霍晉彥，曹洪玉，儲曉慧，馮寶民，于宗霞

（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622）

β-欖香烯是一種廣譜、高效、副作用少的抗腫瘤藥物，對肺癌、胃癌和肝癌等淺表性腫瘤有明顯的治療作用，在臨床上β-欖香烯乳制劑聯(lián)合生物堿、高三尖杉酯堿、蒽環(huán)素等抗癌藥物使用，可有效提高患者存活率，降低毒副作用[1].β-欖香烯目前主要從莪術(shù)（Curcuma zedoaria（Christm.）Rosc.）、廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang）、加拿大一枝黃花（Solidago canadensis）等[2]植物中提取獲得，由于種質(zhì)資源退化等原因，天然β-欖香烯的產(chǎn)量和質(zhì)量均無法滿足市場需求[3]，因此β-欖香烯的人工合成具有重要應(yīng)用價值.吉馬烯A是一種在植物中分布比較廣泛的倍半萜類化合物，有研究表明，吉馬烯A在體外可經(jīng)過高溫轉(zhuǎn)化為β-欖香烯[4]，因此利用生物技術(shù)對β-欖香烯的合成前體吉馬烯A的合酶基因[5]進(jìn)行改造，提高其前體的產(chǎn)量是間接提高β-欖香烯產(chǎn)量的重要方法之一.

吉馬烯A合酶（ScGAS）在GenBank中的序列號為AJ304452.1，具有底物專一性強[6]、副產(chǎn)物少（產(chǎn)物中98%是吉馬烯A[5]）、酶活性高等優(yōu)點[4].法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）是倍半萜合酶的最適底物，當(dāng)FPP進(jìn)入倍半萜合酶活性中心時，入口處的保守基序DDxxD及反面的NSE/DTE基序結(jié)合3個二價金屬離子形成離子簇，與FPP的焦磷酸基團發(fā)生配位作用形成復(fù)合體，關(guān)閉活性中心.復(fù)合體與活性中心的氨基酸形成氫鍵，穩(wěn)定催化反應(yīng)構(gòu)象.隨后，F(xiàn)PP的焦磷酸基團離去，在關(guān)閉的活性中心直接（或異構(gòu)化）發(fā)生多次分子內(nèi)親電加成級聯(lián)反應(yīng)，形成特定的環(huán)狀倍半萜陽離子，最后陽離子發(fā)生去質(zhì)子化或捕獲水分子的終止反應(yīng)，生成相應(yīng)的倍半萜烯或醇[7].ScGAS活性位點內(nèi)外具有可以改變酶產(chǎn)物特異性的氨基酸殘基，即可塑性殘基.深入解析萜烯合酶中可塑性殘基的作用將有助于在產(chǎn)物特異性、熱穩(wěn)定性或催化效率等方面對合酶進(jìn)行優(yōu)化[8].

本研究基于已知的ScGAS一級結(jié)構(gòu)，利用MODELLER 9.2構(gòu)建其同源模型，以FPP為小分子配體，利用InsightⅡ的Lib Dock程序進(jìn)行對接研究.針對影響ScGAS活性的關(guān)鍵氨基酸，利用Calculate Mutation Energy（stability）和 Calculate Mutation Energy（binding）模塊構(gòu)建虛擬突變，評估突變對蛋白的熱穩(wěn)定性以及與FPP親和力的影響，并利用SNAP2構(gòu)建非同義突變體，評估突變對蛋白功能的影響.最后利用BuildMutants構(gòu)建虛擬突變體，與FPP進(jìn)行對接分析，進(jìn)而闡釋可塑性氨基酸在調(diào)節(jié)ScGAS生物活性方面的功能.

1 實驗方法

1.1 序列比對

從NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫獲得ScGAS的一級序列，利用BLAST（basic local alignment search tool）比對獲得同源性最高的蛋白晶體作為模板蛋白，借助Align sequence to templates（InsightⅡ software package，Accelrys）比對ScGAS的一級結(jié)構(gòu)與模板蛋白的相似性和同源性，刪除序列兩端的差異氨基酸，提高兩者的同源性[9].

