孟夢(mèng)，王超，吳偉，王媛媛

北京市東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心， 北京 100050

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)是由感染人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)所致。HIV攻擊人體的免疫系統(tǒng)，大量破壞CD4+T細(xì)胞，使人體易于感染機(jī)會(huì)致病微生物[1]，病死率較高。由于HIV變異迅速，目前尚無(wú)徹底清除病毒的藥物，同時(shí)病毒變異亦給疫苗的研發(fā)造成很大困難[2]。艾滋病已成為嚴(yán)重危害人體健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因此早期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)潛在的HIV感染者是該病防治工作的重中之重。我國(guó)主要采用HIV抗體血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)，檢測(cè)通常分為篩查實(shí)驗(yàn)和補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)包括核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和確證實(shí)驗(yàn)，其中蛋白質(zhì)印跡法(Western blot，WB)是目前廣泛使用的抗HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果分為 HIV-1抗體陽(yáng)性、 HIV抗體陰性和 HIV抗體不確定，其中HIV-1抗體陽(yáng)性是診斷HIV感染的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。為了提高實(shí)驗(yàn)室的HIV抗體檢測(cè)能力，了解艾滋病監(jiān)管場(chǎng)所和各醫(yī)療機(jī)構(gòu)篩查的抗體待確定樣本的確證情況及不同檢測(cè)試劑和方法對(duì)確證結(jié)果的影響，本研究對(duì)送檢到我實(shí)驗(yàn)室的268份抗體待確定樣本進(jìn)行了檢測(cè)結(jié)果分析，期望對(duì)艾滋病的防治提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

北京市東城區(qū)所轄監(jiān)管場(chǎng)所、自愿咨詢(xún)檢測(cè)門(mén)診(Voluntary Counseling and Test，VCT)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的篩查實(shí)驗(yàn)室上送的2016年全年經(jīng)化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、膠體硒法檢測(cè)的HIV抗體待確定樣本268份，其中男性215份、女性53份。

1.2 儀器與試劑

ProfiBlot-T48全自動(dòng)蛋白印跡儀由奧地利TECAN公司生產(chǎn)，經(jīng)檢定校準(zhǔn)合格。HIV-1+HIV-2抗體檢測(cè)試劑盒(IMT HIV-1/2確證試劑盒)由上海英旻泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，試劑盒在有效期內(nèi)且質(zhì)控合格。

1.3 方法

WB采用間接法檢測(cè)樣品中的抗HIV-1/HIV-2特異性抗體。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳把分子量大小不等的HIV-1蛋白分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)一系列處理后，硝酸纖維素膜顯示與特異抗原結(jié)合的抗體條帶，從而確證抗體存在。嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(Standard Operation Procedure，SOP)進(jìn)行WB確證實(shí)驗(yàn)。根據(jù)出現(xiàn)條帶情況，按《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》(2015)[3]的規(guī)定并結(jié)合試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行判定。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置陰性、陽(yáng)性和弱陽(yáng)性對(duì)照，判讀結(jié)果由2 名工作人員共同完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 Excel 建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SAS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和Fisher精確概率,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 待確定樣本的WB確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)送檢至本實(shí)驗(yàn)室的268份經(jīng)初篩抗體待確定樣本進(jìn)行WB確證實(shí)驗(yàn)，其中HIV-1抗體陽(yáng)性170份，確證陽(yáng)性率為63.43%；陰性樣本51份，陰性率為19.03%；不確定樣本47份，不確定率為17.54%。對(duì)47份不確定樣本中的6份從2016—2019年進(jìn)行了不間斷的隨訪，最后確認(rèn)有3份陽(yáng)轉(zhuǎn)，3份已予排除，其中不確定帶型p24、p17p24、p31gp120gp160各陽(yáng)轉(zhuǎn)1份。

2.2 不同送檢單位樣本確證陽(yáng)性情況有差異

東城區(qū)疾病預(yù)防控制中心VCT、東城區(qū)拘留所、東城區(qū)看守所、醫(yī)療機(jī)構(gòu)等篩查實(shí)驗(yàn)室樣本確證陽(yáng)性率分別為84.37%、91.43%、92.85%、52.40%，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=32.904，P<0.01，見(jiàn)表1。

2.3 送檢樣本的人群分布情況

268份確證樣本中，男性215份，女性 53份，男女比例為4.07∶1；其中男性陽(yáng)性樣本162份(75.34%)，女性陽(yáng)性樣本8份(15.09%)(表2)。送檢樣本中，年齡主要集中在21～40歲，占58.21% (156/268)，該年齡段陽(yáng)性率77.56%。陽(yáng)性者中年齡最小的17歲，年齡最大的82歲，不同年齡段人群確證陽(yáng)性率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且年齡主要集中在20～40歲(表2)。

