徐諾，周幫月，史藝，潘興元,2，秦濤，徐正中，陰銀燕,2,

1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院)， 江蘇 揚(yáng)州 225009； 2. 江蘇省非編碼RNA基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 揚(yáng)州 225009； 3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 江蘇 揚(yáng)州 225009； 4. 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 揚(yáng)州 225009

沙門菌屬(Salmonella)是一群寄生在人類和動物腸道中的革蘭陰性桿菌，也是重要的食源性病原菌，威脅著人類的生命健康。沙門菌以血清學(xué)作為其常用的分型標(biāo)準(zhǔn)，目前全球已發(fā)現(xiàn)近 2 600 種血清型[1]。沙門菌屬中傷寒沙門菌和鼠傷寒沙門菌感染率極高，可引起胃腸炎和菌血癥等[2,3]，其中鼠傷寒沙門菌是造成全身感染的主要病原菌[4,5]。

病原微生物入侵宿主后，宿主依賴細(xì)胞表面或者細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別微生物的病原體相關(guān)模式分子(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，進(jìn)而激活下游的信號通路，促進(jìn)天然免疫細(xì)胞的成熟與活化，以啟動抗感染免疫應(yīng)答[6,7]。宿主對病原微生物的識別是啟動免疫應(yīng)答的第1步，沙門菌進(jìn)入腸道后，可以被腸道宿主細(xì)胞的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)識別，并產(chǎn)生大量的炎性因子和趨化因子[6]。又如巨噬細(xì)胞中的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)樣受體(NOD-like receptor，NLRs)在宿主抗沙門菌感染的天然免疫應(yīng)答中也發(fā)揮重要的作用[6]，它與細(xì)菌細(xì)胞壁表面的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)結(jié)合后，通過調(diào)控Caspase-1的活化，刺激細(xì)胞分泌細(xì)胞因子抵抗沙門菌的入侵[8]。除了受體，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素22(interleukin，IL-22)和IL-4也在抵抗沙門菌的感染中發(fā)揮重要作用[9]。

雖然天然免疫應(yīng)答對于宿主抵御沙門菌的感染具有重要的作用，但是沙門菌也演化出一系列逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的策略，使其在宿主體內(nèi)定植并持續(xù)感染宿主細(xì)胞。本文對近年來沙門菌通過受體、細(xì)胞因子和哺乳動物西羅莫司(又稱雷帕霉素)靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路等逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，期望對沙門菌的防治提供參考。

1 受體介導(dǎo)沙門菌逃逸天然免疫應(yīng)答機(jī)制

1.1 TLRs

TLRs是一類分布在細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中能夠特異性識別PAMP和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)的受體，該受體與配體結(jié)合后，能夠刺激下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和誘導(dǎo)效應(yīng)炎性介質(zhì)的表達(dá)，并在天然免疫應(yīng)答與獲得性免疫應(yīng)答之間發(fā)揮橋梁作用[10]。每種TLRs都有對應(yīng)的配體，例如：TLR2和TLR4的配體分別是脂磷壁酸(lipoteichoicacid, LTA)和脂多糖。TLRs與配體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌，但是沙門菌會演化出一系列的策略逃逸TLRs所引起的天然免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，傷寒沙門菌的沙門菌毒力島7(Salmonellapathogenicity island 7，SPI-7)編碼一些重要的毒力因子，阻止脂多糖與TLR4結(jié)合，抑制炎癥應(yīng)答[11]。Arpaia等人通過熒光素酶標(biāo)記發(fā)現(xiàn)TLR2、4、9可能對傷寒沙門菌的識別具有一定作用，進(jìn)一步構(gòu)建TLR2×9、TLR4×9和TLR2×4×9敲除小鼠模型，并口服給予傷寒沙門菌后，發(fā)現(xiàn)TLR2×9和TLR4×9敲除小鼠更易感，表明某些TLR的存在可以顯著提高宿主對傷寒沙門菌的抵抗力[12]。但是TLR2×4×9敲除后傷寒沙門菌對小鼠的感染力顯著下降，通過進(jìn)一步的機(jī)制解析，發(fā)現(xiàn)該菌被巨噬細(xì)胞吞噬后包裹在沙門菌液泡(Salmonella-containing vacuole，SCV)中[13]，傷寒沙門菌表面的PAMP與巨噬細(xì)胞的TLR2、TLR4和TLR9同時結(jié)合后可誘導(dǎo)SCV酸化，該酸化進(jìn)一步誘導(dǎo)沙門菌毒力島2(Salmonellapathogenicity island 2，SPI-2)基因的表達(dá)[14]，通過SPI-2介導(dǎo)的3型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，T3SS-2)分泌效應(yīng)蛋白到達(dá)胞質(zhì)，有利于傷寒沙門菌在SCV中的存活與復(fù)制，巨噬細(xì)胞缺乏TLR2、TLR4和TLR9后，SCV則無法酸化，傷寒沙門菌無法存活和復(fù)制[12]。由此發(fā)現(xiàn)，TLRs與配體結(jié)合，可以啟動下游信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗傷寒沙門菌的作用，但是有些傷寒沙門菌通過抑制TLRs與配體的結(jié)合，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，還有些傷寒沙門菌利用TLRs與配體的結(jié)合，誘導(dǎo)SCV酸化，有利于傷寒沙門菌的感染[12]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌中含有Toll/interleukin-1 (IL-1) receptor(TIR)結(jié)構(gòu)域的基因TcpS，腸炎沙門菌通過T3SS-1分泌TcpS蛋白，TcpS可以模擬TLRs的TIR結(jié)構(gòu)域干擾TLR-NF-κB信號通路，抑制p65的入核以及炎性細(xì)胞因子的分泌，從而逃逸天然免疫應(yīng)答[15]。

