蘇夢，呂亮東

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 200032

細(xì)菌中組成核糖體的蛋白超過50個(gè)，但絕大多數(shù)核糖體蛋白的功能還沒有完全被了解[1]。為探究它們的生物學(xué)功能，F(xiàn)ujio Kawamura課題組試圖一一敲除枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)中57個(gè)核糖體蛋白編碼基因，并成功得到16個(gè)敲除株，繼而測定它們在32 ℃和37 ℃時(shí)的生長情況，發(fā)現(xiàn)L1、L22、L23、L34、L36、S6和S21敲除株的生長較野生株慢，而在45 ℃中除L1敲除株外，其余的均可恢復(fù)至野生株水平[2]，提示核糖體蛋白組分缺陷可能導(dǎo)致細(xì)菌對溫度更敏感[2]。此外，研究發(fā)現(xiàn)L1影響枯草芽孢桿菌芽孢形成，S21影響枯草芽孢桿菌的運(yùn)動(dòng)性能[2]。以上研究說明核糖體結(jié)構(gòu)存在動(dòng)態(tài)調(diào)控，其變化與細(xì)菌發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)等過程密切相關(guān)，但相關(guān)分子機(jī)制仍不明確。Eric J. Rubin課題組利用結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)Tn轉(zhuǎn)座子突變庫侵染小鼠，根據(jù)小鼠生存率篩選其毒力相關(guān)基因，其中發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白 S9(RpsI)、L35(RpmI)和L36(RpmJ)插入突變株在感染小鼠后第8周的存活率顯著降低[3]，提示核糖體蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)菌毒力，但相關(guān)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究通過比較結(jié)核分枝桿菌(致病菌)與恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis，M.smegmatis)(非致病菌)中核糖體蛋白RpsI、RpmI和RpmJ的氨基酸序列同源性，發(fā)現(xiàn)RpmI與RpmJ的氨基酸序列相似度極高，而RpsI N端20多個(gè)氨基酸存在較大差異。為進(jìn)一步研究RpsI N端差異序列對核糖體結(jié)構(gòu)與功能的影響，構(gòu)建了以結(jié)核分枝桿菌rpsI替換恥垢分枝桿菌同源基因的重組菌株，觀察RpsI N端序列的差異對分枝桿菌核糖體結(jié)構(gòu)和功能的影響，期望對核糖體蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)菌毒力的相關(guān)分子機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 結(jié)核分枝桿菌H37Rv購自美國ATCC；恥垢分枝桿菌mc2155菌株、大腸埃希菌(Escherchiacoli，E.coli)DH5α菌株、大腸埃希菌BL21菌株、質(zhì)粒pMV306、質(zhì)粒pET22b(+)和質(zhì)粒pYUB854均為本實(shí)驗(yàn)室儲存。

1.1.2 主要試劑 Middlebrook 7H9、7H10培養(yǎng)基購自美國BD公司；膠回收試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA純化試劑盒、Maxima H Minus First Strand cDNA合成試劑盒、Ni柱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；0.1 mm(直徑)陶瓷珠購自美國Nalgene公司；限制性核酸內(nèi)切酶、DNaseⅠ(M0303L)、10×DNaseⅠBuffer(M0303S)購自 美國NEB公司；抗結(jié)核分枝桿菌Hsp65的鼠單克隆抗體(ab20519)購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(A9044)及山羊抗兔IgG(A0545)、蛋白定量試劑Bradford(B6916)購自美國Sigma公司；RNA提取試劑TRIzol(9109)購自日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 大腸埃希菌采用LB液體培養(yǎng)基(37 ℃、250 r/min)和LB固體培養(yǎng)基(37 ℃靜置)分別培養(yǎng)16～24 h。恥垢分枝桿菌mc2155采用含0.2%甘油、0.05% 吐溫80的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(37 ℃、150 r/min)和含0.2%甘油的Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基(37 ℃靜置)分別培養(yǎng)2～3 d。

