張琳琳 劉剛 方俊

摘要 ? ?由于具有高效、便捷、靈敏和低廉的特點，發(fā)光細菌已成為水質(zhì)急性毒性快速檢測的首選，在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測中。本文對發(fā)光細菌的特性、種類、發(fā)光機理及其在農(nóng)業(yè)水質(zhì)檢測方面的應(yīng)用進行了綜述，對發(fā)光細菌在農(nóng)業(yè)水源污染檢測中的前景作了展望。

關(guān)鍵詞 ? ?發(fā)光細菌;生理特性;發(fā)光機理;農(nóng)業(yè)用水;應(yīng)用

中圖分類號 ? ?X824 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）20-0162-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract ? ?Because of its high efficiency， convenience， sensitivity and low cost， luminescent bacteria have become the best choice for rapid detection of acute toxicity of water quality， and were widely used in environmental monitoring at home and abroad. In this paper， the characteristics， types， luminescence mechanism and application of agricultural water quality monitoring of luminescent bacteria were reviewed， and the prospect of luminescent bacteria in agricultural water quality monitoring was prospected.

Keywords ? ?luminescent bacteria; physiological characteristic; luminescence mechanism; agricultural water; application

農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展的高速進程導(dǎo)致水體中毒性物質(zhì)的物種豐度和種類不斷增加，從而使水體質(zhì)量監(jiān)測成為了各界焦點?？蒲泄ぷ髡咭验_發(fā)出許多靈敏、有效的水質(zhì)毒性檢測方法，大體可分為2種，即分析技術(shù)和生物毒性檢測。分析技術(shù)主要用于檢測廢水和地表水指標(biāo)，但其不能反映各指標(biāo)由于生物的拮抗、協(xié)同、抑制等相互作用的綜合毒性大小。利用生物學(xué)方法進行毒性檢測越來越普遍，不斷出現(xiàn)新的檢測手段。在快速生物檢測方法方面，根據(jù)測試生物的不同，可以分為微生物、藻類、底棲軟體動物、浮游生物和魚類等[1-2]。傳統(tǒng)的生物毒性檢測以水藻、水蚤類、魚類作為主要測試對象，測試周期較長，工作量較大，對受試生物的篩選較嚴格。微生物中的發(fā)光細菌具有獨特的生理特性，將其與光電傳感技術(shù)相結(jié)合，形成的發(fā)光細菌毒性快速檢測技術(shù)越來越引人注目。將傳統(tǒng)的分析技術(shù)與發(fā)光細菌毒性檢測技術(shù)聯(lián)合進行水質(zhì)分析，為保障水質(zhì)安全提供了有力支持。發(fā)光細菌毒性是一種生物毒性，它能客觀分析出逾5 000種有毒物質(zhì)對周邊環(huán)境以及生物物種的綜合影響。由于高效、便捷、重復(fù)性好等優(yōu)勢，其在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于污水、工農(nóng)業(yè)廢水、生活飲用水、大氣污染、土壤污染、食品等方面的檢測。

1 ? ?發(fā)光細菌的生理特性及分類

發(fā)光細菌是指含有l(wèi)ux基因，在正常生理條件下，可發(fā)出波長在450～490 nm范圍藍綠色可見光的細菌[3]。它是一種兼性好氧化能自養(yǎng)型細菌[4]。

發(fā)光細菌的分類方式多種多樣，包括傳統(tǒng)分類、數(shù)值分類、系統(tǒng)分類等。迄今為止，在全世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光細菌種類，大致可分為以下種類。一是發(fā)光桿菌屬，包括鰒發(fā)光桿菌和明亮發(fā)光桿菌[5]。其中，明亮發(fā)光桿菌是從海洋中發(fā)現(xiàn)、提取、分離、純化的，在測試過程中需要另外加入3%氯化鈉才能保持正常的生理狀態(tài)。目前，國內(nèi)應(yīng)用較多的是明亮發(fā)光桿菌T3和T502小種[6]。二是弧菌屬，包括哈維氏弧菌、美麗弧菌、費氏弧菌、火神弧菌、東方弧菌、青?；【?。另外，還有人發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌和地中?；【械哪承┚暌灿邪l(fā)光的現(xiàn)象。其中弧菌屬中的霍亂弧菌和青海弧菌屬于淡水型發(fā)光細菌。我國的發(fā)光細菌研究學(xué)者朱文杰教授從青海湖裸鯉魚體表上分離純化出一株淡水型發(fā)光細菌，命名為青?；【鶴67，是全球唯一一株不具備致病性的淡水發(fā)光細菌，在使用過程中的調(diào)節(jié)鹽濃度較低，對樣品的毒性測定結(jié)果影響較小[7]。三是希瓦氏菌屬，主要為羽田希瓦氏菌。