表1 不同送檢單位來(lái)源的樣本確證結(jié)果

表2 不同人群樣本確證陽(yáng)性結(jié)果的分布情況(n=268)

2.4 WB確證實(shí)驗(yàn)的帶型分析

170 份確證陽(yáng)性樣品的WB條帶中，以全條帶(p17、 p24、p31、gp41、p51、p55、p66、gp120和gp160共9個(gè)條帶全部出現(xiàn) )和次全帶(出現(xiàn)條帶≥6個(gè))為主(占94.71%，161/170)。不同條帶中，gp160、p66陽(yáng)性率最高(均為100%)，gp41陽(yáng)性率最低(82.94%)(表3)。不確定的樣本共47份(占17.54%)，條帶陽(yáng)性率從高到低依次為p24(65.96%)、gp160(21.28%)、p17(17.02%)、p66(17.02%)、gp120(10.64%) 、p31(8.51%)、p55(8.51%)、p51(6.38%)、gp41(0.00%)。結(jié)果表明HIV-1抗體陽(yáng)性者 WB 帶型以全條帶和次全條帶為主，其中 gp160和p66無(wú)缺失，其余均有不同程度缺失，gp41 缺失率最高(表3)。

2.5 WB實(shí)驗(yàn)不確定結(jié)果的帶型分布

HIV抗體WB實(shí)驗(yàn)不確定結(jié)果有17種帶型，不確定構(gòu)成比在前3位的帶型為：p24占38.29%(18/47)，p17占19.14%(9/47)，p17p24占8.51%(4/47)(表4，圖1)。

表3 HIV-1確證陽(yáng)性樣本的WB條帶陽(yáng)性率(n=268)

2.6 不同性別和不同年齡組確證陽(yáng)性的帶型分布

170份陽(yáng)性樣本中，男性162份，女性8份，HIV-1抗體陽(yáng)性WB實(shí)驗(yàn)分布帶型在不同性別間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在不同年齡組人群間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5和表6。

2.7 篩查結(jié)果與確證結(jié)果的相關(guān)性

送檢的268份血標(biāo)本都至少有一種試劑篩查有反應(yīng)，其中一種試劑有反應(yīng)的有65份，占篩查有反應(yīng)總數(shù)的24.25%(65/268)，兩種試劑篩查有反應(yīng)的有203份，占篩查有反應(yīng)總數(shù)的75.75%(203/268)。268份血標(biāo)本中采用化學(xué)發(fā)光法篩查的樣本有134份，采用ELISA篩查的樣本有111份，采用膠體硒法篩查的樣本有23份。結(jié)果顯示，所有的HIV-1抗體陽(yáng)性結(jié)果均來(lái)自由兩種試劑篩查有反應(yīng)的樣本。ELISA 與其他方法的確證結(jié)果陽(yáng)性率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01，見(jiàn)表7。

圖1 WB實(shí)驗(yàn)不同結(jié)果的條帶圖譜

表4 47份不確定者WB實(shí)驗(yàn)帶型分布

表5 不同年齡樣本確證陽(yáng)性條帶分布(n=170)

表6 不同性別樣本確證陽(yáng)性條帶分布(n=170)

表7 不同方法檢測(cè)結(jié)果的確證率

3 討論

從我國(guó)發(fā)現(xiàn)第1例艾滋病起，公眾對(duì)待HIV感染者就普遍存在社會(huì)性歧視，不愿與之共同工作、生活。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心關(guān)于影響艾滋病患者就業(yè)的調(diào)查顯示[4]，就業(yè)中歧視發(fā)生率達(dá)42.1%，高于2009年的《中國(guó)艾滋病病毒感染者歧視情況調(diào)查報(bào)告》中的就業(yè)歧視率(35.3%)[5]。由于HIV感染者在國(guó)內(nèi)外受到不同程度的歧視，所以HIV 感染者的確診對(duì)其個(gè)人和家庭都有著極其重大的影響，這就要求確證實(shí)驗(yàn)室的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員要嚴(yán)格把控 HIV 的確證實(shí)驗(yàn)，不容許發(fā)生任何錯(cuò)誤。北京市東城區(qū)共有3家確證實(shí)驗(yàn)室，包括北京協(xié)和醫(yī)院、北京市疾病預(yù)防控制中心和本中心確證實(shí)驗(yàn)室。本中心確證實(shí)驗(yàn)室從2016年建立以來(lái)，承擔(dān)著轄區(qū)內(nèi)除北京協(xié)和醫(yī)院外所有篩查實(shí)驗(yàn)室及檢測(cè)點(diǎn)的艾滋病確證工作，對(duì)篩查有反應(yīng)樣本進(jìn)行確證結(jié)果的判定是否準(zhǔn)確，將會(huì)決定 HIV 感染者及艾滋病患者能否得到及時(shí)的抗病毒治療。本研究對(duì)東城區(qū)170份確證陽(yáng)性樣本的WB實(shí)驗(yàn)帶型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HIV-1抗體陽(yáng)性者帶型分布在不同性別和年齡之間，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且 WB 實(shí)驗(yàn)帶型中全條帶型及次全帶型占比例較高(占94.71%)，表明 HIV 在這些人體內(nèi)繁殖活躍，感染性高[6，7]；確證陽(yáng)性樣本帶型中除 gp160和p66無(wú)缺失外，其余均有不同程度缺失，gp41 缺失率最高，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)有關(guān)報(bào)道的結(jié)果有些不同[8，9]。分析原因可能是不同傳播途徑、不同地域和不同遺傳背景造成的差異，也可能是HIV感染期向艾滋病期發(fā)展的標(biāo)志。建議臨床結(jié)合CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，評(píng)估患者的免疫狀態(tài)和疾病階段，及時(shí)開(kāi)展抗病毒治療。本研究因資料收集不完善，沒(méi)能作進(jìn)一步分析。