1.2 NLRs

NLRs是細(xì)胞內(nèi)PRRs中的一個大家族，根據(jù)功能可將NLRs家族成員分為兩組。一組包括NOD1和NOD2，它們可以激活各種轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、MAPK和IRFs，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子、抗菌肽和干擾素(interferon, IFN)產(chǎn)生[16]；另一組包括NLRP3、NLRC4和NLRP6炎性小體等，它們通過調(diào)控Caspase-1誘導(dǎo)IL-1家族細(xì)胞因子的分泌[17]。宿主感染鼠傷寒沙門菌后，NLRC4和NLRP3均被激活，且與配體結(jié)合后誘導(dǎo)Caspase-1活化，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。NLRC4的配體是鞭毛蛋白，而NLRP3的配體還不是很清楚。與野生型小鼠相比，鼠傷寒沙門菌感染NLRC4和NLRP3敲除小鼠后，腸系膜淋巴結(jié)、脾臟和肝臟中的細(xì)菌載量顯著增多，表明NLRC4和NLRP3在抗鼠傷寒沙門菌感染中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)可以引起K+外排，進(jìn)而誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的活化[19]，而鼠傷寒沙門菌通過調(diào)控三羧酸循環(huán)中所需要的兩種酶(順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶)減少細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，抑制NLRP3炎性小體的活化和細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)對小鼠的感染能力[20]。與NLRC4和NLRP3功能相反，NLRP6和NLRP12的活化與鼠傷寒沙門菌的易感性呈正相關(guān)。與野生型小鼠對比，鼠傷寒沙門菌感染NLRP6和NLRP12敲除小鼠后，肝臟和脾臟中細(xì)菌載量顯著下降，單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，NF-κB信號通路得到了顯著激活。該結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌通過誘導(dǎo)NLRP6和NLRP12的活化負(fù)向調(diào)控炎癥應(yīng)答以實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，使鼠傷寒沙門菌更好地在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并最終增強(qiáng)其對宿主的感染能力[21]。

1.3 RIPs

受體相互作用蛋白(receptor interacting proteins，RIPs)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的重要成員，RIP3和RIP1的C端均存在著相互作用基序，所以可以形成RIP1-RIP3復(fù)合體[22]。研究發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌感染宿主后，通過調(diào)控IFN誘導(dǎo)RIP1和RIP3活化形成RIP1-RIP3復(fù)合體，促使RIP1磷酸化[23]，抑制NF-κB的活化[24]。此外，腸炎沙門菌感染巨噬細(xì)胞后，通過提高RIP3的表達(dá)誘導(dǎo)RIP1磷酸化，引起巨噬細(xì)胞壞死性凋亡[23]。腸炎沙門菌感染RIP3敲除小鼠后，宿主內(nèi)F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，凋亡的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著下降，將RIP3敲除小鼠的F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞過繼回輸?shù)揭吧托∈篌w內(nèi)，可以顯著提高野生型小鼠抗腸炎沙門菌感染的能力[23]。綜上所述，腸炎沙門菌可以通過激活RIP1和RIP3，一方面抑制NF-κB的活化，另一方面誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，進(jìn)而逃逸宿主免疫應(yīng)答，增強(qiáng)其在宿主體內(nèi)的增殖能力。