1.2 同源模建與優(yōu)化

選擇MODELLER 9.2構(gòu)建ScGAS的三維結(jié)構(gòu)，建模數(shù)量為100，優(yōu)化水平為High（高），其他參數(shù)缺省.綜合考量PDF總能量（probability density functions total energy）和 DOPE 評分（discrete optimized potential energy score），兩者得分越低，模型越可靠.一般選取PDF總能量最低的模型，若PDF總能量相近，則用DOPE評分進(jìn)行衡量[9].

使用 InsightⅡ 軟件中 Ramachandran Plot（拉氏圖）、Verify 3D和ERRAT評估模型.拉氏圖[10]是根據(jù)蛋白質(zhì)或肽的立體結(jié)構(gòu)中肽鍵內(nèi)α碳原子和羰基碳原子間的鍵旋轉(zhuǎn)度對α碳原子和氮原子拉鏈?zhǔn)綆ё娱g的鍵旋轉(zhuǎn)度，來衡量允許和不允許的構(gòu)象，不允許區(qū)氨基酸應(yīng)小于總氨基酸的5%.Verify 3D[11]評估則依據(jù)氨基酸所處的位置是否合理來評估蛋白整體結(jié)構(gòu)的合理性，至少80%的氨基酸殘基Verify 3D評分應(yīng)高于0.2.ERRAT評估分析不同原子類型之間的非鍵相互作用，要求Quality Factor高于80[12].對評估不合理的區(qū)域進(jìn)行Loop Refinement與分子動力學(xué)優(yōu)化.Loop優(yōu)化模型數(shù)量為5，優(yōu)化水平為高.分子動力學(xué)優(yōu)化采用最陡下降法（steepest descent）和共軛梯度法（conjugate gradient）各200步進(jìn)行能量優(yōu)化[8]，通過評估得到符合要求的模型.

為模型添加Mg2+后，選用InsightⅡ軟件的Standard Dynamics Cascade模塊優(yōu)化Mg2+在模型內(nèi)的位置，參數(shù)為缺省值，選擇總能量最低的模型進(jìn)行后續(xù)實驗.

1.3 分子對接與位點虛擬篩選

計算ScGAS的潛在活性位點，運用Lib Dock（insightⅡ software package，Accelrys） 將 mol格式的 FPP配體與吉馬烯A合酶的活性位點對接.構(gòu)建方法選擇最佳，熱區(qū)數(shù)目設(shè)置為300.Lib Dock score是根據(jù)小分子的構(gòu)象與受體相互作用熱區(qū)匹配將配體小分子對接到受體蛋白中，其得分是對能量、幾何形狀、化學(xué)環(huán)境的綜合評價[13].綜合考量得分、FPP構(gòu)象及其與鎂離子的作用方式，選擇最優(yōu)構(gòu)象.影響FPP與吉馬烯A合酶對接結(jié)果的氨基酸即為可塑性氨基酸.

1.4 序列分析及飽和誘變

利用 predictprotein（https：//www.predictprotein.org/）在線分析ScGAS的一級序列，利用ConSurf分析各個氨基酸的進(jìn)化速率.首先在UniProt（https：//www.uniprot.org/）中查找相關(guān)序列，然后使用貝葉斯或最大似然方法，基于蛋白質(zhì)與其同系物之間的進(jìn)化相關(guān)性來估算氨基酸的進(jìn)化速率.每個位置的保守程度與進(jìn)化速率呈反比，快速進(jìn)化的位置是可變的，而緩慢進(jìn)化的位置則是保守的[14].

使用SNAP 2進(jìn)行飽和誘變，分析突變對蛋白功能的影響.突變體的選擇標(biāo)準(zhǔn)為“效應(yīng)”得分高于85，概率至少為91%.非中性（“效應(yīng)”）突變體表現(xiàn)出蛋白質(zhì)功能的改變，而中性突變體則沒有.得分高于60分強烈表明特定殘基的功能重要性[15-16].