1.2.2 重組菌株構(gòu)建 利用同源重組的方法進(jìn)行基因敲除。以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增rpsI啟動(dòng)子區(qū)和編碼區(qū)，并通過重疊PCR(overlapping PCR)將其連接。啟動(dòng)子區(qū)引物為，3442promoter-F: ATGCGAATTCGGG-ACCACACAGTCATTTTGA，3442promoter-R: GCTGGGGTGGTTTCGGTCATAGCGCTTACC-TTCTTTTCTC；編碼區(qū)引物為，3442-F: GAGA-AAAGAAGGTAAGCGCTATGACCGAAACCA-CCCCAGC，3442-R:ATGCGTTAACTCAGCG-CTTGCTGTACTGGG。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連至pMV306質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)至恥垢分枝桿菌mc2155，獲得含有結(jié)核分枝桿菌rpsI(rpsI_Rv)的重組恥垢分枝桿菌，即mc2155∷pMV306_rpsI_Rv。同時(shí)，電轉(zhuǎn)空載體pMV306質(zhì)粒至恥垢分枝桿菌mc2155，得到Ms_rpsI_Ms菌株(mc2155∷pMV306，空載對照菌株)。以恥垢分枝桿菌mc2155基因組DNA為模板，通過引物Ms3442KO-F1:ATGCCTTAAGGG-AAACCCGAAACGAGAAGG，Ms3442KO-R1:ATCGACCGGTGGGAAGTAGTTCTCCAGCGT和Ms3442KO-F2:ATGCGCTAGCCCCTGATCC-TGGTGCAGC，Ms3442KO-R2:ATCGCTCGA-GGTGTTGTTGCAGACGTTGGT擴(kuò)增上下臂，得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連至pYUB854質(zhì)粒，并通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法[4]將重組質(zhì)粒導(dǎo)入mc2155∷pMV306_rpsI_Rv中，敲除恥垢分枝桿菌rpsI(rpsI_Ms)，得到Ms_rpsI_Rv菌株(mc2155ΔrpsI_Ms∷pMV306_rpsI_Rv)。利用引物(P1: CGT-AGACATTGCGGAACACC，P2: GGTCGATTC-CTGGGTGCC)驗(yàn)證rpsI_Ms是否敲除成功，同時(shí)利用306質(zhì)粒引物(P3: TTACCGCCTTTGAG-TGAGCT，P4: GATGCTGACAAACGAATAG-AG)驗(yàn)證rpsI_Rv是否整合成功。PCR驗(yàn)證正確后，進(jìn)一步對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。挑取3個(gè)驗(yàn)證正確的克隆用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RpsI_Rv抗體制備 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，以Pet-3442F: ATG-CCATATGACCGAAACCACCCCAGCCCC，Pet-3442R: ATGCCTCGAGGCGCTTGCTGTACTG-GGGCG為引物，PCR擴(kuò)增rpsI編碼序列；經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切后，連至pET22b(+)質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒(pET22b_rpsI_Rv)，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，并對PCR陽性克隆進(jìn)行測序。得到的重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞BL21。將重組BL21轉(zhuǎn)接至含有100 μg/mL 氨芐西林(Amp)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min 培養(yǎng)至OD600至0.6左右，加入0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，置16 ℃、250 r/min誘導(dǎo)過夜。3 220×g離心收集菌體，并用Buffer A〔50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，10%甘油，5 mmol/L咪唑，2.5 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol， DTT)〕重懸至25 mL，利用6 mm的超聲探頭4 ℃超聲破碎。破碎結(jié)束后，收集上清液全菌蛋白，并利用Ni柱進(jìn)行純化。目的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDS-PAGE；5%濃縮膠，12% 分離膠)，考馬斯亮藍(lán)染色，檢測蛋白純化情況。純化好的目的蛋白移至截留分子量為 10 000 的超濾管，4 ℃、4 000×g離心40 min以濃縮目的蛋白。加入30 mL Buffer B〔50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L DTT， 0.25 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)〕，4 ℃、4 000×g離心40 min平衡目的蛋白。最后加入1 mL Buffer B，重懸后加入25%甘油，于 -80 ℃保存。將純化后的RpsI_Rv送至上海艾比瑪特(ABmart)公司，制備兔抗RpsI_Rv多克隆抗體。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá) 分別取對數(shù)生長期(OD600約1.0)的重組恥垢桿菌菌株Ms_rpsI_Rv與空載對照菌株Ms_rpsI_Ms50 mL，3 220×g室溫離心5 min，收集菌體，用10 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS) 重懸，3 220×g 離心5 min，加入500 μL PBS 懸浮菌體，吹打混勻，加入0.25 mL 0.1 mm(直徑)陶瓷珠。用均質(zhì)破菌儀劇烈振蕩30 s，冰上靜置1 min，連續(xù)破菌5次。4 ℃、16 000×g 離心10 min，上清液即為可溶性蛋白組分。利用Bradford法[5]測定蛋白濃度，取5 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。20 V 電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜。3%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)室溫封閉1 h，分別加入anti-RpsI_Rv兔源一抗(1∶10 000)和anti-Hsp65鼠源一抗(1∶10 000)(內(nèi)參蛋白)，室溫孵育2 h。Tris-HCl緩沖液(Tris-buffered saline with Tween 20，TBST)室溫洗5遍，每次5 min。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)二抗和山羊抗鼠IgG(1∶10 000)二抗，室溫孵育1 h，TBST在室溫洗2遍，每次5 min。按1∶1的比例避光配制顯色液(Millipore)，并加至PVDF膜上，于Tanon全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(上海天能科技有限公司，Tannon 4600)進(jìn)行顯色，并分析圖像。