env基因編碼的包膜蛋白前體 gp160在蛋白酶作用下分解為 gp120和 gp41。gag基因編碼核心蛋白(gag蛋白)p55, 經(jīng)酶解后形成 p17、p24等, p17構(gòu)成內(nèi)膜蛋白, p24構(gòu)成衣殼蛋白。gp160和 p55同為前體蛋白, 兩者條帶出現(xiàn)率并無(wú)明顯差異,pol基因編碼 Pol蛋白, 包括反轉(zhuǎn)錄酶(p66/p51)和整合酶(p31)等。 p66、p51和 p31是由pol基因的mRNA翻譯不同位置形成的不同蛋白, 三者在 HIV復(fù)制中均發(fā)揮不同的作用, 因而條帶出現(xiàn)率并無(wú)較大差異。本研究的HIV抗體WB實(shí)驗(yàn)不確定結(jié)果有17種帶型，出現(xiàn)次數(shù)最多的帶型為p24，與以往的報(bào)道一致[10]。對(duì)本研究47份不確定樣本中的6份從2016—2019年進(jìn)行了不間斷的隨訪，最后確認(rèn)有3份陽(yáng)轉(zhuǎn)，3份已予排除，其中不確定帶型p24，p17p24和p31gp120gp160各陽(yáng)轉(zhuǎn)1份。 雖然有報(bào)道稱(chēng)pol和gag類(lèi)條帶大多是非特異性反應(yīng)所致[8]，但本研究中出現(xiàn)了陽(yáng)轉(zhuǎn)的病例，因此既不能忽視其陽(yáng)轉(zhuǎn)的可能，也要考慮到可能是早期感染病例。這提示我們?cè)趯?shí)踐中要結(jié)合篩查實(shí)驗(yàn)結(jié)果，必要時(shí)增加核酸檢測(cè)，減少漏檢和誤診。對(duì)47份WB實(shí)驗(yàn)不確定結(jié)果的樣本進(jìn)行回顧，發(fā)現(xiàn)大部分來(lái)自醫(yī)療機(jī)構(gòu)，由于主客觀各種因素的影響，其中41份失去隨訪，這表明目前的艾滋病防控工作仍存在一定的隱患和漏洞，加大對(duì)不確定樣本的隨訪是艾滋病防控的重要內(nèi)容。

HIV 抗體檢測(cè)作為篩查實(shí)驗(yàn)的一種方法，適合大批量普查，但其結(jié)果存在不同程度的假陰性及假陽(yáng)性[11]，這就需要 WB 確證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最終判定，但WB實(shí)驗(yàn)也存在不確定的結(jié)果。本研究分析了北京市東城區(qū)268份確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)確證結(jié)果為不確定的樣本占比較大(為19.61%)。造成不確定結(jié)果的主要原因有 HIV 感染早期樣本及孕產(chǎn)婦、腫瘤、疫苗接種、自身免疫性疾病及其他反轉(zhuǎn)錄病毒感染等引起的非特異性反應(yīng)[12,13]。東城區(qū)篩查實(shí)驗(yàn)室上送樣本的確證陽(yáng)性率為 63.43%，HIV 抗體確證結(jié)果陽(yáng)性率因送檢單位及人群的不同存在較大差異，其中監(jiān)管場(chǎng)所(看守所和拘留所)上送標(biāo)本多來(lái)自羈押、吸毒和暗娼人群；VCT上送標(biāo)本多來(lái)自有高危性行為的人群，這些是造成其陽(yáng)性率較高的原因。醫(yī)療機(jī)構(gòu)送檢人群多為手術(shù)前的常規(guī)檢測(cè)、門(mén)診人群和孕產(chǎn)期人群，人群差異化比較大，且多采用化學(xué)發(fā)光(四代試劑)和快速(膠體硒)檢測(cè)，在提高檢測(cè)敏感度的同時(shí)也可能增加了檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性反應(yīng)。本研究結(jié)果提示在相同的檢測(cè)條件下，樣本篩查假陽(yáng)性反應(yīng)受人群的特征影響因素較大，篩查檢測(cè)中應(yīng)該引起足夠的重視。但由于化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)采用抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑，結(jié)果可能存在單獨(dú)抗原陽(yáng)性、確證陰性的早期感染情況，因此要高度重視，盡快通知患者及早做核酸檢測(cè)以排除早期感染的可能。盡管醫(yī)療機(jī)構(gòu)送檢樣本 HIV 抗體確證陽(yáng)性率相對(duì)不高，但由于醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢測(cè)數(shù)量大，受眾廣泛，全區(qū)通過(guò)醫(yī)療機(jī)構(gòu)篩查發(fā)現(xiàn)的 HIV-1抗體陽(yáng)性者仍然占較大比例，因此醫(yī)療機(jī)構(gòu)篩查依然是發(fā)現(xiàn)潛在 HIV 感染者的重要途徑之一。因此要在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中進(jìn)一步擴(kuò)大 HIV 抗體檢測(cè)范圍和覆蓋面，推廣醫(yī)務(wù)人員主動(dòng)提供 HIV 檢測(cè)咨詢(xún)工作以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)更多的 HIV潛在感染者。

