包佳玲，莫碧瑩，李同心，劉敏，李田，潘國慶，周澤揚

1. 家蠶基因組生物學國家重點實驗室，西南大學，重慶 400715; 2. 微孢子蟲感染與防控重慶市重點實驗室， 西南大學，重慶 400715; 3. 重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心，重慶 400036

微孢子蟲病(microsporidiosis)由微孢子蟲(microsporidia)感染所引起，其易感人群主要是艾滋病患者、器官移植者、癌癥患者、老人及兒童等免疫力低下的人群[1, 2]。1959年報道了第1例人類微孢子蟲??；1985 年在艾滋病患者中發(fā)現(xiàn)畢氏腸微孢子蟲[3,4]。事實上，造成微孢子蟲病的病原——微孢子蟲是一大類專性細胞內(nèi)寄生的真菌類病原，隸屬于真菌界(Fungi)，微孢子蟲門(Microspora)，微孢子蟲綱(Microsporea)，微孢子蟲目(Microsporida)[5]。微孢子蟲感染的宿主范圍非常廣泛，包括昆蟲、魚類、家畜以及人類[6,7]。微孢子蟲病的主要癥狀包括持續(xù)性腹瀉、發(fā)熱、食欲缺乏和體重減輕等，嚴重者還會出現(xiàn)肌炎、肝炎，乃至器官衰竭等，是免疫缺陷人群(如艾滋病患者與器官移植患者)的重要致死因素之一[8,9]。因此，微孢子蟲的檢測和預防具有重要的公共衛(wèi)生意義。若能大范圍開展微孢子蟲感染的快速檢測，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療，將有效控制微孢子蟲病的傳播，并提高患者的生活質量和生存率。

目前最受關注的能感染人的微孢子蟲主要有畢氏腸微孢子蟲(E.bieneusi)、海倫腦炎微孢子蟲(E.hellem)、腸腦炎微孢子蟲(E.intestinalis)以及兔腦炎微孢子蟲(E.cuniculi)[10]。關于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)攜帶者感染畢氏腸微孢子蟲已有眾多報道，截至2018年已有47個流行病學調查，涉及超 18 000 名HIV攜帶者，涵蓋23個國家和地區(qū)，其結果顯示在HIV攜帶者中畢氏腸微孢子蟲的感染率約為12%[11]。目前我國HIV感染者中微孢子蟲感染情況的調查仍集中在上海、廣西、河南等中、東部地區(qū)，缺乏對重慶市乃至西南地區(qū)的情況調查[12]。隨著本地區(qū)的經(jīng)濟逐步發(fā)展、流動人口增加，急需對HIV攜帶者的微孢子蟲共感染情況進行調查和數(shù)據(jù)統(tǒng)計，以期為公共衛(wèi)生預防和精準治療提供有力支持。

本研究采集了重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心收治的22名HIV攜帶者的糞便樣品，對微孢子蟲感染情況進行了首次調查統(tǒng)計，期望為闡明微孢子蟲與宿主相互作用關系以及微孢子蟲防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究選取的病例來自于重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心根據(jù)2018版《中國艾滋病診療指南》艾滋病診斷標準[13]確診的HIV感染患者共22例。所有患者經(jīng)免疫印跡法確認為HIV抗體陽性，HIV核酸檢測陽性，并且這些患者均有不明原因的持續(xù)或反復腹瀉癥狀。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本收集和總DNA提取 收集22例患者的糞便，對樣本進行隨機編號標記并存于-20 ℃待用。使用QIAGEN QIAamp?DNA Stool 糞便提取試劑盒(Cat. No.51504, QIAGEN, Germany)，按生產(chǎn)商提供的說明書，分別提取上述患者的糞便總DNA，標記并存于-20 ℃待用。

1.2.2 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測引物與條件 采用PCR法分別擴增微孢子蟲的SSU rRNA序列片段，檢測兔腦炎微孢子蟲、海倫腦炎微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲。擴增引物參照Al-Herrawy等[14]進行設計合成，引物序列如表1所示。PCR擴增體系為25 μL，擴增條件為95 ℃ 預變性4 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s， 進行35個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 PCR引物及預測擴增片段[13]

