酮類化合物合成酶I 型bae和dif基因簇也在本研究解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238中找到。研究表明，這些聚酮類化合物能有效地抑制細菌蛋白的合成[32]。另外，具有抗菌作用的聚酮類化合物大環(huán)內(nèi)酯抗生素的生物合成基因簇也在解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238中存在。前期研究中日糧添加解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238后，蛋雞血清中IL-1和IL-6炎癥因子下降[8]，而且腸道粘膜中編碼組氨酸脫羧酶的基因顯著下調(diào)，組胺生成下降，從而減少機體發(fā)生過敏性炎癥。這與該益生菌能夠編碼聚酮類代謝產(chǎn)物相關[9]。

益生菌需要在腸道中存活才能發(fā)揮益生功效，這就需要益生菌有能力對抗腸道的pH和膽汁鹽等惡劣環(huán)境。本研究中解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238菌株含有抗酸脅迫相關的基因，σB因子和σB調(diào)控蛋白。研究表示，σB因子包括150多個調(diào)節(jié)子成員，當芽孢桿菌遇到酸、鹽、乙醇、NO、高溫或低溫等多種刺激的時候，會表達多種調(diào)節(jié)因子進行抵抗，賦予細胞對抗惡劣環(huán)境的能力[33]。σB因子的活化受到rsbV/rsbW保守基因和RsbS基因的調(diào)控，這些基因也都在解淀粉芽孢桿菌解BLCC1-0238菌株的基因組中找到，可使細胞應對遇到的脅迫環(huán)境[34]。

本研究解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238基因組中還有大量編碼水解酶的基因，其中就有膽汁鹽水解酶，它能使細菌對抗膽汁鹽的脅迫[35-36]。此外，植酸酶和糖苷水解酶在動物的消化吸收中起重要作用，尤其是單胃動物，比如：豬、家禽和魚等[35]。前期結(jié)果證實解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238不僅能夠降低料蛋比，增加蛋殼厚度和強度，而且在能夠上調(diào)腸道粘膜上與碳水化合物代謝、脂類消化和腸道吸收等生物過程相關基因的表達，與本次結(jié)果相一致。因此，解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238通過自身表達水解酶和增強腸道物質(zhì)代謝與營養(yǎng)吸收能力等多個角度來提高蛋雞生產(chǎn)性能[9]。

本研究通過全基因組分析在解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238發(fā)現(xiàn)多個參與抗菌肽合成的基因簇、耐酸相關基因和編碼水解酶的基因。這些基因的存在有助于動物機體對抗病原菌和各種脅迫因素，還有利于機體對飼料營養(yǎng)的消化和吸收。綜上所述，本研究從益生菌基因組的角度闡述解淀粉芽孢桿菌的益生機制，為進一步開發(fā)利用解淀粉芽孢桿菌提供科學數(shù)據(jù)。