本實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)發(fā)光法 、ELISA 與膠體硒法的確證結(jié)果陽(yáng)性率有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，ELISA初篩的確證陽(yáng)性率明顯高于化學(xué)發(fā)光法和膠體硒法的初篩。膠體硒法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短、保存和攜帶便捷等優(yōu)勢(shì)，因此適用于急診等快速檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光法是近年來(lái)篩查 HIV 抗體的流行方法，因其靈敏度高、操作便利、標(biāo)本可隨時(shí)檢測(cè)、上樣自動(dòng)化、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)。同時(shí)化學(xué)發(fā)光法又可以檢測(cè) HIV-1 p24 抗原，在避免艾滋病的漏檢方面起到了一定作用[14]。第四代ELISA 試劑盒作為一種成熟并且發(fā)展時(shí)間長(zhǎng)的檢測(cè)方法，具有很高的穩(wěn)定性和特異性，假陽(yáng)性率低，在艾滋病篩查實(shí)驗(yàn)中有著其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并且能夠滿(mǎn)足臨床需要，建議大力推廣使用。但是由于窗口期的存在，所有檢測(cè)方法都沒(méi)有絕對(duì)的特異度和敏感度，檢測(cè)的同時(shí)應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行咨詢(xún)，對(duì)有高危行為的人群進(jìn)行一種以上方法的多次檢測(cè)，以減少漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究對(duì)上送至本實(shí)驗(yàn)室的268份HIV抗體待確定樣本進(jìn)行分析，人群以男性為主，男女比例為4.07∶1。男性陽(yáng)性率75.34%，女性15.09%。由于艾滋病主要通過(guò)血液、性途徑和母嬰途徑傳播，而性傳播已經(jīng)成為我國(guó)艾滋病流行的主要傳播方式，且男男性行為者占比逐年增加[15]，所以這可能是導(dǎo)致男性陽(yáng)性率高的原因之一。送檢樣本中年齡主要集中在20～40歲，多為非本地區(qū)人士，與以往報(bào)道一致[16]。該人群處于性活躍時(shí)期，社會(huì)交往廣泛，流動(dòng)性強(qiáng)，并且容易發(fā)生高危性行為。其中男男性行為更是由于得不到社會(huì)的理解，被歧視和偏見(jiàn)影響，使得該人群導(dǎo)致的HIV感染往往得不到控制，出現(xiàn)跨區(qū)域的傳播，從而導(dǎo)致陽(yáng)性率高。因此，應(yīng)該充分利用各種媒體途徑，廣泛開(kāi)展 VCT 宣傳服務(wù)，加大宣傳力度，鼓勵(lì)更多的人接受艾滋病相關(guān)知識(shí)的健康教育，使 VCT 在艾滋病防治工作中發(fā)揮更大的作用，爭(zhēng)取早發(fā)現(xiàn)潛在的HIV感染者，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，減少二代病例發(fā)生，從而有效遏制艾滋病的傳播[17,18]。本研究不足之處在于未收集到感染者的傳播途徑和CD4+T細(xì)胞數(shù)值的資料，而且只對(duì)送檢樣本進(jìn)行了分析，樣本量不大，不能完全確定是否存在人群、性別等選擇偏倚。今后應(yīng)關(guān)注這方面的影響因素，結(jié)合不同感染方式、不同病程感染者WB實(shí)驗(yàn)條帶做進(jìn)一步的分析，找出可能導(dǎo)致差異的原因，為艾滋病的防治措施提供更有效的依據(jù)。