1.2.5 RNA的提取 將 -80 ℃保存的Ms_rpsI_Rv與Ms_rpsI_Ms接種至7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600約2.0)，按1%的比例轉(zhuǎn)接至10 mL 7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600約0.8)。3 220×g離心5 min收集菌體，并用1 mL TRIzol試劑[6]重懸，重懸的菌體用均質(zhì)破菌儀進(jìn)行破碎，共破碎5次，每次30 s，間隔1 min。破碎完成后，16 000×g、4 ℃離心5 min，收集上清液至含Phase Lock Gel的管中，并加入0.3 mL氯仿，劇烈震蕩10 s，室溫放置10 min使其分層。16 000×g、4 ℃離心10 min，收集上層水相至新的EP管，并加入等體積異丙醇，于 -20 ℃靜置30 min。16 000×g、4 ℃離心20 min，沉淀物用75%乙醇洗1次，室溫干燥后，加入85 μL RNase-free H2O、5 μL DNaseⅠ和10 μL 10×DNaseⅠbuffer〔10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)，2.5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L CaCl2〕，37 ℃處理30 min。最后利用RNA純化試劑盒進(jìn)行純化，得到的RNA保存于-80 ℃。

1.2.6 反轉(zhuǎn)錄PCR 利用Maxima H Minus First Strand cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別以rpsI_Rv和rpsI_Ms的cDNA為模板，以相應(yīng)的RNA為對照檢測DNA污染情況。分別利用引物RpsI_Rv_F：CGCAGCTTGGAGGACTA-CTT，RpsI_Rv_R：GGCGATACCAGAATC-AATGC 和RpsI_Ms_F: TCAGTTCGACAT-CTACGCCC，RpsI_Ms_R：TGTACTGAGG-AGCCTTACGG進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR，最后用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶相對亮度。

1.2.7 生長曲線的測定 將 -80 ℃保存的Ms_rpsI_Rv與Ms_rpsI_Ms分別接種至7H9液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600約2.0)，轉(zhuǎn)接至20 mL 7H9液體培養(yǎng)基，并將OD600調(diào)至0.02，分別置于30 ℃、37 ℃和45 ℃，于150 r/min 培養(yǎng)，每隔3 h測定菌液的OD600，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制生長曲線。利用不同的克隆重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 重組菌株MIC90的測定 采用通用的液體倍比稀釋法測定藥物MIC90[7]。用7H9液體培養(yǎng)基將Ms_rpsI_Rv與Ms_rpsI_Ms于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600約1.0，并用7H9液體培養(yǎng)基將其稀釋至OD600約0.01；同時(shí)將待測定的抗生素用7H9液體培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，分別加入待測菌液中，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)1～2 d。以未加抗生素的菌液為對照，培養(yǎng)相同天數(shù)，測定OD600。若最后測得OD600值低于對照OD600值的10%，則該濃度梯度為藥物的MIC90。利用不同的克隆重復(fù)測定3次。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并作圖。