1.2.3 PCR檢測陽性樣本的測序 將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳和膠回收試劑盒分別進行純化和回收，然后用pMD19-T載體將回收的片段進行連接。將連接體系混合后，于16 ℃金屬浴過夜。將連接產(chǎn)物轉化到大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α中，將轉化后的大腸埃希菌DH5α用含相應抗生素的LB固體培養(yǎng)基進行篩選，將篩選出的陽性菌落接種于含氨芐西林(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中37 ℃培養(yǎng)約6 h。取1 mL培養(yǎng)的菌液，用T載體通用引物M13(F: TGTAAAAC-GACGGCCAGT； R: CAGGAAACAGCTATGA-CC)進行PCR檢測。確認連接后，將陽性菌液送上海生工進行測序。測序結果使用NCBI、MicrosporidiaDB以及ClustalO等軟件進行序列對比分析。

1.2.4 免疫細胞分析 分別對22例患者采集外周靜脈血，當天對CD4+T細胞、CD8+T細胞的亞群進行計數(shù)和分析，所用儀器為美國BD FACSCalibur流式細胞儀; 各亞群正常值范圍參照國家衛(wèi)生健康委員會《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷》標準(標準號WS 293-2008)、中華醫(yī)學會《艾滋病診療指南》等文獻[13，15-17]。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 HIV攜帶者微孢子蟲感染情況

對22份HIV攜帶者糞便DNA樣本進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示微孢子蟲陽性的樣本有9份，樣品編號為9，10，11，12，13，17，19，21，22(圖1)。為進一步確認微孢子蟲感染情況，將9份陽性標本的電泳條帶分別進行膠回收、測序，結果提示9份陽性樣品中有8份樣品(編號9，10，12，13，17，19，21，22)被確認為人微孢子蟲腦炎微孢子蟲屬(海倫腦炎微孢子蟲、腸腦炎微孢子蟲)感染，感染率為36.3%(8/22)；有1份樣品(編號11)測序結果不是微孢子蟲，判斷為PCR結果假陽性(表2)。

圖1 22份樣品的核酸檢測結果

表2 PCR陽性樣品的測序結果(n=22)

2.2 微孢子蟲種類分析

將PCR檢測陽性的9份樣品進行DNA測序，利用ClustalO軟件將測序結果與NCBI和MicrosporidiaDB數(shù)據(jù)庫中微孢子蟲標準序列進行比對分析。結果顯示：除1份不是微孢子蟲感染外，其余8份均為腦炎微孢子蟲屬(Encephalitozoonspp)的海倫腦炎微孢子蟲或腸腦炎微孢子蟲感染。圖2為本次檢測部分樣品序列分別與海倫腦炎微孢子蟲(ATCC 50504) 及腸腦炎微孢子蟲(ATCC 50651) 序列比對分析的結果。

2.3 患者免疫細胞分析

對患者免疫細胞亞群進行計數(shù)分析，見表3。結果顯示，22例患者平均淋巴細胞總數(shù) 0.93±0.13×109/L，CD4+T細胞數(shù)132±22 個/mL，CD8+T細胞數(shù)495±91 個/mL，CD4/CD8細胞比值0.37±0.1， 遠低于參考值。這提示22例患者免疫功能都受到嚴重抑制， 是機會性病原感染的高危人群。進一步將微孢子蟲感染患者與未感染患者的免疫細胞亞群進行比對，結果顯示，感染患者淋巴細胞數(shù)為0.51±0.1×109/L，未感染患者 1.17±0.17×109/L，兩者具有顯著差異(P<0.05)；感染患者的CD4+T細胞數(shù)為71±27 個/mL，未感染患者的為167±28 個/mL，兩者具有顯著差異(P<0.05)；感染患者的CD8+T細胞數(shù)為209±35 個/mL，未感染患者的為658±123 個/mL，兩者具有顯著差異(P<0.05)。表明微孢子蟲感染組的免疫功能受損情況更嚴重，進一步證實微孢子蟲感染與患者的免疫狀態(tài)密切相關。

表3 22例患者的淋巴細胞亞群檢測

圖2 部分樣品測序結果與標準株的比較

3 討論

自1985年首次在艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)患者中檢出微孢子蟲后，國際上關于微孢子蟲流行病學的調查越來越多[18]。但在我國，直到近年學界才對微孢子蟲的流行情況逐漸重視[19]。將我國部分地區(qū)HIV攜帶者的微孢子蟲感染情況進行總結發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲的平均感染率約為5.6%；在常見的4種感染人的微孢子蟲中，畢氏腸微孢子蟲仍是主要病原，最高平均感染率可達22.5%[11, 20]。關于重慶地區(qū)AIDS患者中微孢子蟲的感染情況還未見任何報道，本研究對重慶地區(qū)HIV攜帶者中微孢子蟲感染情況首次進行調查。在檢測的22名HIV攜帶者中，有8名確認為微孢子蟲感染，感染率為36.3%，這一比例在我國屬高發(fā)。通過DNA序列比對發(fā)現(xiàn)，感染主要由腦炎微孢子蟲屬的海倫腦炎微孢子蟲或腸腦炎微孢子蟲引起。