突變對結(jié)合親和性的能量效應(yīng)（mutation energy，ΔΔGmut）為突變結(jié)構(gòu)與野生型蛋白質(zhì)之間結(jié)合自由能的差，即ΔΔGmut=ΔΔGbind（突變體）-ΔΔGbind（野生型）.結(jié)合自由能變化小于-0.5 kcal/mol時親和力增加，介于 -0.5~0.5 kcal/mol時為中性突變，大于0.5 kcal/mol時親和力降低[16].蛋白熱穩(wěn)定性是對突變前后蛋白質(zhì)折疊自由能的變化的評估.突變對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能量效應(yīng)（mutation energy，ΔΔGmut）為突變結(jié)構(gòu)與野生型蛋白質(zhì)折疊自由能的差，即ΔΔGmut=ΔΔGfold（突變型）-ΔΔGfold（野生型）.

采用基于InsightⅡ軟件的Calculate Mutation Energy（Stability）和 Calculate Mutation Energy（Binding）模塊分別分析氨基酸突變后ScGAS的折疊自由能及其與FPP的結(jié)合自由能的變化，預(yù)測和評估突變對酶活力的影響[16].當(dāng)酶與底物的親和力及蛋白熱穩(wěn)定性增強時，酶的活力會提升[17].對能增強酶活的突變方向，利用InsightⅡ軟件的Build Mutants模塊構(gòu)建突變體，分別與FPP進(jìn)行對接，并且分析對接的Lib Dock評分及FPP的對接構(gòu)象.

綜合突變對蛋白質(zhì)折疊自由能、與FPP結(jié)合自由能及SNAP2評分，構(gòu)建虛擬突變體，分析突變前后蛋白的PDF總能量、DOPE評分、酶與底物作用力的變化，推測氨基酸變化對酶活性改變的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對分析

通過BLAST程序得到與ScGAS同源性最高的青蒿的沒藥醇合酶變體（PDB ID：4GAX）晶體，可將其作為模板蛋白[9]，兩者的序列同源性為53.0%，相似性為74.0%.扣除修飾后同源性提高至54.2%，相似性提高至75.6%，ScGAS與4GAX的序列比對結(jié)果如圖1所示.

圖1 吉馬烯A合酶與4GAX的序列比對結(jié)果Fig.1 Alignment of germacrene A synthase sequence with 4GAX sequence

當(dāng)序列同源性大于50%時，可以得到高精度的模建模型，主鏈原子誤差約為0.1 nm，基本相當(dāng)于中等分辨率的核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)和低分辨率的X線衍射結(jié)構(gòu)[18].這說明以4GAX為模板蛋白構(gòu)建出來的蛋白模型可以代表ScGAS的三維結(jié)構(gòu)參與后續(xù)研究.

2.2 同源模建與優(yōu)化

在構(gòu)建的5個最優(yōu)模型（見表1）中選擇PDF總能量最小的90號模型進(jìn)行Loop Refinement與分子動力學(xué)優(yōu)化，拉氏圖評估結(jié)果如圖2所示.

表1 同源模建結(jié)果Tab.1 Results of homology modeling

圖2 拉氏圖Fig.2 Ramachandran plot

圖2中，氨基酸殘基總數(shù)為537個，A、B、L為最適允許區(qū)，分布有 449個氨基酸殘基，a、b、l、p為合理允許區(qū)，分布有 46 個氨基酸殘基，-a、-b、-l、-p 為基本允許區(qū)，無氨基酸殘基；其余區(qū)域為不允許區(qū)，分布有4個不合理氨基酸殘基，分別為His459、Lys452、His451、Gln200，占氨基酸總數(shù)的 0.8%.ERRAT的Quality Factor高達(dá)97.916 7且87.9%的氨基酸殘基Verify 3D評分高于0.2.此外，模型與模板蛋白4GAX的均方根偏差值（root mean square deviation，RSMD）為0.60 nm.綜合3種評估方法，確認(rèn)優(yōu)化后的90號模型的結(jié)構(gòu)非常合理.根據(jù)3個Mg2+在煙草的5-Epi-Aristolochene合酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：3M01）中的重疊位置，將3個Mg2+定位到ScGAS模型并依賴InsightⅡ軟件的Standard Dynamics Cascade模塊優(yōu)化，確定Mg2+在模型中的位置[8]，如圖3所示.