2 結(jié)果

2.1 分枝桿菌核糖體蛋白RpsI、RpmI和RpmJ氨基酸序列保守性分析

利用美國國家生物信息中心生物大分子序列比對搜索工具(NCBI BLAST)比較結(jié)核分枝桿菌H37Rv與恥垢分枝桿菌mc2155核糖體蛋白RpsI、RpmI和RpmJ氨基酸序列的相似性，結(jié)果RpsI、RpmI和RpmJ氨基酸序列一致性分別達(dá)83.85%、84.38%和94.59%(圖1A)，其中RpmI和RpmJ的氨基酸覆蓋率為100%，而RpsI的氨基酸覆蓋率僅86%(圖1A)。利用Bioedit軟件進(jìn)一步比對這兩種菌株的 RpsI、RpmI和RpmJ氨基酸序列相似性，結(jié)果顯示RpmJ的相似性為100%，RpmI和RpsI相似性均為89%(圖1A)，且RpsI氨基酸序列差異主要集中在蛋白序列的N端(圖1B)。提示結(jié)核分枝桿菌H37Rv與恥垢分枝桿菌mc2155核糖體蛋白RpsI的氨基酸序列差異較大，且主要集中在序列的N端。

2.2 成功構(gòu)建 mc2155 ΔrpsI∷pMV306_rpsI_Rv(Ms_rpsI_Rv)菌株

為證明分枝桿菌RpsI N端差異序列可能影響核糖體的結(jié)構(gòu)和功能，利用整合質(zhì)粒pMV306將rpsI_Rv整合至恥垢分枝桿菌mc2155基因組中，并敲除其內(nèi)源性基因rpsI_Ms，獲得重組恥垢菌株mc2155 ΔrpsI∷pMV306_rpsI_Rv(Ms_rpsI_Rv)(圖2A)。利用PCR對該重組菌株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示rpsI_Ms敲除成功，且rpsI_Rv成功整合至恥垢分枝桿菌基因組中(圖2B)。通過對PCR產(chǎn)物測序，進(jìn)一步證實(shí)該菌株構(gòu)建成功。

2.3 結(jié)核分枝桿菌RpsI異源表達(dá)及多克隆抗體制備

為在蛋白水平上檢測RpsI_Rv是否在Ms_rpsI_Rv中成功表達(dá)， 本研究需制備該蛋白的特異性抗體。利用蛋白表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+) 表達(dá)并純化RpsI_Rv蛋白； SDS-PAGE檢測RpsI_Rv蛋白的誘導(dǎo)和純化情況，結(jié)果顯示0.5 mmol/L IPTG于16 ℃可成功誘導(dǎo)表達(dá)RpsI_Rv。在純化過程中，30 mmol/L咪唑能將絕大部分雜蛋白洗脫，用100 mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白純度較高(圖3)。最后用該純化蛋白制備了兔源抗RpsI_Rv多克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定該抗體的效價(jià)為 1 600 000。

A: Systematic comparison of RpsI, RpmI and RpmJ amino acid sequence between M. tuberculosis and M. smegmatis. B: Sequence similarity of RpsI, RpmI and RpmJ between M. tuberculosis and M. smegmatis.

A: Schematic diagram of strain genotypes and the process of construction. B: Verification of recombinant strain by PCR. P1 and P2 primers were used to genotype the rpsI_Ms locus. P3 and P4 primers were used to verify the insertion of plasmid containing rpsI_Rv.

Purification of M. tuberculosis RpsI expressed in E.coli strain BL21. RpsI_Rv was induced by 0.5 mM IPTG (left) and affinity-purified by NTA-agarose (right).

2.4 rpsI_Rv能夠在重組菌株中正常表達(dá)

該重組恥垢菌株rpsI被結(jié)核分枝桿菌相應(yīng)基因替換，并整合至基因組另一位點(diǎn)。為了驗(yàn)證rpsI_Rv易位插入是否影響rpsI_Rv表達(dá)，利用TRIzol法提取Ms_rpsI_Rv和對照菌株Ms_rpsI_Ms對數(shù)生長期的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以RNA為對照，分別用相應(yīng)的引物進(jìn)行25輪的PCR，擴(kuò)增rpsI_Rv和rpsI_Ms。電泳結(jié)果顯示該重組菌株rpsI_RvRNA的表達(dá)量與對照菌株rpsI_Ms一致(圖4A)，表明rpsI_Rv的異位整合不影響rpsI_Rv的表達(dá)。同時(shí)利用RpsI_Rv多克隆抗體對重組菌株中的RpsI_Rv進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測，結(jié)果顯示RpsI_Rv在Ms_rpsI_Rv中成功表達(dá)，但是空載對照菌株Ms_rpsI_Ms的信號較弱(圖4B)。