2 細(xì)胞因子介導(dǎo)沙門菌逃逸天然免疫應(yīng)答機(jī)制

2.1 IL-22

IL-22是IL-10家族中的一員，主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，如輔助T(helper T，Th)17細(xì)胞、Th22細(xì)胞等。細(xì)菌感染宿主后，巨噬細(xì)胞分泌的IL-18可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞釋放IFN-γ[24]，樹突細(xì)胞和其他單核細(xì)胞分泌的IL-23可誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-17和IL-22[25]，以提高腸道上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞內(nèi)抗菌蛋白的表達(dá)，主要包括金屬螯合脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(lipocalin-2)和鈣衛(wèi)蛋白(calprotectin)[26,27]，這兩種蛋白能夠抑制非傷寒沙門菌利用腸道中的金屬離子，使其缺乏必要的微量營養(yǎng)物質(zhì)。lipocalin-2可以阻止細(xì)菌釋放的鐵載體與腸道中的鐵結(jié)合[28]，calprotectin可以通過螯合鋅離子和錳離子來發(fā)揮其抗微生物的作用[29]。雖然宿主通過分泌抗菌蛋白限制病原微生物與多種對代謝功能至關(guān)重要的金屬離子的結(jié)合，抑制病原微生物增殖，但對于非傷寒沙門菌卻有相反的效果。首先，非傷寒沙門菌表達(dá)修飾的鐵載體不受lipocalin-2的束縛，因此即使細(xì)胞產(chǎn)生了lipocalin-2，非傷寒沙門菌也能夠獲得鐵[30]。其次，非傷寒沙門菌具有高親和力的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在calprotectin存在的前提下，依舊可以獲得鋅[26,27]。此外，這些機(jī)制不僅可以幫助非傷寒沙門菌逃逸腸道免疫應(yīng)答，同時也提高了非傷寒沙門菌與腸道其他菌群的競爭優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，IL-22會顯著提高宿主內(nèi)lipocalin-2和calprotectin的表達(dá)水平，非傷寒沙門菌感染IL-22敲除小鼠后，該菌喪失了與腸道菌群競爭的優(yōu)勢，所以很快被宿主免疫系統(tǒng)清除[27]。由此可見，IL-22誘導(dǎo)的腸道內(nèi)多種抗菌蛋白的表達(dá)雖然不會影響非傷寒沙門菌對鐵、鋅等營養(yǎng)物質(zhì)的獲取，但可以增加非傷寒沙門菌與腸道菌群的競爭優(yōu)勢，使其在逃逸宿主免疫應(yīng)答的同時，更好地在宿主體內(nèi)復(fù)制與定植。

2.2 IL-4

IL-4由Th2細(xì)胞分泌，可以刺激B細(xì)胞活化和T細(xì)胞增殖，在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用[31]。依據(jù)所分泌的細(xì)胞因子和生物學(xué)功能，將Th細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等[32]。研究發(fā)現(xiàn)，采用腹腔注射氫化可的松造成小鼠免疫抑制后再接種鼠傷寒沙門菌，小鼠體內(nèi)IL-4高表達(dá)，同時引起過度的Th2型應(yīng)答，不利于宿主清除細(xì)菌[33]。同時也有研究表明，與野生型小鼠對比，IL-4敲除小鼠對鼠傷寒沙門菌的易感性顯著下降，且無明顯的肝臟損傷[34]。綜上所述，IL-4的產(chǎn)生不利于宿主清除沙門菌。

3 mTOR信號通路介導(dǎo)沙門菌逃逸天然免疫應(yīng)答機(jī)制

mTOR是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在哺乳動物中mTOR與不同的蛋白相結(jié)合，會形成兩種復(fù)合物，分別為mTOR復(fù)合物1(mTOR complex 1，mTORC1)和mTOR復(fù)合物2(mTOR complex 2，mTORC2)[35]。mTORC1可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成翻譯等代謝過程，并在高營養(yǎng)條件下有效抑制細(xì)胞自噬[34]。在天然免疫中，細(xì)胞自噬可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)菌的降解以及樹突細(xì)胞誘導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。細(xì)胞自噬的發(fā)生和發(fā)展受到多種信號分子的調(diào)控，包括磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)和mTOR信號通路等。其中，mTOR信號通路最為重要，屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，能接受來自Akt、腺苷一磷酸(adenosine monophosphate，AMP)等分子的信號傳遞，直接參與細(xì)胞自噬的發(fā)生和發(fā)展[36]。病原菌可以通過激活mTOR途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，如鼠傷寒沙門菌表達(dá)的天冬酰胺酶[37]，可以持續(xù)激活mTOR信號通路從而抑制自噬，降低T細(xì)胞活化能力，逃逸宿主免疫應(yīng)答[38,39]。

此外，在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中，糖代謝的發(fā)生與mTOR激活的缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)相關(guān)[40]。鼠傷寒沙門菌可以通過消耗細(xì)胞內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)mTOR激活的HIF-1α，抑制小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中糖酵解的發(fā)生[41]，巨噬細(xì)胞因無法進(jìn)行糖酵解而死亡，鼠傷寒沙門菌得以逃逸宿主免疫應(yīng)答[42]。

4 結(jié)語

宿主免疫應(yīng)答的激活能夠限制鼠傷寒沙門菌等的增殖和傳播，然而為了在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，該類細(xì)菌也演化出一系列逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的策略，包括逃避TLRs、NLRs和RIPs等受體的識別，促進(jìn)細(xì)胞因子IL-22的分泌以增強(qiáng)沙門菌與腸道菌群的競爭優(yōu)勢，利用IL-4抑制宿主對沙門菌的清除，通過調(diào)控mTOR信號通路逃逸宿主天然免疫應(yīng)答等。因此，更深入地了解沙門菌逃逸宿主天然免疫應(yīng)答的機(jī)制，將有助于指導(dǎo)沙門菌病的預(yù)防和治療。