2 ? ?發(fā)光細菌的發(fā)光機理

發(fā)光細菌的最大特點為在它的生長周期過程中可以發(fā)出可見光，其發(fā)光機理與螢火蟲相似，但并不完全相同。細菌自身能夠分泌合成一種稱為細菌熒光酶的酶，這種酶通過氧化還原型的黃素單核苷酸發(fā)出光子，這個反應(yīng)過程不產(chǎn)熱。因此，發(fā)光細菌的發(fā)光過程并不伴隨產(chǎn)熱，是一種“冷”光過程。細菌發(fā)光的波長范圍為420～670 nm，在490 nm處可以達到最大發(fā)射波長，其光為藍綠色。細菌發(fā)光的簡略反應(yīng)方程式如下：

不僅如此，細菌在發(fā)光過程中熒光酶還會涉及相應(yīng)的有氧呼吸作用，人們通常認為這是促進呼吸作用中電子向氧分子轉(zhuǎn)移的一條代謝信號通路。氧分子會促進FMNH2反應(yīng)產(chǎn)生中間產(chǎn)物—熒光酶-黃素過氧化物，其氧化降解反應(yīng)的過程中會產(chǎn)生大量能量（約210 kJ/mol），從而促進激發(fā)分子在擊退過程中激發(fā)光子的產(chǎn)生。眾所周知，生物的發(fā)光過程需要能量，而這個能量來源是來自于O-O鍵的斷裂[8]。

污染物抑制細菌發(fā)光是主要通過以下2種方式：使參與細菌發(fā)光反應(yīng)過程中的熒光酶失活;抑制細菌發(fā)光反應(yīng)過程中相關(guān)的代謝信號通路。因此，可以根據(jù)細菌產(chǎn)光強度的變化來測定這些能夠抑制發(fā)光細菌呼吸作用、新陳代謝以及生長過程的有毒物質(zhì)毒性的大小[9]。重金屬和有機污染物類物質(zhì)對發(fā)光細菌的毒性最大，對其發(fā)光過程損傷最嚴重。通過光學(xué)波長檢測儀可以檢測發(fā)光強度的變化，從而可以利用發(fā)光細菌作為檢測水體中有毒物質(zhì)的有效手段[10]。

3 ? ?發(fā)光細菌在農(nóng)業(yè)水質(zhì)毒性檢測中的應(yīng)用

3.1 ? ?發(fā)光細菌應(yīng)用于水體抗生素殘留檢測

由于集約化畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，抗生素被廣泛應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖業(yè)，造成了抗生素污染水體的嚴重農(nóng)業(yè)污染。針對這類問題，我們可以利用發(fā)光細菌來檢測養(yǎng)殖基地中所排放的水源中抗生素的急性毒性。曾 ?卓等就以明亮發(fā)光桿菌作為指示菌種，測定了生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中常用的包括林可霉素、青霉素G鈉和桿菌肽在內(nèi)的7種獸用抗生素的急性毒性[11]。

然而，傳統(tǒng)的發(fā)光細菌檢測方法采用的是天然發(fā)光細菌，海洋菌在測試時需要加入2%～3%氯化鈉來調(diào)節(jié)鹽度，會對水樣的毒性測試結(jié)果產(chǎn)生影響。此外，天然發(fā)光細菌除了能檢測重金屬外，還會對幾千種污染物質(zhì)有響應(yīng)，不能實現(xiàn)對特定污染物的高效識別。因此，人們在發(fā)光細菌的基礎(chǔ)上，通過基因工程的方法，研發(fā)出了重組發(fā)光細菌檢測方法。重組發(fā)光細菌是通過基因工程技術(shù)將發(fā)光基因重組到對污染物敏感的受體細胞所構(gòu)成的基因工程[12]。發(fā)光細菌的發(fā)光操縱子系統(tǒng)中包括結(jié)構(gòu)基因luxC、luxD、luxA、luxB、luxE和調(diào)節(jié)基因luxI、luxG、luxR等。不同發(fā)光細菌的發(fā)光基因的拷貝數(shù)和表達能力不同[13]。為了檢測環(huán)境中某些特定污染物或其他目標(biāo)特質(zhì)，將lux基因?qū)脒x定的非發(fā)光細菌，人為構(gòu)建基因工程發(fā)光細菌[14]，這一研究方向是近年來發(fā)光細菌研究的熱點。此外，還可以通過基因編輯的手段來構(gòu)建菌株以實現(xiàn)抗生素毒性的快速評價[15]。低濃度的二甲基亞砜可以在不影響青?；【鶴67發(fā)光生理特性的前提下，提高其對抗生素毒性的檢測敏感程度，大幅提高了發(fā)光細菌在抗生素毒性檢測中的靈敏度以及效率[16]。