2.5 重組菌株與空載對照菌株在不同溫度下的生長曲線

通過繪制不同溫度下重組菌株和空載對照菌株的生長曲線，研究RpsI的改變是否影響Ms_rpsI_Rv在不同溫度下的生長速率。結(jié)果如圖5所示，Ms_rpsI_Rv不同克隆之間的生長特性在30 ℃、37 ℃(正常生長溫度)和45 ℃下沒有顯著差異(P>0.05)，且與Ms_rpsI_Ms相比也未見顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明RpsI N端序列的差異并不影響重組恥垢菌株的正常生長，且對溫度的敏感性也未改變。

A. The relative RNA expression of rpsI_Rv and rpsI_Ms was measured by reverse transcript PCR using corresponding primers, purified RNA was used as template to exclude DNA contamination. B. The expression of RpsI_Rv was assessed by Western blot using antibody against RpsI_Rv. Hsp65 was used as the internal reference.

2.6 重組菌株對阿米卡星的敏感性增強(qiáng)

為了檢測RpsI N端的差異是否影響核糖體的結(jié)構(gòu)，測定了作用于核糖體不同位點(diǎn)抗生素的MIC90，包括作用于30S亞基的鏈霉素(streptomycin)、阿米卡星(amikacin)和慶大霉素(gentamicin)，以及作用于50S亞基的氯霉素(chlorampheniol)和紅霉素(erythromycin)。結(jié)果如表1所示，當(dāng)用rpsI_Rv取代rpsI_Ms后，該重組菌株對鏈霉素、慶大霉素、氯霉素和紅霉素的MIC90未發(fā)生改變，但對阿米卡星的敏感性升高了1倍。以上結(jié)果提示RpsI的替換可能影響了A位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，使Ms_rpsI_Rv對阿米卡星更敏感。

圖5 重組菌株Ms_rpsI_Rv與空載對照菌株Ms_rpsI_Ms的生長速率測定

表1 作用于核糖體的抗生素對重組菌株Ms_rpsI_Rv和空載對照菌株Ms_rpsI_Ms的MIC90

3 討論

核糖體一直被認(rèn)為由固定的成分(核糖體蛋白和rRNA)組成，機(jī)械性地參與翻譯過程。但目前認(rèn)為核糖體存在異質(zhì)性(ribosome heterogeneity)[8]，包括核糖體組成成分和核糖體的數(shù)量，它們處于不斷變化的過程中，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的變化。Michael Hecke課題組發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在遇到不同的環(huán)境壓力如氧化壓力、饑餓或熱應(yīng)激等條件時(shí)，細(xì)菌會上調(diào)不同的應(yīng)激蛋白(stress proteins)，其中包括Ctc蛋白[9]。Jorg Stulke課題組證明Ctc蛋白為核糖體蛋白，敲除ctc使枯草芽孢桿菌在熱應(yīng)激條件下無法形成芽孢[10]。大腸埃希菌核糖體蛋白bL31和bL36分別有兩個(gè)同源蛋白，即bL31A、bL31B和bL36A、bL36B。Jaanus Remme課題組發(fā)現(xiàn)當(dāng)大腸埃希菌從對數(shù)期過渡到穩(wěn)定期時(shí)，核糖體的bL31A和bL36A被bL31B和bL36B替代[11]。以上研究說明細(xì)菌可通過調(diào)整核糖體的結(jié)構(gòu)或組成使其適應(yīng)環(huán)境，但相關(guān)作用機(jī)制仍不明確。