當前普遍認為腸微孢子蟲屬的畢氏腸微孢子蟲(E.bieneusi)是造成AIDS患者腹瀉的主要病原[19]，例如海倫腦炎微孢子蟲雖然也引起腹瀉，但更多的研究是關注其對眼、肺等部位的感染[21,22]，而本研究所檢出的微孢子蟲感染主要是由腦炎微孢子蟲屬引起。既往研究提示腦炎微孢子蟲屬的感染不如畢氏腸微孢子蟲普遍，但是本研究的結果顯示，重慶地區(qū)腦炎微孢子蟲屬的感染情況更為普遍，說明微孢子蟲感染或許具有地域分布或者易感人群特異性；抑或是由于重慶地區(qū)是肺結核及肺結核合并HIV感染的高發(fā)地區(qū)，這造成肺部感染的腦炎微孢子蟲屬更容易在患者體內(nèi)定植。值得注意的是，本研究僅檢測了22例患者，急需擴大檢測范圍，從而對該地區(qū)HIV感染者的微孢子蟲感染情況獲得更全面和準確的判斷。

HIV感染會導致宿主免疫系統(tǒng)嚴重受損，特別是淋巴細胞數(shù)量因CD4+T細胞數(shù)的降低而顯著改變；其中CD4+T細胞的數(shù)值更是作為AIDS診斷和治療效果評估的重要指標之一。當患者被HIV感染后，CD4+T細胞可極速下降至200個/mL，甚至更低?；颊叱霈F(xiàn)AIDS癥狀，免疫功能低下，導致機體更容易被機會性病原感染[23]；在患者進行抗病毒治療(anti-retroviral therapy, ART)后，其CD4+T細胞數(shù)隨著病毒載量下降而有所上升，可至350個/mL或更高，患者免疫力也隨之增強[24,25]。本研究收集的22例AIDS患者恰好是剛檢出HIV抗體陽性但還未開始ART的患者，其CD4+T細胞的平均值只有132±22個/mL，因此是機會性病原感染的高危人群。本研究結果顯示，這22例患者中有8例受到微孢子蟲感染(感染率36.3%)，相較于其他文獻中所選取的正接受抗病毒治療患者的微孢子蟲感染率偏高，這也許是由于本研究的患者還未開始抗病毒治療、免疫力極低所致。進一步對本研究中8例微孢子蟲感染患者的免疫細胞亞群分析可以發(fā)現(xiàn)，其淋巴細胞總數(shù)、CD4+T細胞、CD8+T細胞等都較未感染微孢子蟲患者的數(shù)值更低，證實微孢子蟲機會性感染與患者的免疫狀態(tài)密切相關。由此可知，對HIV攜帶者進行有效的抗病毒治療，幫助他們恢復和重建免疫功能，對于降低機會性病原感染及提高患者預后和生活質量都有非常重要的意義。

作為機會性病原，微孢子蟲主要感染免疫力低下人群，其中AIDS患者是主要易感人群。而隨著我國HIV感染人數(shù)逐年增多，及時對這些人群中微孢子蟲的感染情況進行監(jiān)測和報道將是有效控制微孢子蟲感染、提高AIDS患者生活質量甚至挽救其生命的重要基礎。同時，許多文獻指出HIV抗體陰性人群也會檢測出微孢子蟲感染，但其感染率非常低且基本不出現(xiàn)明顯臨床癥狀[18]。HIV抗體陰性人群被微孢子蟲感染雖然不是因為病毒造成免疫力低下的結果，但極有可能是因為其他因素如結核分枝桿菌感染、胸腺發(fā)育不良等原因影響了機體免疫功能從而變得更加易感[2]。這不僅再次證明微孢子蟲感染與宿主免疫狀態(tài)密切相關，也揭示了微孢子蟲感染范圍廣，其影響可能不局限于AIDS患者這一現(xiàn)象。因此，很有必要將微孢子蟲檢測納入臨床常規(guī)診治，期待本研究結果及更多類似的報道可使臨床和科研人員認識微孢子蟲，以便對其進行準確檢測，進而有效控制微孢子蟲感染。