3.2 ? ?發(fā)光細菌應(yīng)用于農(nóng)藥殘留毒性檢測

發(fā)光細菌毒性測試技術(shù)能夠測試的物質(zhì)范圍廣、靈敏度較傳統(tǒng)的動物試驗高、相關(guān)性好、重復(fù)性好、反應(yīng)耗時短，因而在環(huán)境監(jiān)測中被廣泛應(yīng)用[17]。根據(jù)發(fā)光細菌發(fā)光的原理，凡是能夠影響發(fā)光細菌正常新陳代謝的物質(zhì)均能用發(fā)光細菌發(fā)光強度變化的方法來進行定性或定量的測定。近年來，利用發(fā)光細菌來進行農(nóng)業(yè)廢水中農(nóng)藥殘留安全監(jiān)測越來越廣泛[18]。

早有試驗對發(fā)光細菌在農(nóng)業(yè)廢水中農(nóng)藥殘留檢測相關(guān)領(lǐng)域的監(jiān)測應(yīng)用情況進行了評估，同時還監(jiān)測了多種農(nóng)藥的毒性變化。結(jié)果表明，在對水質(zhì)的監(jiān)測和評估過程中，單獨采用化學(xué)參數(shù)的指標(biāo)測試是不全面的，應(yīng)該配合生物毒性測試手段進行多方面的水質(zhì)監(jiān)測[19]。有研究通過與化學(xué)檢測的比較，對大型溞、斜生柵藻、費舍爾弧菌進行毒性檢測效應(yīng)評估，發(fā)現(xiàn)發(fā)光細菌對農(nóng)藥廠污染水源毒性的敏感性最高[20]。而對農(nóng)藥廠污染地土壤浸出液的毒性檢測試驗表明，與其他毒性檢測生物相比，發(fā)光細菌試驗周期更短。但這些受試生物的毒性效力都隨著時間的增加而增加[21]。楊麗芳等針對食品蔬菜中的農(nóng)藥殘留，使用發(fā)光細菌進行有機磷農(nóng)藥毒性的快速檢測[22]。

4 ? ?結(jié)語

綜上所述，發(fā)光細菌法的生物毒性檢測技術(shù)在農(nóng)業(yè)水質(zhì)污染監(jiān)測等方面已發(fā)揮出重要的作用。作為一種輔助監(jiān)測手段，克服了理化監(jiān)測的局限性和連續(xù)取樣的繁瑣，縮短了試驗時間、簡化了操作過程，經(jīng)過不斷發(fā)展，應(yīng)用會越來越廣泛。

然而，通過國家水站大數(shù)據(jù)平臺和現(xiàn)場調(diào)研得知，在國內(nèi)以發(fā)光細菌法為主的水質(zhì)生物綜合毒性分析儀在水站運行過程中還存在一些問題。一是荷蘭TOX-control菌種價格昂貴，運輸周期較長，海關(guān)開箱安檢會造成菌干粉的批次質(zhì)量不一致，無法保證現(xiàn)場水站持續(xù)正常運行，運行率僅14%。二是部分國內(nèi)廠家儀器使用的是明亮發(fā)光桿菌，與弧菌相比，桿菌本身活動性較弱，易發(fā)生沉淀，造成光路檢測下降，不同批次細菌靈敏度差異較大，重現(xiàn)性差。三是國產(chǎn)費氏弧菌凍干粉的研制大多停留在實驗室階段，穩(wěn)定性、使用周期尚未達到進口設(shè)備要求。要解決這些問題，需要在細菌的質(zhì)量控制與保證體系上進行大量現(xiàn)場應(yīng)用研究（研制出可替代進口的費氏弧菌干粉），形成統(tǒng)一標(biāo)準，保證現(xiàn)場監(jiān)測數(shù)據(jù)的準確、可靠，起到真正意義上的水質(zhì)預(yù)警監(jiān)測作用。

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