Eric J. Rubin課題組發(fā)現(xiàn)致病性結(jié)核分枝桿菌核糖體蛋白編碼基因rpsI、rpmI和rpmJ插入突變后，該菌在小鼠體內(nèi)的存活率顯著降低(P<0.05)[3]，提示核糖體蛋白在結(jié)核分枝桿菌宿主適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。恥垢分枝桿菌屬于環(huán)境分枝桿菌，為非致病菌。本研究通過比較結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌RpsI、RpmI和RpmJ氨基酸序列的相似性，發(fā)現(xiàn)RpsI N端序列差異較大。為了研究RpsI N端序列的差異對分枝桿菌核糖體結(jié)構(gòu)和功能的影響，用rpsI_Rv替換了rpsI_Ms，得到重組恥垢菌株。PCR結(jié)果顯示該重組菌株構(gòu)建成功，反轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)重組菌株和對照菌株rpsIRNA表達(dá)量一致，利用RpsI_Rv的特異性抗體檢測該重組菌株RpsI_Rv表達(dá)成功，但對照菌株的RpsI_Ms信號較弱。由于rpsI_Rv和rpsI_Ms的RNA表達(dá)量一致，推測RpsI_Rv多克隆抗體識別的抗原表位主要集中在差異較大的N端，導(dǎo)致該多克隆抗體對RpsI_Ms的蛋白免疫印跡檢測信號較弱。結(jié)核分枝桿菌與恥垢分枝桿菌核糖體蛋白RpsI氨基酸N端序列存在較大差異，序列的不同可能影響核糖體的結(jié)構(gòu)，從而影響核糖體的功能，而核糖體與細(xì)菌的生長密切相關(guān)。同時(shí)，核糖體蛋白組分的缺陷可能使細(xì)菌對溫度更加敏感[2]，但通過測定該重組菌株不同克隆在不同溫度下的生長曲線，發(fā)現(xiàn)rpsI_Rv異位插入不影響該重組菌株的正常生長，且與對照菌株相比，其生長特性也沒有顯著差異。通過測定作用于核糖體不同位點(diǎn)的5種抗生素的MIC90，發(fā)現(xiàn)rpsI_Rv異位插入后，該重組菌株不同克隆對這5種抗生素的敏感性并沒有發(fā)生改變，但是與對照菌株相比，該重組恥垢菌株對阿米卡星的敏感性升高了1倍，由0.5 μg/mL變?yōu)?.25 μg/mL。阿米卡星主要與核糖體16S rRNA的H44結(jié)合[12]，從而抑制翻譯轉(zhuǎn)位。通過分析已解析的恥垢分枝桿菌核糖體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RpsI的C端與阿米卡星作用位點(diǎn)接近[13]，說明RpsI N端差異可能通過影響周圍其他核糖體蛋白或rRNA來改變恥垢分枝桿菌核糖體的結(jié)構(gòu)，從而使阿米卡星更容易結(jié)合至作用位點(diǎn)。測定發(fā)現(xiàn)卡介苗(BCG)對阿米卡星的MIC90也為0.5 μg/mL，但由于結(jié)核分枝桿菌與恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁通透性及生長速度存在較大差異，因此無法通過比較兩個(gè)物種的MIC90來推測藥靶差異。

結(jié)核分枝桿菌與恥垢分枝桿菌的核糖體結(jié)構(gòu)大體相似，但是在核糖體的外圍區(qū)域存在菌種特異性的結(jié)構(gòu)，這使兩者核糖體結(jié)構(gòu)存在一定的差異性[14]。比如在恥垢分枝桿菌核糖體中，23S rRNA的H15和H16a可形成吻合環(huán)(kissing loop)，而這個(gè)吻合環(huán)可與bL9核糖體蛋白相互作用，導(dǎo)致bL9核糖體蛋白構(gòu)象發(fā)生改變[13]。但是這種現(xiàn)象在結(jié)核分枝桿菌中并不存在，結(jié)核分枝桿菌bL9主要與23S rRNA的H54a相互作用，吻合環(huán)的存在并不影響bL9的構(gòu)象[14]。本研究利用NCBI BLAST比較結(jié)核分枝桿菌與恥垢分枝桿菌bL9的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)相似性達(dá)75.5%，只是某些區(qū)域存在差異，這些部位的差異可能與周圍其他核糖體成分相互作用有關(guān)。以上結(jié)果進(jìn)一步說明，核糖體蛋白序列的細(xì)微差異可能會對核糖體結(jié)構(gòu)甚至功能產(chǎn)生影響。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌核糖體小亞基蛋白RpsI N端序列的差異可能微調(diào)核糖體的結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)變化是否會影響核糖體在特定環(huán)境下的功能還有待進(jìn)一步研究。許多作用于核糖體的抗生素在感染性疾病的治療中占據(jù)重要地位。例如，鏈霉素是第1個(gè)用于治療結(jié)核病的抗生素，其主要作用于核糖體30S亞基解碼中心，導(dǎo)致核糖體錯(cuò)譯[12]。由于抗生素耐藥情況越來越嚴(yán)重，臨床上急需新的治療藥物，了解核糖體的結(jié)構(gòu)和功能對于設(shè)計(jì)和篩選藥物具有重要臨床意義。