圖3 鎂離子與ScGAS的結(jié)合方式Fig.3 Joining mode of magnesium ions with ScGAS

2.3 分子對接與位點虛擬篩選

倍半萜合酶與底物FPP發(fā)生生化反應(yīng)時，F(xiàn)PP與2個鎂離子作用形成“U”形構(gòu)象時更容易發(fā)生1，10-環(huán)化，生成吉馬烯A[19].通過計算和理論分析ScGAS與FPP對接的活性位點，并使FPP以“U”形構(gòu)象與ScGAS對接，得到Lib Dock評分為138.965，影響對接效果的氨基酸（如圖4）可能是影響酶活性的關(guān)鍵氨基酸.

圖4 影響ScGAS與FPP對接效果的氨基酸Fig.4 Amino acids affecting the docking effect of ScGAS and FPP

2.4 序列分析

用ConSurf分析ScGAS的一級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)影響酶與FPP對接的24個氨基酸（如圖5）中，僅Tyr15的保守性在5以下，而功能性氨基酸多為保守性氨基酸，推測其余23個氨基酸可能是影響ScGAS結(jié)構(gòu)和功能的重要氨基酸.

圖5 ConSurf結(jié)果圖（黑色框內(nèi)為篩選的關(guān)鍵氨基酸）Fig.5 ConSurf result chart（the key amino acids screened in the black box）

對23個潛在的關(guān)鍵氨基酸做437組飽和突變，分析突變前后蛋白熱穩(wěn)定性以及與底物FPP親和力的變化，推測有16組突變（D301N、D302N、D302K、E379Q、E379L、G402M、E453I、E454Q、D526R、D526N、D526V、D526Q、D526C、D526T、D526L、D526Y）可提高蛋白的穩(wěn)定性和親和力.對比氨基酸突變前后蛋白與FPP的對接構(gòu)象（如圖4、圖6），發(fā)現(xiàn)氨基酸突變后通過影響酶與底物作用的活性口袋的位置及大小、與底物的成鍵方式以及與輔助因子的作用力，間接影響酶的功能.結(jié)合SNAP2評分以及酶與FPP的對接構(gòu)象，最后得到4組突變D301N、D302K、D526L及E379L（見表2）.對倍半萜合酶催化機制及突變的研究表明[20]，可塑性氨基酸的突變可通過影響酶的產(chǎn)物特異性提高產(chǎn)物的多樣性，從而使酶的功能得到進(jìn)化，有些突變亦可提高酶的催化效率.通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，D301N、D302K、D526L和E379L這4組突變不僅增強了蛋白的熱穩(wěn)定性、酶與底物的結(jié)合親和力、使底物以“U”型構(gòu)象與蛋白對接（如圖6），而且對接的Lib Dock評分均比其他突變高30左右，表明該對接結(jié)果更容易發(fā)生，酶的表達(dá)產(chǎn)物中含有更多的吉馬烯A.這些結(jié)果與體內(nèi)實驗是否一致，需要通過體外酶活實驗進(jìn)行驗證.

圖6 氨基酸突變后ScGAS與FPP的對接Fig.6 Docking of ScGAS with FPP after amino acid mutation

表2 虛擬突變結(jié)果Tab.2 Virtual mutation screening results

3 討論

本研究結(jié)合計算機模擬與現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了ScGAS的同源模型，發(fā)現(xiàn)了影響ScGAS與法尼基焦磷酸（FPP）對接的可塑性殘基，并結(jié)合ConSurf、SNAP2及虛擬突變研究，從構(gòu)建的飽和誘變文庫中發(fā)現(xiàn)了4個具有改進(jìn)熱穩(wěn)定性和底物親和力的突變體，為后續(xù)改造吉馬烯A合酶提供了理論支持.經(jīng)過一系列軟件的分析，發(fā)現(xiàn)突變對蛋白的影響均為有益.因此可認(rèn)為301D、302D、378E和526D均為影響ScGAS合酶功能的關(guān)鍵氨基酸，但是具體影響依然需要進(jìn)一步的生物學(xué)研究.

在分子進(jìn)化正向選擇的基礎(chǔ)上進(jìn)行合理的蛋白質(zhì)設(shè)計，為ScGAS結(jié)構(gòu)的靶向分子操作提供了研究方向.計劃進(jìn)一步將進(jìn)化生物學(xué)與實驗分子生物學(xué)相結(jié)合，研究生物體內(nèi)ScGAS的突變體如何改變其生化過程，為β-欖香烯的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的思路.